CN114113051B - 一种psma电致化学发光传感器的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种PSMA电致化学发光传感器的制备方法及应用，制备方法通过于ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体制备PSMA电致化学发光传感器，在***特异性膜抗原检测中的应用时在其表面修饰***膜抗原一抗(PSMA‑Ab1)，然后负载分析物PSMA，最后修饰***膜抗原二抗(PSMA‑Ab2)，利用光电信号转换实现对PSMA的超灵敏检测。本发明不同于传统的PSMA检测方法，该方法操作简便，响应速度快，成本低，且检测过程中不含发光试剂，减少了信号干扰，检测灵敏度高，在***癌临床诊疗方面有巨大的应用潜力。

Description

一种PSMA电致化学发光传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及PSMA检测技术领域，具体的是一种PSMA电致化学发光传感器的制备方法及应用。
背景技术
***癌是男性常见恶性肿瘤，占男性癌症相关死亡原因的第二位。***癌一旦发展到晚期，5年生存率只有30％左右，且***癌根治手术后易发生生化复发和骨转移、***转移等，一旦发生复发与转移，传统的放疗和化疗效果非常有限，对生化复发的***癌病变部位进行定位是临床治疗***癌的主要挑战，确定肿瘤的原位以及是否转移是进一步治疗的基础。***特异性膜抗原(Prostate Specific Membrane Antigen,PSMA)是一种II型跨膜糖蛋白，与***特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)不一样的是，PSMA特异性表达于***上皮细胞表面，其表达强度在***癌细胞明显升高，特别是晚期***癌及转移性***癌中，PSMA升高尤为明显，这使得它成为***癌生化复发后癌细胞组织定位、临床诊断与辅助治疗的一个重要靶分子。PSMA在健康组织中几乎无表达，其表达水平与疾病进展存在明显相关性，实现对PSMA的超灵敏检测对于***癌临床分期、预后以及生化复发靶向治疗至关重要。
电致化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)是一种灵敏度高、响应快、操作简便且成本低的检测技术，已被广泛应用于生物分析、食品安全、环境监测与水污染检测等各种分析领域。电致化学发光和酶联免疫双抗体夹心法联合检测是一种常见的分析手段，这种方法使用了两种抗体来检测抗原，灵敏度高、特异性强。目前，绝大多数ECL传感器的构建需要发光试剂的加入，比如钌联吡啶、量子点与鲁米诺等，这些试剂的存在增加了检测体系的生物毒性，带来信号干扰。因此，亟需研发一种生物相容性好且自发光的电极基底可以解决这一问题。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于提供一种PSMA电致化学发光传感器的制备方法及应用，通过在ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石作为基底，结合生物修饰，利用光电信号转换实现对PSMA的超灵敏检测。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种PSMA电致化学发光传感器的制备方法，于ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体制备PSMA电致化学发光传感器，具体包括以下步骤：
(1)将ITO导电玻璃清洗干净后晾干，将直径为260-280nm的聚苯乙烯微球加入去离子水中，搅拌均匀后超声25-35min，得到度为0.05-0.15wt％的聚苯乙烯微球分散液；
(2)将ITO导电玻璃竖直立靠于沉积装置，非导电面朝向装置内壁，置于鼓风干燥箱中，温度设定在50-60℃，垂直沉积18-24h左右，待溶液完全蒸发，得到聚苯乙烯微球模板；
(3)在反应器中加入乙醇、二乙醇胺和异丙醇钛，室温下搅拌反应20-24h，待反应完成后，将混合物静置老化得到二氧化钛溶胶；
(4)将制备的二氧化钛溶胶滴涂在经步骤(2)制备的聚苯乙烯微球模板上，在表面形成一层薄膜，马弗炉400-600℃煅烧2-4h，得ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体电极。
一种PSMA电致化学发光传感器在***特异性膜抗原检测中的应用，包括以下步骤：
S1、氧化钛反蛋白石电极在1M氢氧化钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水清洗干净并晾干，再用乙醇配制0.5wt％的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡电极18h，取出后先用乙醇清洗后再用去离子水清洗晾干，配制1％戊二醛水溶液，浸泡电极2h；
S2、将经步骤S1处理的电极取出并用去离子水清洗，用0.01-0.02M PBS配制PSMA-Ab1溶液，然后在电极上孵育1-3h；
S3、将经步骤S2处理的电极取出后用去离子水清洗，放入电解液中检测信号，清洗干净晾干，用0.01-0.02M PBS配制PSMA溶液，然后在电极上孵育2h；
S4、将经步骤S3处理的电极取出，用去离子水清洗，用0.01-0.02M PBS配制PSMA-Ab2溶液，然后在电极上孵育1-3h，用去离子水清洗干净，放入电解液中检测信号。
进一步优选地，步骤S1中氧化钛反蛋白石电极规格为5mm*25mm的小电极。
进一步优选地，电解液成分包含15mM K2S2O8、0.01M PBS和1mM H2O2。
进一步优选地，步骤S3、S4中信号检测时设置光电倍增管电压为600V。
进一步优选地，生物修饰选用0.5-1.5μg/ml PSMA-Ab1和0.5-1.5μg/ml PSMA-Ab2，PSMA溶液浓度为2-12pg/ml。
本发明的有益效果：
本发明以二氧化钛反蛋白石光子晶体为基底，在其表面修饰***膜抗原一抗(PSMA-Ab1)，然后负载分析物PSMA，最后修饰***膜抗原二抗(PSMA-Ab2)，由于PSMA-Ab2连接辣根过氧化物酶(HRP)，在检测液中存在过氧化氢时，HRP促使过氧化氢分解，提升电信号。该传感器响应速度快，检测效率高，可实现对PSMA的快速精准响应。不同于传统的PSMA检测方法，该方法操作简便，响应速度快，成本低，且检测过程中不含发光试剂，减少了信号干扰，检测灵敏度高。同时在一定范围内PSMA的浓度与电致化学发光信号呈现良好的线性关系。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明制备的新型***癌特异性膜抗原超灵敏电致化学发光传感器的检测过程示意图；
图2为实施例中ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体的扫描电镜图像；
图3为本发明制备的新型***癌特异性膜抗原超灵敏电致化学发光传感器对于不同浓度PSMA响应的电致化学发光信号图；
图4为本发明制备的ECL传感器发光强度比值与PSMA浓度的线性拟合函数图。
图5为本发明制备的ECL传感器改变PSMA-Ab2浓度发光强度比值与PSMA浓度的函数图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“开孔”、“上”、“下”、“厚度”、“顶”、“中”、“长度”、“内”、“四周”等指示方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的组件或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
如图1-2所示，本发明以二氧化钛反蛋白石光子晶体为基底，在其表面修饰***膜抗原一抗(PSMA-Ab1)，然后负载分析物PSMA，最后修饰***膜抗原二抗(PSMA-Ab2)。
实施例1
取一个10ml的烧杯，将直径为270nm的聚苯乙烯微球配成3ml的0.1％浓度溶液，搅拌均匀后超声30min，得到聚苯乙烯微球分散液。将清洗干净的ITO电极竖直立靠于烧杯壁，非导电面朝向杯壁，溶液在导电面会形成凹液面，用玻璃罩盖住，并在罩内放置一瓶纯水，用于调控聚苯乙烯微球溶液挥发速度，从而控制电极表面修饰胶体晶体的形貌。将烧杯置于鼓风干燥箱中，温度设定在53℃，垂直沉积20h，待溶液完全蒸发，将温度设为65℃，老化半小时后取出。
取35ml乙醇、1.1ml二乙醇胺置于三口圆底烧瓶中，低速搅拌均匀。缓慢加入5.2ml异丙醇钛，剧烈搅拌22h，转速设为380r/min，得到二氧化钛胶体溶液，将制备的二氧化钛溶胶与乙醇1:1配制得到稀溶液，将聚苯乙烯微球模板垂直浸入二氧化钛溶液中，立刻取出，水平静置1h。马弗炉升温至500℃，然后在500℃下保持3h，得到ITO表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体电极。如图1所示即为二氧化钛反蛋白石光子晶体的扫描电镜图像。
实施例2
取一个10ml的烧杯，将直径为260nm的聚苯乙烯微球配成3ml的0.15％浓度溶液，搅拌均匀后超声25min，得到聚苯乙烯微球分散液。将清洗干净的ITO电极竖直立靠于烧杯壁，非导电面朝向杯壁，溶液在导电面会形成凹液面，用玻璃罩盖住，并在罩内放置一瓶纯水，用于调控聚苯乙烯微球溶液挥发速度，从而控制电极表面修饰胶体晶体的形貌。将烧杯置于鼓风干燥箱中，温度设定在55℃，垂直沉积24h，待溶液完全蒸发，将温度设为65℃，老化半小时后取出。
取35ml乙醇、1.1ml二乙醇胺置于三口圆底烧瓶中，低速搅拌均匀。缓慢加入5.2ml异丙醇钛，剧烈搅拌24h，转速设为380r/min，得到二氧化钛胶体溶液，将制备的二氧化钛溶胶与乙醇1:1配制得到稀溶液，将聚苯乙烯微球模板垂直浸入二氧化钛溶液中，立刻取出，水平静置1h。马弗炉升温至400℃，然后在400℃下保持4h，得到ITO表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体电极。
将制备得到的二氧化钛反蛋白石光子晶体电极切成5mm*25mm的电极，先用1MNaOH溶液浸泡电极2h，用0.5％APTES(乙醇)浸泡18h，1％戊二醛浸泡2h，进行前处理。然后进行生物修饰，先用1μg/ml PSMA-Ab1(0.01M PBS)修饰电极，浸泡2h，清洗干净后检测其信号。用2-12pg/ml PSMA溶液、1μg/ml PSMA-Ab2继续分别孵育2h，再检测其信号。
图3显示了ECL传感器在孵育PSMA-Ab1后的初始信号值，以及在孵育一定浓度范围内的PSMA和PSMA-Ab2后的信号值，对前后信号值进行比较。
ECL传感器发光强度比值与PSMA浓度的线性拟合函数图如图4所示，可以看出PSMA的浓度与电致化学发光信号呈现良好的线性关系。
实施例3
取一个10ml的烧杯，将直径为260nm的聚苯乙烯微球配成3ml的0.05％浓度溶液，搅拌均匀后超声25min，得到聚苯乙烯微球分散液。将清洗干净的ITO电极竖直立靠于烧杯壁，非导电面朝向杯壁，溶液在导电面会形成凹液面，用玻璃罩盖住，并在罩内放置一瓶纯水，用于调控聚苯乙烯微球溶液挥发速度，从而控制电极表面修饰胶体晶体的形貌。将烧杯置于鼓风干燥箱中，温度设定在50℃，垂直沉积20h，待溶液完全蒸发，将温度设为65℃，老化半小时后取出。
取35ml乙醇、1.1ml二乙醇胺置于三口圆底烧瓶中，低速搅拌均匀。缓慢加入5.2ml异丙醇钛，剧烈搅拌20h，转速设为380r/min，得到二氧化钛胶体溶液，将制备的二氧化钛溶胶与乙醇1:1配制得到稀溶液，将聚苯乙烯微球模板垂直浸入二氧化钛溶液中，立刻取出，水平静置1h。马弗炉升温至600℃，然后在600℃下保持2h，得到ITO表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体电极。
将制备得到的二氧化钛反蛋白石光子晶体电极切成5mm*25mm的电极，先用1MNaOH溶液浸泡电极2h，用0.5％APTES(乙醇)浸泡18h，1％戊二醛浸泡2h，进行前处理。然后进行生物修饰，先用1μg/ml PSMA-Ab1(0.01M PBS)修饰电极，浸泡2h，清洗干净后检测其信号。用2-12pg/ml PSMA溶液、0.5μg/ml PSMA-Ab2继续分别孵育2h，再检测其信号。
ECL传感器改变PSMA-Ab2浓度后发光强度比值与PSMA浓度关系如图5所示，信号强度明显减弱，也能够灵敏检测PSMA。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种PSMA电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体制备PSMA电致化学发光传感器，具体包括以下步骤：
(1)将ITO导电玻璃清洗干净后晾干，将直径为260-280nm的聚苯乙烯微球加入去离子水中，搅拌均匀后超声25-35min，得到浓度为0.05-0.15wt％的聚苯乙烯微球分散液；
(2)将ITO导电玻璃竖直立靠于沉积装置，非导电面朝向装置内壁，置于鼓风干燥箱中，温度设定在50-60℃，垂直沉积18-24h左右，待溶液完全蒸发，将温度设为65℃，老化半小时后取出，得到聚苯乙烯微球模板；
(3)在反应器中加入乙醇、二乙醇胺和异丙醇钛，室温下搅拌反应20-24h，待反应完成后，将混合物静置老化得到二氧化钛溶胶；
(4)将制备的二氧化钛溶胶与乙醇配制得到稀溶液，将步骤(2)制备的聚苯乙烯微球模板垂直浸入二氧化钛溶液中，立刻取出，水平静置1h，在表面形成一层薄膜，马弗炉400-600℃煅烧2-4h，得到ITO导电玻璃表面修饰二氧化钛反蛋白石光子晶体电极。
2.一种PSMA电致化学发光传感器在***特异性膜抗原检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、氧化钛反蛋白石电极在1mol/L氢氧化钠溶液中浸泡2h，取出后用去离子水清洗干净并晾干，再用乙醇配制0.5wt％的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液浸泡电极18h，取出后先用乙醇清洗后再用去离子水清洗晾干，配制1％戊二醛水溶液，浸泡电极2h；
S2、将经步骤S1处理的电极取出并用去离子水清洗，用0.01-0.02mol/LPBS配制PSMA-Ab1溶液，然后在电极上孵育1-3h；
S3、将经步骤S2处理的电极取出后用去离子水清洗，放入电解液中检测信号，清洗干净晾干，用0.01-0.02mol/LPBS配制PSMA溶液，然后在电极上孵育2h；
S4、将经步骤S3处理的电极取出，用去离子水清洗，用0.01-0.02mol/LPBS配制PSMA-Ab2溶液，然后在电极上孵育1-3h，用去离子水清洗干净，放入电解液中检测信号。
3.根据权利要求2所述PSMA电致化学发光传感器在***特异性膜抗原检测中的应用，其特征在于，所述步骤S1中氧化钛反蛋白石电极规格为5mm*25mm的小电极。
4.根据权利要求2所述PSMA电致化学发光传感器在***特异性膜抗原检测中的应用，其特征在于，所述电解液成分包含15mmol/LK2S2O8、0.01mol/LPBS和1mmol/LH2O2。
5.根据权利要求2所述PSMA电致化学发光传感器在***特异性膜抗原检测中的应用，其特征在于，所述步骤S3、S4中信号检测时设置光电倍增管电压为600V。
6.根据权利要求2所述PSMA电致化学发光传感器在***特异性膜抗原检测中的应用，其特征在于，生物修饰选用0.5-1.5μg/mlPSMA-Ab1和0.5-1.5μg/mlPSMA-Ab2，PSMA溶液浓度为2-12pg/ml。
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