CN107177553B - 一种用于捕获癌细胞的纳米锥结构复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于捕获癌细胞的纳米锥结构复合材料及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医用生物材料的技术领域，公开了一种用于捕获癌细胞的纳米锥结构复合材料及其制备方法与应用。所述方法：首先采用计时电流法在导电基材表面电沉积氯掺杂的聚吡咯；再采用计时电位法，选用三电极模式，导电金属为对电极、沉积有聚吡咯的导电基材为工作电极，电解质为包含吡咯和生物素的缓冲溶液，纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料沉积在工作电极上；最后将沉积有纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料的工作电极进行活化处理，置于链霉亲和素溶液中培养，再与抗体进行接枝反应，于BSA溶液中培养，得到纳米锥结构复合材料。所述方法简单，成本较低；所述复合材料中纳米锥结构稳定，能够较好的捕获癌细胞和无损释放癌细胞。

Description

一种用于捕获癌细胞的纳米锥结构复合材料及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于医用生物材料的技术领域，涉及一种纳米锥结构复合材料及其制备方法，所述纳米锥结构复合材料用于快速捕获癌细胞并且无损释放细胞。
背景技术
癌细胞分离在基础生物学、临床诊断的发展和治疗方式研究方面具有很重要的意义。目前一种依赖于抗体抗原特异性结合，通过识别目标细胞膜表面的标记物分离提纯癌细胞的技术得以发展。和传统的台式方法相比，目前的基于平台技术具有增强细胞复苏和提高目标细胞的纯度和捕获量优势。虽然曾经的研究集中于增强捕获率和敏感度，但是无损释放细胞和快速捕获细胞方面还比较缺乏。
在癌细胞捕获中，纳米结构的材料具有非常好的性能和效果。已有研究者采用AAO模板法制备了用于癌细胞捕获释放的材料，但是该方法涉及的去除模板的过程是通过碱刻蚀来实现的，对材料表面的生物分子的活性有影响，同时过程比较复杂，制备的纳米锥结构容易倒伏。
本发明利用聚吡咯的可逆掺杂特性和电活性，通过掺杂剂构建一种生物素掺杂的导电聚吡咯平台，用于捕获EpCAM阳性的癌细胞并且无损释放。掺杂剂可以调控导电高分子的微结构，为方便快捷环保地制备各种纳米结构提供可能。本发明采用电化学无模板法构建纳米锥结构复合材料过程简单，无污染，材料稳定好，捕获率高，对癌细胞无损释放，解决了现有技术存在的缺陷和不足。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种纳米锥结构复合材料的制备方法即基于导电基底的导电聚吡咯/生物素纳米锥结构复合材料的制备方法。本发明通过电化学方法将生物素掺杂于聚吡咯，制备的复合材料具有纳米锥结构，再应用生物素－亲合素***(Biotin-Avidin—System，BAS)，将EpCAM抗体接枝在纳米锥结构表面，从而得到用于捕获和释放癌细胞的纳米锥结构复合材料。本发明接枝EpCAM抗体的聚吡咯纳米锥平台对EpCAM抗体阳性细胞，比如人结肠癌HCT-116和人乳腺癌细胞MCF7，具有特异性粘附功能，而对EpCAM抗体阴性细胞，比如***细胞Hela细胞，粘附性较差。
本发明的另一目的在于提供由上述方法得到的纳米锥结构复合材料。
本发明的再一目的在于提供上述纳米锥结构复合材料的应用。所述纳米锥结构复合材料用于捕获和无损释放癌细胞，所述癌细胞优选为EpCAM抗体阳性细胞。
为了达到发明的目的，本发明采用的技术方案是：
一种纳米锥结构复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)导电基材表面电沉积氯掺杂的聚吡咯
选用三电极模式，导电金属为对电极，导电基材为工作电极，电解质溶液为包含吡咯和氯离子的溶液，采用计时电流法控制电化学反应，氯掺杂的聚吡咯沉积在导电基材表面；
(2)工作电极表面沉积纳米锥结构聚吡咯/生物素材料
选用三电极模式，导电金属为对电极、步骤(1)制备的沉积有氯掺杂的聚吡咯的导电基材为工作电极，电解质为包含吡咯和生物素的缓冲溶液，采用计时电位法控制电化学反应，纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料沉积在工作电极上；
(3)EpCAM抗体接枝
将步骤(2)中沉积有纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料的工作电极置于EDC和NHS的水溶液中进行活化处理，然后置于链霉亲和素溶液中进行培养，再与生物素改性的EpCAM抗体进行接枝反应，于BSA溶液中培养一段时间，得到接枝EpCAM抗体的纳米锥结构复合材料。
步骤(1)所述氯离子的源为盐酸或氯化钾，优选盐酸。
步骤(1)和(2)中所述导电金属为铂电极或铜电极，优选为铜电极。
步骤(1)中所述电解质溶液中氯离子的浓度为0.1～0.3mol/L，吡咯的浓度为0.1～0.3mol/L；
步骤(1)中所述电化学反应的时间为10～50s。
步骤(1)中所述电化学反应的电压为0.7～1.2V，优选为0.8V；所述导电基材为钛、导电玻璃等。
步骤(1)中所述氯离子最佳浓度是0.25mol/L，吡咯的最佳浓度是0.2mol/L，最佳反应时间是20秒。
步骤(2)中所述缓冲溶液的pH为6.8～7.2，步骤(2)中所述电化学反应的电流为0.5～2.0mA/cm2；
步骤(2)中所述电化学反应的时间为10～50min。
步骤(2)中所述吡咯的浓度为0.1～0.3mol/L，生物素的浓度为0.05～0.2mol/L.
步骤(2)中所述吡咯的最佳浓度是0.2mol/L，生物素的最佳浓度是0.1mol/L，最佳反应时间是40min。
步骤(3)中所述EDC和NHS的水溶液中EDC的浓度为0.005～0.015g/mL和NHS的浓度为0.005-0.015g/mL；所述活化处理的温度为常温，活化处理的时间为30～60min；所述生物素改性的EpCAM抗体：购自公司：R&D Systems，产品名称：人类EpCAM/TROP-1生物素抗体(Human EpCAM/TROP-1Biotinylated Antibody)；所述接枝反应的时间10～20h，所述接枝反应的温度为4～8℃；所述链霉亲和素水溶液的浓度为15～40μg/mL，所述培养的时间为40～60min；所述BSA溶液的质量浓度为0.5％～1.5％，所述一段时间为40～60min。
所述纳米锥结构复合材料通过上述方法制备得到。所述纳米锥结构复合材料包括导电基材，聚吡咯、生物素以及抗体。
所述纳米锥结构复合材料用于特异性捕获癌细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
(1)本发明以导电基材为基底，采用无污染快捷可控的电化学方法构建了导电聚吡咯/生物素的纳米锥结构，实现生物素掺杂于聚吡咯；
(2)电化学无模板法构建的以导电基材为基底的纳米锥结构聚吡咯/生物素复合材料方法简单，成本较低，可以大面积制备和生产；本申请制备的复合材料中纳米锥结构稳定；
(3)本发明的纳米锥结构复合材料(在以导电基材为基底的导电聚吡咯/生物素纳米锥表面接枝EpCAM抗体)，特异性捕获癌细胞并且无损释放细胞。
附图说明
图1为实施例1制备的纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)的SEM图；
图2为实施例1制备的纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)的循环伏安曲线；
图3为实施例5制备的纳米锥结构复合材料(接枝抗体)用于异性捕获癌细胞的激光共聚焦显微镜图；其中，a1，a2对应HCT116细胞，b1，b2对应MCF7细胞，c1，c2对应HeLa细胞，a1与a2、b1与b2、c1与c2分别是不同的放大倍数；
图4为实施例5制备的纳米锥结构复合材料(EpCAM抗体功能化)捕获MCF7癌细胞(a)以及在弱电势刺激短时间刺激下MCF7癌细胞释放(b)的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)片状导电基材钛规格为10×10×1mm3，分别用去离子水、99.7％无水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分钟；
(2)选用三电极模式，导电基材为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L，盐酸的浓度为0.25mol/L，采用计时电流法控制电化学反应，反应电位(相对于参比电极)为0.8V，反应时间为20秒，钛电极上沉积一层致密均匀黑色的聚吡咯，将其浸泡在去离子水中以除去表面没有反应的吡咯和盐酸，得到沉积有聚吡咯的钛电极；
(3)选用三电极模式，沉积有聚吡咯的钛电极为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液为吡咯和生物素的缓冲溶液(溶液的pH为6.8，PBS)，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L和生物素的浓度为0.1mol/L，采用计时电位法控制电化学反应，反应电流为1.5mA，反应时间为40分钟，纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合物沉积在工作电极表面，得到纳米结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)即沉积有纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料的工作电极。
本实施例的纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)的SEM图如图1所示。从图1中可知，钛电极表面沉积了高密度的纳米锥结构，且垂直于表面生长；纳米锥结构顶端外径75nm，垂直高度500nm。
本实施例的纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)的循环伏安曲线如图2所示。测试条件为以PBS为电解质，实施例1制备的纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合材料(即沉积有纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料的工作电极)为工作电极，电化学工作站记录循环伏安曲线，扫描速率25mV/s，扫描10个循环。结果显示纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合材料具有较好的氧化还原特性。
实施例2
(1)片状导电基材(导电玻璃)规格为10×10×1mm3，分别用去离子水、99.7％无水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分钟；
(2)选用三电极模式，导电基材为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L，盐酸的浓度为0.25mol/L，采用计时电流法控制电化学反应，反应电位(相对于参比电极)为0.8V，反应时间为20秒，导电玻璃电极上沉积一层致密均匀黑色的聚吡咯，将其浸泡在去离子水中以除去表面没有反应的吡咯和盐酸，得到沉积有聚吡咯的导电玻璃电极；
(3)选用三电极模式，沉积有聚吡咯的导电玻璃电极为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液为吡咯和生物素的缓冲溶液(溶液的pH为7.2，PBS)，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L和生物素的浓度为0.05mol/L，采用计时电位法控制电化学反应，反应电流为1.5mA，反应时间为40分钟，纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合物沉积在工作电极表面，即得到纳米结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)。本实施例制备的复合材料结构与实施例1相似，电化学性能也与实施例1相似。
实施例3
(1)片状导电基材钛规格为10×10×1mm3，分别用去离子水、99.7％无水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分钟；
(2)选用三电极模式，导电基材为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L，盐酸的浓度为0.25mol/L，采用计时电流法控制电化学反应，反应电位(相对于参比电极)为0.8V，反应时间为20秒，钛电极上沉积一层致密均匀黑色的聚吡咯，将其浸泡在去离子水中以除去表面没有反应的吡咯和盐酸，得到沉积有聚吡咯的钛电极；
(3)选用三电极模式，沉积有聚吡咯的钛电极为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液为吡咯和生物素的缓冲溶液(溶液的pH为6.8，PBS)，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L和生物素的浓度为0.1mol/L，采用计时电位法控制电化学反应，反应电流为0.9mA，反应时间为40分钟，纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合物沉积在工作电极表面，即得到纳米结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)。本实施例制备的复合材料结构与实施例1相似，电化学性能也与实施例1相似。
实施例4
(1)片状导电基材钛规格为10×10×1mm3，分别用去离子水、99.7％无水乙醇和99.5％丙酮超清洗基材各20分钟；
(2)选用三电极模式，导电基材为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L，氯化钾的浓度为0.2mol/L，采用计时电流法控制电化学反应，反应电位(相对于参比电极)为0.8V，反应时间为20秒，钛电极上沉积一层致密均匀黑色的聚吡咯，将其浸泡在去离子水中以除去表面没有反应的吡咯和氯化钾，得到沉积有聚吡咯的钛电极；
(3)选用三电极模式，沉积有聚吡咯的钛电极为工作电极，铜片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，电解质溶液为吡咯和生物素的缓冲溶液(溶液的pH为6.8，PBS)，电解质溶液中吡咯的浓度为0.2mol/L和生物素的浓度为0.1mol/L，采用计时电位法控制电化学反应，反应电流为2.0mA，反应时间为40分钟，纳米锥结构的聚吡咯/生物素复合物沉积在工作电极表面，即得到纳米结构的聚吡咯/生物素复合材料(未接枝抗体)。本实施例制备的复合材料结构与实施例1相似，电化学性能也与实施例1相似。
实施例5
将实施例1制备的沉积有纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料的工作电极浸泡在10mL的EDC(0.095g)和NHS(0.061g)水溶液中，常温下活化处理45分钟，用超纯水冲洗3次，工作电极上的纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料被活化，将工作电极浸泡在50μL的链霉亲和素(20μg/mL)水溶液中培养1小时(常温)，取出用超纯水冲洗3次；再浸泡在生物素改性的EpCAM抗体(人类EpCAM/TROP-1生物素抗体，R&D Systems公司)溶液(10μg/mL，1倍PBS为溶剂(1倍PBS是指基于细胞培养中使用的浓度))中，在4℃环境中培养12小时，用PBS溶液(细胞培养中使用的标准PBS)清洗3次之后，浸泡于BSA蛋白质溶液(1wt％，1倍PBS为溶剂)中室温培养1小时，减少非特异性结合，最后用PBS洗三次，得到纳米锥结构复合材料。
将实施例5制备的纳米锥结构复合材料进行癌细胞捕获和释放的效果测试：
(A)将实施例5制备的纳米锥结构复合材料用于异性捕获癌细胞，结果(激光共聚焦显微镜图)如图3所示；其中，a1、a2对应HCT116细胞，b1、b2对应MCF7细胞，c1、c2对应HeLa细胞；a1与a2、b1与b2、c1与c2分别是不同的放大倍数。
HCT116和MCF7分别是人结肠癌细胞和人乳腺癌细胞，能特异性识别EpCAM抗体；Hela细胞是***细胞，不能特异性识别EpCAM抗体。将纳米锥结构复合材料和浓度为2×105/mL的癌细胞共培养15分钟之后，HCT116细胞(图3(a))和MCF7细胞(图3(b))在材料表面大量粘附，HCT116细胞在材料表面的细胞密度为260±25/mm2，MCF7细胞在材料表面的细胞密度为252±18/mm2。相反的，Hela细胞(图3(c))在短时间内很难粘附在EpCAM抗体功能化的聚吡咯纳米锥结构表面，在材料表面的细胞密度只有41±9/mm2。
(B)将实施例5制备的纳米锥结构复合材料对癌细胞释放的测试
培养人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MCF7和***细胞Hela，细胞的培养基为体积分数为10％的胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基。将HCT-116、MCF-7和Hela细胞培养在37℃，5％CO2的恒温培养箱中，根据溶液状况，保持2天换一次培养基。当细胞铺展密度达到70-80％时，对细胞进行传代或者接种于材料表面，细胞接种密度是2×105个/mL。为了接种细胞，将样品紧贴于穿孔的48孔板底部。每个孔洞设计为三电极电解池，纳米锥结构复合材料作为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极。对于接种的细胞进行Actin骨架染色，然后再采用激光共聚焦观察。实施例5制备的纳米锥结构复合材料(EpCAM抗体功能化)捕获MCF7癌细胞的激光共聚焦显微镜图如图4(a)所示。
采用电化学工作站在培养细胞的电解池施加电压。电压大小为0.8V，电刺激时间为15秒。在弱电势刺激短时间刺激下MCF7癌细胞释放的激光共聚焦显微镜图如图4(b)所示。从(a)和(b)的对比中可以看出，纳米锥结构复合材料捕获细胞之后，在弱电势刺激短时间刺激下，材料表面的MCF7癌细胞基本被释放。

Claims (5)

1.一种纳米锥结构复合材料用于捕获和无损释放癌细胞的用途，其特征在于：所述纳米锥结构复合材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）导电基材表面电沉积氯掺杂的聚吡咯
选用三电极模式，导电金属为对电极，导电基材为工作电极，电解质溶液为包含吡咯和氯离子的溶液，采用计时电流法控制电化学反应，氯掺杂的聚吡咯沉积在导电基材表面；
（2）工作电极表面沉积纳米锥结构聚吡咯/生物素材料
选用三电极模式，导电金属为对电极、步骤（1）制备的沉积有氯掺杂的聚吡咯的导电基材为工作电极，电解质为包含吡咯和生物素的缓冲溶液，采用计时电位法控制电化学反应，纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料沉积在工作电极上；
（3）EpCAM抗体接枝
将步骤（2）中沉积有纳米锥结构的聚吡咯/生物素材料的工作电极置于EDC和NHS的水溶液中进行活化处理，然后置于链霉亲和素溶液中进行培养，再与生物素改性的EpCAM抗体进行接枝反应，于BSA溶液中培养一段时间，得到接枝EpCAM抗体的纳米锥结构复合材料；
步骤（2）中所述缓冲溶液的pH为6.8~7.2，步骤（2）中所述电化学反应的电流为0.5～2.0mA/cm2；
步骤（2）中所述吡咯的浓度为0.1～0.3 mol/L，生物素的浓度为0.05～0.2 mol/L；
步骤（1）中所述电化学反应的时间为10～50s；
步骤（1）中所述电化学反应的电压为0.7～1.2V；步骤（2）中所述电化学反应的时间为10～50min；
步骤（1）中所述电解质溶液中氯离子的浓度为0.1～0.3 mol/L，吡咯的浓度为0.1～0.3 mol/L。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）所述氯离子的源为盐酸或氯化钾；
步骤（1）和（2）中所述导电金属为铂电极或铜电极。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤（1）所述氯离子的源为盐酸；
步骤（1）和（2）中所述导电金属为铜电极。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中所述接枝反应的时间10~20h，所述接枝反应的温度为4～8℃；所述活化处理的温度为常温，活化处理的时间为30~60min；所述培养的时间为40~60min；所述一段时间为40～60min。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中所述EDC和NHS的水溶液中EDC的浓度为0.005～0.015g/mL和NHS的浓度为0.005-0.015g/mL；所述链霉亲和素水溶液的浓度为15～40 μg /mL，所述BSA溶液的质量浓度为0.5%～1.5%。
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