CN114113626A - 一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，属于检测试剂技术领域，包括捕获微球混合液、检测抗体、SA‑PE、实验缓冲液、洗涤缓冲液和工作液，生产工艺按照制备微球的活化与包被、配制检测抗体、配制SA‑PE、配制实验缓冲液、配制洗涤缓冲液和工作液进行生产，解决了当检测一个样本中的IL‑1β、IL‑2、IL‑4、IL‑6、IL‑10、TNF‑α蛋白时，需要单独的用六种检测试剂分别对IL‑1β、IL‑2、IL‑4、IL‑6、IL‑10、TNF‑α蛋白进行检测的问题，缩短了检测时间，从而提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，属于检测试剂技术领域，本发明是一种可以在一个微孔中，同时测定一个样本中的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α六种细胞因子的检测试剂盒。
背景技术
IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α是人体中常见的细胞因子，然而随着医疗水平的进步，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α都能通过现有的检测试剂进行检测，然后再做进一步的治疗，然而当检测一个样本中的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α时，需要单独的用六种检测试剂分别对IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α进行检测，增加了检测时间，降低了检测效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，它解决了当检测一个样本中的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α时，需要单独的用六种检测试剂分别对IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α进行检测的问题。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，检测试剂盒包括捕获微球混合液、检测抗体、SA-PE、实验缓冲液、洗涤缓冲液和工作液，
(1)捕获微球混合液：悬浮液中包含有可辨识的聚苯乙烯微珠,聚苯乙烯微珠分别包被有如下抗体：抗人IL-1β抗体、抗人IL-2抗体、抗人IL-4抗体、抗人IL-6抗体、抗人IL-10抗体、抗人TNF-α抗体；
(2)检测抗体：原液浓度为0.5mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释62.5倍，使浓度为0.8μg/mL；
(3)SA-PE：原液浓度为1mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释50倍，使浓度为2μg/mL；
(4)工作液：原液浓度为40.6mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释6.7倍，使浓度为0.6mg/mL；
(5)实验缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入50gBSA，1mLTween-20，3mLProclin300和0.5mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤；
(6)洗涤缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入5mL Tween-20，3mL Proclin300和0.3mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤。
作为优选实例，试剂盒的生产工艺主要有以下几步：
①制备活化缓冲液，活化缓冲液主要成分包括：即8.0g/L的NaCl试剂，2.9g/L的Na2HPO4·12H2O试剂，2.4g/L的KCl试剂，2.4g/L的KH2PO4试剂，0.5g/L的Tris试剂，0.5mL/L的Tween20试剂，0.5g/L的SodiumAzide试剂。
②微球的活化与包被，取1mL特定编号微珠加入1.5mL离心管，加入5-50uLEDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50uLSuLfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺),加入10-100ug特定抗体，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。
③制备检测抗体：原液浓度为0.5mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释62.5倍，使浓度为0.8μg/mL。
④制备SA-PE：原液浓度为1mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释50倍，使浓度为2μg/mL。
⑤制备工作液：原液浓度为40.6mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释6.7倍，使浓度为0.6mg/mL。
⑥制备实验缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入50gBSA，1mL Tween-20，3mLProclin300和0.5mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤。
⑦制备洗涤缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入5mL Tween-20，3mLProclin300和0.3mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤。
本发明的有益效果是：本发明包括捕获微球混合液、检测抗体、SA-PE、实验缓冲液、洗涤缓冲液和工作液，生产工艺按照制备活化缓冲液、微球的活化与包被、制备检测抗体、制备SA-PE、制备工作液、制备实验缓冲液和制备洗涤缓冲液进行生产，解决了当检测一个样本中的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α时，需要单独的用六种检测试剂分别对IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α进行检测的问题，缩短了检测时间，从而提高了检测效率。
具体实施方式
为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，检测试剂盒包括捕获微球混合液、检测抗体、SA-PE、实验缓冲液、洗涤缓冲液和工作液，
(1)捕获微球混合液：悬浮液中包含有可辨识的聚苯乙烯微珠,聚苯乙烯微珠分别包被有如下抗体：抗人IL-1β抗体、抗人IL-2抗体、抗人IL-4抗体、抗人IL-6抗体、抗人IL-10抗体、抗人TNF-α抗体；
(2)检测抗体：原液浓度为0.5mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释62.5倍，使浓度为0.8μg/mL；
(3)SA-PE：原液浓度为1mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释50倍，使浓度为2μg/mL；
(4)工作液：原液浓度为40.6mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释6.7倍，使浓度为0.6mg/mL；
(5)实验缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入50gBSA，1mL Tween-20，3mLProclin300和0.5mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤；
(6)洗涤缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入5mL Tween-20，3mL Proclin300和0.3mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤。
试剂盒的生产工艺主要有以下几步：
①制备活化缓冲液，活化缓冲液主要成分包括：即8.0g/L的NaCl试剂，2.9g/L的Na2HPO4·12H2O试剂，2.4g/L的KCl试剂，2.4g/L的KH2PO4试剂，0.5g/L的Tris试剂，0.5mL/L的Tween20试剂，0.5g/L的SodiumAzide试剂；
②微球的活化与包被，取1mL特定编号微珠加入1.5mL离心管，加入5-50uLEDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50uLSuLfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺),加入10-100ug特定抗体，涡旋混匀30秒，超声混匀30秒，2-8℃摇匀过夜。
生产检测试剂盒时，需要同时放置6种抗体瓶子的摇床，分别包被不同编号的微球，步骤如下：
1)洗涤：使用抽滤洗涤，经洗涤后的微珠转移至活化缓冲液；
2)质控：通过使用质控盘来验证质量；
3)将多种已包被微珠混合，用少量活化缓冲液洗下瓶壁残留微珠，并混合，最后用活化缓冲液定容，检验合格后分装。
③制备检测抗体：原液浓度为0.5mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释62.5倍，使浓度为0.8μg/mL。
④制备SA-PE：原液浓度为1mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释50倍，使浓度为2μg/mL。
⑤制备工作液：原液浓度为40.6mg/mL的情况下用蛋白稳定液稀释6.7倍，使浓度为0.6mg/mL。
⑥制备实验缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入50gBSA，1mL Tween-20，3mLProclin300和0.5mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤。
⑦制备洗涤缓冲液：在1000mL的磷酸缓冲液中加入5mL Tween-20，3mLProclin300和0.3mL RPE2520，搅拌30min分钟以上，待溶液澄清无杂质后，进行至少0.45μm的除菌过滤。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：(1)分别装有捕获微球混合液、检测抗体、SA-PE、实验缓冲液、洗涤缓冲液和工作液的多个密封试剂瓶，(2)分隔并集中包装这些试剂瓶的试剂盒；微珠是大小均匀的聚苯乙烯微球，用不同的荧光染料对聚苯乙烯微球进行染色并编号，从而获得不同编码的微珠；所述捕获微球混合液中包含各蛋白检测微珠，具体为：
所述检测微珠是在不同编码的微珠表面分别包被抗人IL-1β抗体、抗人IL-2抗体、抗人IL-4抗体、抗人IL-6抗体、抗人IL-10抗体、抗人TNF-α抗体。
2.如权利要求1所述的一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，其特征在于，所述微珠的直径为5-7微米。
3.如权利要求1所述的一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记物是藻红蛋白标记的链霉亲和素。
4.如权利要求1所述的一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，其特征在于，所述捕获微球混合液的制备方法，包括如下步骤：使用不同编码的微珠分别包被不同的细胞因子抗体，混合制成检测微珠，得到所述捕获微球混合液。
5.如权利要求1所述的一种基于磁微粒发光法的细胞因子检测试剂盒，其特征在于，所述检测微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，按照每毫升微珠中包含10-100ug抗体的比例加入任意一种细胞因子抗体，充分混合，包被不同细胞因子抗体，需要使用不同编码的微珠；所述微珠活化液是将1000单位体积微珠加入反应管，加入5-50单位体积1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和5-50单位体积N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化而成。
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