CN112898407B - 重组驼源血清白蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组驼源血清白蛋白的制备方法，包括质粒构建、转化并表达、包涵体复性、以及纯化。本发明采用以大肠杆菌为基础的原核表达***，通过质粒构建、转化并表达、包涵体复性、纯化的主要步骤，实现采用原核表达***成功表达重组驼源血清白蛋白的目的，所得血清白蛋白水溶性良好，具有纯度高、安全性高、性价比高等优点，有望成为人源血清白蛋白的替代品，以满足患者对血清白蛋白的需求。

Description

重组驼源血清白蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组驼源血清白蛋白的制备方法，采用原核表达***成功表达重组驼源血清白蛋白，涉及质粒构建、蛋白表达、包涵体复性、蛋白纯化技术领域。

背景技术

据申请人了解，人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是血浆中的主要蛋白质，在肝脏中合成，分子量为66.5kDa，由585个氨基酸组成的单链肽形成一个心形三维立体结构。人血清白蛋白的主要功能是维持血浆胶体渗透压，并在物质运输中扮演重要角色，运输氧气和二氧化碳、代谢产物、营养物质、药物和金属离子等。由于其重要的生理功能，血清白蛋白常被用来治疗急性烧伤损伤、缺血性休克、低蛋白血症、幼红细胞血症、肝硬化等。

近年来，血清白蛋白的应用范围越来越广。一方面，由于血清白蛋白具有良好的水溶性、生物相容性，半衰期长(约200天)，毒性较低；另一方面，血清白蛋白能够通过靶向机制在肿瘤部位富集。通过EPR(enhanced permeability and retention)效应被动靶向肿瘤组织，并且由于肿瘤组织缺乏***，使得血清白蛋白在该部位富集。通过主动靶向效应，血清白蛋白能够和血管内皮细胞表面的白蛋白受体(glycoprotein,gp60)结合，通过胞间运输到肿瘤***位而富集。因此，血清白蛋白作为药物载体，逐渐被用在肿瘤治疗等方面。

据统计，每年血清白蛋白的需求量在500吨左右，目前其主要来源为人血清，但该来源不仅产量低、耗时费力，而且具有较高危险性和致病性，许多强致病性病原如肝炎病毒、艾滋病病毒(HIV)等能通过血液传播，因此，需要开发性价比高的、便捷的血清白蛋白生产技术来满足患者需求。

双峰驼常栖息在草原、荒漠、戈壁等极端环境，其较高血清白蛋白含量以维持基本生理代谢和血液渗透压；另外，双峰驼血清白蛋白与人血清白蛋白同源性较高，结构相似。因此，基于双峰驼的重组血清白蛋白(recombinant camel serum albumin,rCSA)具有性价比高、可大量生产、安全性高等优点，有望成为人血清白蛋白可供选择的替代品。

然而，由于血清白蛋白中富含二硫键，较难在原核表达***中生产，这势必会导致生产成本升高。经检索发现，申请号CN201310078906.0、公布号CN103194482A的发明专利申请公开了一种用于表达人血清白蛋白的质粒和重组菌。然而，其采用的宿主菌为毕赤酵母，属于真核表达***。

亟待研制出能采用原核表达***表达方式的血清白蛋白制备方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有技术存在的问题，提出一种重组驼源血清白蛋白的制备方法，采用原核表达***成功表达重组驼源血清白蛋白。同时，还提出相应的重组驼源血清白蛋白、其编码基因、其质粒、及其工程菌。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种重组驼源血清白蛋白的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、将编码重组驼源血清白蛋白的基因片段先经PCR扩增、再与质粒载体重组构建出重组质粒；所述重组驼源血清白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

第二步、采用以大肠杆菌制出的化学感受态细胞；将重组质粒转化入化学感受态细胞，然后经培养获得单菌落；以单菌落为种子进行液体培养，然后加入诱导剂诱导表达目的蛋白，获得主要以包涵体形式存在的目的蛋白；

第三步、超声破碎菌体后离心收集沉淀；之后对该沉淀先用清洗缓冲液洗涤，再用溶解缓冲液溶解，获得含目的蛋白的溶解液；对该溶解液进行提纯，并获得目的蛋白；采用逐步梯度透析的方式，使该目的蛋白重新折叠成生理状态，即复性；

第四步、对复性后目的蛋白进行精纯，即得重组驼源血清白蛋白。

该方法采用以大肠杆菌为基础的原核表达***，通过质粒构建、转化并表达、包涵体复性、纯化的主要步骤，实现采用原核表达***成功表达重组驼源血清白蛋白的目的，所得血清白蛋白水溶性良好，具有纯度高、安全性高、性价比高等优点，有望成为人源血清白蛋白的替代品，以满足患者对血清白蛋白的需求。

本发明进一步完善的技术方案如下：

优选地，第一步中，所述质粒载体为pSmart-I；重组构建时选择的酶切位点为：BamHI内切酶位点，以及XhoI内切酶位点；

第二步中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌菌株；所述诱导剂为IPTG；

第三步中，用清洗缓冲液洗涤的具体过程为：

先用第一清洗缓冲液重悬沉淀，然后离心收集沉淀，重复预定次数；

再用第二清洗缓冲液重悬沉淀，然后离心收集沉淀，重复预定次数；

所述第一清洗缓冲液为：含5±0.05mM DTT，50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，500±5mM NaCl，1±0.01％Triton X-100，1±0.01mM EDTA的缓冲液；

所述第二清洗缓冲液为：含5±0.05mM DTT，50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，500±5mM NaCl，1±0.01mM EDTA的缓冲液；

用溶解缓冲液溶解的具体过程为：

用溶解缓冲液重悬沉淀，搅拌预定时间后，离心收集上清，即获得含目的蛋白的溶解液；

所述溶解缓冲液为：含50±0.5mM pH 6.0～6.3Tris，8±0.08M尿素，1±0.01mMEDTA，5±0.05mM DTT的缓冲液；

第四步中，采用凝胶尺寸排阻柱精纯复性后目的蛋白。

注：第二步中的IPTG即异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

优选地，第三步中，提纯溶解液获得目的蛋白的具体过程为：

将溶解液先以镍柱亲和层析法粗提纯化目的蛋白，再以SDS-PAGE法鉴定分离并收集含有目的蛋白的条带；

逐步梯度透析的具体过程为：

先依次在缓冲液R1、缓冲液R2、缓冲液R3、缓冲液R4、缓冲液R5中分别透析预定时间，再进行超滤浓缩；

所述缓冲液R1为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，4±0.04mM尿素的缓冲液；

所述缓冲液R2为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，2±0.02mM尿素的缓冲液；

所述缓冲液R3为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，1±0.01mM尿素，600±6mM L-精氨酸的缓冲液；

所述缓冲液R4为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，0.5±0.005mM尿素，600±6mM L-精氨酸的缓冲液；

所述缓冲液R5为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，600±6mM L-精氨酸的缓冲液。

采用以上优选方案，可进一步优化各步骤的关键细节特征，从而更好地成功表达重组驼源血清白蛋白。

更优选地，第一步中，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

第二步中，将重组质粒转化入化学感受态细胞的具体过程为：将预冻的化学感受态细胞、预冻的重组质粒分别置于冰上融化；然后将重组质粒加入化学感受态细胞并混匀；先置冰浴中，再进行热激，然后再置冰浴中静置；加入不含抗生素的LB肉汤培养基进行培养，使菌体复苏；

经培养获得单菌落的具体过程为：采用复苏后的菌体，在含有卡那霉素的LB平板上进行培养，获得白色单菌落；

以单菌落为种子进行液体培养、然后加入诱导剂的具体过程为：挑取单菌落并接种在含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行复苏培养；将复苏后的菌液接种在新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行正式培养，培养至OD₆₀₀达到预设值时，加入诱导剂并进行诱导培养。

更优选地，第二步，在将重组质粒转化入化学感受态细胞的具体过程中：先置冰浴中30min，再42℃热激45s，然后再置冰浴中静置2min；培养条件为37℃，220rpm，培养60min；

在经培养获得单菌落的具体过程中：培养条件为37℃倒置培养16h；

在以单菌落为种子进行液体培养、然后加入诱导剂的具体过程中：复苏培养条件为37℃，220rpm，振荡培养过夜；正式培养条件为37℃，220rpm；加入诱导剂的终浓度为1mM，诱导培养条件为15℃，220rpm，培养16h。

更优选地，第三步中，超声破碎菌体后离心的条件为12500rpm，4℃，离心30min；

在用清洗缓冲液洗涤的具体过程中：各离心条件分别为12500rpm，4℃，离心30min；所述预定次数为3次；

在用溶解缓冲液溶解的具体过程中：所述预定时间为1h；离心条件为12500rpm，4℃，离心15min；

在提纯溶解液获得目的蛋白的具体过程中：所述镍柱的具体型号为GE 5mLHistrap；所述镍柱亲和层析法采用结合缓冲液、洗杂缓冲液、以及洗脱缓冲液，所述结合缓冲液为pH7.4的含20mM磷酸钠，500mM氯化钠，10mM咪唑的缓冲液，所述洗杂缓冲液为pH7.4的含20mM磷酸钠，500mM氯化钠，40mM咪唑的缓冲液，所述洗脱缓冲液为pH7.4的含20mM磷酸钠，500mM氯化钠，250mM咪唑的缓冲液；

在逐步梯度透析的具体过程中：透析温度为4℃，预定时间为8h；超滤浓缩条件为5000g，离心25min；

第四步中，所述凝胶尺寸排阻柱的具体型号为GE Superdex 75 10/300increase；采用的洗脱缓冲液为pH7.0的含50±0.5mM磷酸钠，500±5mM氯化钠的缓冲液。

采用以上优选方案，可更进一步优化各步骤的细节特征。

本发明还提出：

氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的重组驼源血清白蛋白。

编码上文所述重组驼源血清白蛋白的基因片段。

具有上文所述基因片段的重组质粒。

含有上文所述重组质粒的工程菌。

与现有技术相比，本发明采用以大肠杆菌为基础的原核表达***，通过质粒构建、转化并表达、包涵体复性、纯化的主要步骤，实现采用原核表达***成功表达重组驼源血清白蛋白的目的，所得血清白蛋白水溶性良好，具有纯度高、安全性高、性价比高等优点，有望成为人源血清白蛋白的替代品，以满足患者对血清白蛋白的需求。

附图说明

图1为本发明实施例1的结果图。

图2为本发明实施例2的结果图。

图3为本发明实施例3的SDS-PAGE结果图。

图4为本发明实施例3的肽段覆盖率检测结果图。

图5为本发明实施例3的N端测序结果图。

图6为本发明实施例3的Western Blot鉴定结果图。

图7为本发明实施例4的SDS-PAGE鉴定蛋白表达及包涵体溶解结果图。

图8为本发明实施例4的镍柱亲和层析过程中各鉴定结果图。

图9为本发明实施例5的凝胶寸尺排阻柱精纯鉴定结果图。

具体实施方式

下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。

实施例1

本实施例为构建重组质粒。

本实施例的基本过程包括：将编码重组驼源血清白蛋白的基因片段先经PCR扩增、再与质粒载体重组构建出重组质粒；重组驼源血清白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

其中，质粒载体为pSmart-I；重组构建时选择的酶切位点为：BamHI内切酶位点，以及XhoI内切酶位点；基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

以下是作为示例的具体过程：

使用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段。选择BamHI(5392bp)和XhoI(5432bp)内切酶位点，使质粒载体线性化。在目的序列两端设计同源重组臂引物，重组替换5392bp和5432bp之间的载体的序列。最终构建出重组质粒pSmart-I-CSA。

相关结果如图1所示，其中：

A图是PCR扩增目的序列结果，结果表明，目的片段理论大小是1818bp，图中实际大小与理论大小相符，说明目的片段已成功合成；

B图是取实施例2复苏后菌液进行PCR鉴定的结果，结果表明，经PCR扩增后得到1818bp，与目的片段大小相符，说明重组质粒成功转化进菌体中；

C图是空载体PCR结果，结果表明，空载体pSmart-I理论大小为5428bp，理论大小与实际大小相符；

D图是重组质粒pSmart-I-CSA用XhoI-ApaI酶切鉴定结果，结果表明，从左往右第一个泳道是酶切前重组质粒大小，为7303bp，第二个泳道是酶切后结果，酶切后得到4195bp和3108bp，酶切结果前后相符。

综上，说明重组质粒pSmart-I-CSA成功构建。

实施例2

本实施例为重组质粒转化入化学感受态细胞。本实施例以实施例1为基础。

本实施例的基本过程包括：采用以大肠杆菌制出的化学感受态细胞；将重组质粒转化入化学感受态细胞，然后经培养获得单菌落。

其中，大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌菌株；诱导剂为IPTG。

将重组质粒转化入化学感受态细胞的具体过程为：将预冻的化学感受态细胞、预冻的重组质粒分别置于冰上融化；然后将重组质粒加入化学感受态细胞并混匀；先置冰浴中，再进行热激，然后再置冰浴中静置；加入不含抗生素的LB肉汤培养基进行培养，使菌体复苏。其中，先置冰浴中30min，再42℃热激45s，然后再置冰浴中静置2min；培养条件为37℃，220rpm，培养60min。

经培养获得单菌落的具体过程为：采用复苏后的菌体，在含有卡那霉素的LB平板上进行培养，获得白色单菌落。其中，培养条件为37℃倒置培养16h。

以下是作为示例的具体过程：

将化学感受态细胞BL21(DE3)和重组质粒pSmart-I-CSA置于冰上融化。吸取重组质粒至化学感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激45s，迅速将离心管转移至冰浴中，静置2min。然后向每个离心管中加入450μL无菌、不含抗生素的肉汤培养基(LB)，混匀后置于摇床，37℃，220rpm，培养60min，使菌体复苏。复苏后的菌体在室温离心，4000rpm，离心2min，弃去部分上清，剩余上清与菌体混匀后涂布在含有卡那霉素的LB平板。37℃倒置培养16h，使其长出白色单菌落。如图2所示，LB固体平板上长出的白色菌落即转化成功的感受态细胞。

实施例3

本实施例为目的蛋白的表达试验。本实施例以实施例2为基础。

本实施例的基本过程包括：以单菌落为种子进行液体培养，然后加入诱导剂诱导表达目的蛋白，获得主要以包涵体形式存在的目的蛋白。

其中，以单菌落为种子进行液体培养、然后加入诱导剂的具体过程为：挑取单菌落并接种在含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行复苏培养；将复苏后的菌液接种在新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行正式培养，培养至OD₆₀₀达到预设值时，加入诱导剂并进行诱导培养。其中，复苏培养条件为37℃，220rpm，振荡培养过夜；正式培养条件为37℃，220rpm；加入诱导剂的终浓度为1mM，诱导培养条件为15℃，220rpm，培养16h。

以下是作为示例的具体过程：

在LB平板上挑取单菌落，接种在5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，振荡培养过夜。次日，吸取500μL复苏后的菌液接种在50mL新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，振荡培养，直至OD₆₀₀＝0.6，吸取1mL作为未诱导对照；加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1mM，15℃，220rpm，诱导16h，诱导融合蛋白CSA表达。分别收集诱导2、4、6、8、16小时的1mL菌液，使用diagenoed非接触超声破碎仪，超声10s，间歇30s，循环80次。13000rpm，4℃离心30min，分别收集上清和沉淀。

(1)聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)鉴定蛋白表达情况及蛋白的可溶性。吸取上清120μL，加入30μL SDS蛋白上样缓冲液(5×)，混匀。沉淀加入120μL磷酸盐缓冲液(PBS，pH8.0)，再加入30μL SDS蛋白上样缓冲液(5×)，混匀。将上述溶液95℃，煮沸5min。配制10％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶，上样量为20μL。电泳条件为90V，30min；120V，70min。考马斯亮蓝染色40min后，微波炉加热脱色三次，每次5min。脱色后分析蛋白的表达情况及其可溶性。

结果如图3所示。A图显示的是表达菌株BL21(DE3)在IPTG分别诱导2、4、6、8小时后蛋白的表达情况，其中，1：未诱导；2：诱导2h后的上清蛋白；3：诱导2h后的沉淀蛋白；4：诱导4h后的上清蛋白；5：诱导4h后的沉淀蛋白；6：诱导6h后的上清蛋白；7：诱导6h后的沉淀蛋白；8：诱导8h后的上清蛋白；9：诱导8h后的沉淀蛋白。

B图显示的是表达菌株BL21(DE3)在IPTG诱导16小时后(相当于诱导过夜)蛋白的表达情况，其中，1：未诱导；2：IPTG诱导过夜的总蛋白；3：IPTG诱导过夜的上清蛋白；4：IPTG诱导过夜的沉淀蛋白。

由此可见，目的蛋白的理论分子量为78.7kD，实际蛋白在70～100kD之间，符合预期大小。蛋白的表达量与时间呈正相关(即存在时间依赖性)，时间越长，目的蛋白表达量越多，且蛋白大部分以包涵体形式存在。

(2)肽段覆盖率鉴定及N端氨基酸序列分析。使用Trypsin、Chymotrypsin和Glu-C酶分别对包涵体进行酶解，通过LC-MS/MS检测得到酶解后的肽段，肽段氨基酸总数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例即为肽段覆盖率。将SDS-PAGE凝胶胶内酶解，肽段除盐后，含多肽的样品加入80μL Nano-HPLC Buffer B进行挥干。最后使用LC-MS/MS检测，色谱柱为Acclaim PepMap^TMRSLC 75μm×15cm，nanoViper C18，2μm，100A。流动相A相：0.1％FA水溶液，流动相B相：0.1％/80％FA/乙腈溶液，梯度洗脱程序如表1所示，流动相流速为300nL/min。质谱条件为：一级MS质量分辨率设为70000，自动增益控制值(AGC)设为1e6，最大注射时间50ms；质谱扫描设定为一级全扫描质核比m/z范围300-1600；所有MS/MS图谱采集使用数据依赖型的正离子模式下的高能碰撞裂解完成，碰撞能量设为28；MS/MS的分辨率设为17500，自动增益控制设为1e5，最大注射时间为50ms；动态排除时间设为30s。使用ThermoBioPharma Finder3.2软件分析质谱数据。

表1蛋白酶切鉴定流动相梯度洗脱程序

图4是肽段覆盖率检测结果，A图为供试品经Trypsin酶解后的BPI图谱；B图为供试品经Chymotrypsin酶解后的BPI图谱；C图为供试品经Glu-C酶解后的BPI图谱。结果表明，供试品经Trypsin酶解后的覆盖率为93.5％，供试品经Chymotrypsin酶解后的覆盖率为100.0％，供试品经Glu-C酶解后的覆盖率为59.9％。综合可得，供试品的肽段覆盖率为100.0％。

图5是N端氨基酸序列分析结果，A图为供试品经Chymotrypsin酶解后的BPI图谱；B图为N端序列一级质谱图；C图为N端序列二级质谱图；D图为N端序列b、y离子图。综上可得，供试品的N端氨基酸序列为DGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGDTHKSEIAHRF，与目的蛋白序列相符。

(3)Western Blot(WB)鉴定分析。一抗采用抗his tag的兔单克隆抗体；二抗采用羊抗兔IgG-HRP。由于表达的蛋白融合了组氨酸标签，因此使用抗组氨酸标签的抗体能够和融合蛋白特异性结合。图6为Western Blot鉴定结果图，其中，1：0.2mM IPTG诱导的总蛋白；2：0.2mM IPTG诱导的上清蛋白；3：0.2mM IPTG诱导的沉淀蛋白；4：1mM IPTG诱导的总蛋白；5：1mM IPTG诱导的上清蛋白；6：1mM IPTG诱导的沉淀蛋白。结果显示，融合了组氨酸的蛋白成功表达。

实施例4

本实施例为蛋白表达及包涵体溶解、纯化和复性。本实施例以实施例2为基础。

本实施例的基本过程包括：

(1)以单菌落为种子进行液体培养，然后加入诱导剂诱导表达目的蛋白，获得主要以包涵体形式存在的目的蛋白。

其中，以单菌落为种子进行液体培养、然后加入诱导剂的具体过程为：挑取单菌落并接种在含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行复苏培养；将复苏后的菌液接种在新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行正式培养，培养至OD₆₀₀达到预设值时，加入诱导剂并进行诱导培养。其中，复苏培养条件为37℃，220rpm，振荡培养过夜；正式培养条件为37℃，220rpm；加入诱导剂的终浓度为1mM，诱导培养条件为15℃，220rpm，培养16h。

(2)超声破碎菌体后离心收集沉淀；之后对该沉淀先用清洗缓冲液洗涤，再用溶解缓冲液溶解，获得含目的蛋白的溶解液。

其中，超声破碎菌体后离心的条件为12500rpm，4℃，离心30min。

用清洗缓冲液洗涤的具体过程为：

先用第一清洗缓冲液重悬沉淀，然后离心收集沉淀，重复预定次数；

再用第二清洗缓冲液重悬沉淀，然后离心收集沉淀，重复预定次数；

各离心条件分别为12500rpm，4℃，离心30min；预定次数为3次。

第一清洗缓冲液为：含5±0.05mM DTT，50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，500±5mM NaCl，1±0.01％Triton X-100，1±0.01mM EDTA的缓冲液；

第二清洗缓冲液为：含5±0.05mM DTT，50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，500±5mM NaCl，1±0.01mM EDTA的缓冲液；

用溶解缓冲液溶解的具体过程为：

用溶解缓冲液重悬沉淀，搅拌预定时间后，离心收集上清，即获得含目的蛋白的溶解液；预定时间为1h；离心条件为12500rpm，4℃，离心15min。

溶解缓冲液为：含50±0.5mM pH 6.0～6.3Tris，8±0.08M尿素，1±0.01mM EDTA，5±0.05mM DTT的缓冲液。

(3)对该溶解液进行提纯，并获得目的蛋白，具体过程为：将溶解液先以镍柱亲和层析法粗提纯化目的蛋白，再以SDS-PAGE法鉴定分离并收集含有目的蛋白的条带；

其中，镍柱的具体型号为GE 5mL Histrap；镍柱亲和层析法采用结合缓冲液、洗杂缓冲液、以及洗脱缓冲液，结合缓冲液为pH7.4的含20mM磷酸钠，500mM氯化钠，10mM咪唑的缓冲液，洗杂缓冲液为pH7.4的含20mM磷酸钠，500mM氯化钠，40mM咪唑的缓冲液，洗脱缓冲液为pH7.4的含20mM磷酸钠，500mM氯化钠，250mM咪唑的缓冲液。

(4)采用逐步梯度透析的方式，使溶解液中的目的蛋白重新折叠成生理状态，即复性。

其中，逐步梯度透析的具体过程为：

先依次在缓冲液R1、缓冲液R2、缓冲液R3、缓冲液R4、缓冲液R5中分别透析预定时间，再进行超滤浓缩；透析温度为4℃，预定时间为8h；超滤浓缩条件为5000g，离心25min。

缓冲液R1为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，4±0.04mM尿素的缓冲液；

缓冲液R2为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，2±0.02mM尿素的缓冲液；

缓冲液R3为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，1±0.01mM尿素，600±6mM L-精氨酸的缓冲液；

缓冲液R4为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，0.5±0.005mM尿素，600±6mM L-精氨酸的缓冲液；

缓冲液R5为含50±0.5mM pH 8.0±0.1Tris-HCl，100±1mM NaCl，10±0.1％甘油，1±0.01mM DTT，600±6mM L-精氨酸的缓冲液。

以下是作为示例的具体过程：

在LB平板上挑取两个单菌落，分别接种在5mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，振荡培养过夜。次日，吸取10mL复苏后的菌液接种在1L新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm，振荡培养，直至OD₆₀₀＝0.6，吸取1mL作为未诱导对照；加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1mM，15℃，220rpm，诱导16h。

用SONICS VCX750型超声波破碎仪破碎菌体，工作4s，间歇8s，工作25min，收集120μL做总蛋白鉴定。

超声后12500rpm，4℃离心30min，收集沉淀，吸取上清1mL做上清蛋白鉴定，弃去剩余上清。收集菌体，用清洗缓冲液1重悬菌体，12500rpm，4℃离心30min，重复三次，再用清洗缓冲液2重悬菌体，12500rpm，4℃离心30min，重复三次。加入20mL溶解缓冲液重悬沉淀，并在室温搅拌1h。12500rpm，4℃，离心15min，收集上清，取1mL做溶解蛋白鉴定。

SDS-PAGE凝胶电泳验证蛋白表达及包涵体溶解情况。配制10％Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝胶，上样量为20μL。电泳条件为90V，30min；120V，70min。考马斯亮蓝染色40min后，微波炉加热脱色三次，每次5min。图7为SDS-PAGE鉴定蛋白表达及包涵体溶解情况结果图，其中，1：溶解的包涵体；2：未诱导；3：IPTG诱导16小时后的总蛋白；4：超声破碎后的上清；5：超声破碎后的沉淀；6：溶解的包涵体；M：marker，从上到下分别是180、130、100、70、55、40、35kDa。结果显示，溶解蛋白分子大小符合预期，使用该溶解蛋白样品进行镍柱纯化。

用5柱体积(CV)的结合缓冲液缓慢润洗镍柱(即平衡镍柱)。将溶解液离心并取含有目的蛋白的上清，将上清以注射器注入镍柱，同时收集此时的流穿液以备后续SDS-PAGE鉴定；将带有目的蛋白的镍柱在4℃条件下孵育过夜(12h)，次日用10～15CV洗杂缓冲液清洗镍柱，收集此时的洗杂液以备后续SDS-PAGE鉴定；最后用5CV洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，同时收集目的蛋白以备后续SDS-PAGE鉴定。

图8中，A图为SDS-PAGE鉴定镍柱纯化的流穿液结果，显示此时杂蛋白较多；B图为SDS-PAGE鉴定镍柱纯化结果，第1、2、3泳道为洗杂液，可见杂蛋白较多，第4～9泳道为洗脱液，可见目的蛋白逐渐显现且增粗，第9泳道蛋白纯度较高。使用高分辨质谱仪(Q Exactive质谱仪)测定该蛋白分子质量，C图显示，经检测得到的相对分子质量为78744.58Da，与理论分子质量匹配，所以选用第9泳道蛋白进行复性及进一步精纯。

采用逐步梯度透析的方法，使蛋白在缓冲液中重新折叠成生理状态，即复性。分别在下列五个缓冲液(R1,R2,R3,R4,R5)中4℃透析8h。最后用超滤管(5000g，离心25min)离心浓缩目的蛋白。

R1:50mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM NaCl,10％Glycerol,1mM DTT,4mM Urea；

R2:50mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM NaCl,10％Glycerol,1mM DTT,2mM Urea；

R3:50mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM NaCl,10％Glycerol,1mM DTT,1mM Urea,600mM L-arginine；

R4:50mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM NaCl,10％Glycerol,1mM DTT,0.5mM Urea,600mM L-arginine；

R5:50mM Tris-HCl(pH 8.0),100mM NaCl,10％Glycerol,1mM DTT,600mM L-arginine。

实施例5

本实施例为精纯复性后目的蛋白。本实施例以实施例4为基础。

本实施例的基本过程包括：

采用凝胶尺寸排阻柱精纯复性后目的蛋白，即得重组驼源血清白蛋白。

其中，凝胶尺寸排阻柱的具体型号为GE Superdex 75 10/300increase；采用的洗脱缓冲液为pH7.0的含50±0.5mM磷酸钠，500±5mM氯化钠的缓冲液。

以下是作为示例的具体过程：

将复性后目的蛋白溶液经超滤离心(5000g，离心25min)，浓缩为600μL，经尺寸排阻柱Superdex 75 10/300increase(GE)洗脱，洗脱缓冲液为pH7.0的含50mM磷酸钠，500mM氯化钠的缓冲液。

在洗脱体积为15～20mL时出峰，此时收集目的蛋白，并做SDS-PAGE鉴定。图9为AKTA purifier搭配Superdex 75 10/300increase柱，上样600uL的峰图，从左往右第一个峰即为目的蛋白；SDS-PAGE图从右往左第6、5、4即为目的蛋白，其纯度及产率符合预期，此步即得双峰驼血清白蛋白。所得白蛋白水溶性良好。该白蛋白具有纯度高、安全性高、性价比高等优点，有望成为人源血清白蛋白的替代品，以满足患者对白蛋白的需求。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 重组驼源血清白蛋白的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1758

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatacccata aaagcgaaat tgcacatcgc tttaaagatc tgggcgaaga tgattttaaa 60

ggcctggttc tgattgcatt ttctcagtat ctgcagcagt gtccgtttga tgatcatgtt 120

aaactggtga atgaagttac cgaatttgca aaaacctgcg ttgccgatga aagtgccgcc 180

gattgcgata aaagtctgca taccctgttt ggtgacaaac tgtgcaccgt ggcaagcctg 240

cgcgaaacct atggcgaaat ggccgattgt tgcgaaaaac aggaaccgga acgcaatgaa 300

tgctttctgc agcataaaag tgataatccg gatctgccga aactgaaacc ggaaccggaa 360

gcactgtgca ccgcctttca ggaaaatgaa aaacgttttg gtggtaaata cctgtatgaa 420

attgcacgtc gtcatccgta tttttatgca ccggaactgc tgtattatgc acatcagtat 480

aaacatgttt tcgaagaatg ctgtaaggat gcagataaag ccgcatgtct gctgccgaaa 540

ttagatgccc tgaaagaacg cattctggca agtagcgccc gtcagcgtct gcgttgtacc 600

agcattcaga aatttggtga ccgcgccctg aaagcatgga gcgttggcca tctgagtcag 660

aaatttccga aagccgattt tgcagaaatt agtaaaatcg tgaccgatct gaccaaaatt 720

cataaagaat gttgtcaggg tgacctgctg gaatgtgccg atgatcgcgc cgatctggca 780

aaatattttt gcgataatca ggaaaccatc agtagcaaac tgaaagaatg ttgcgaaaag 840

ccgctgctgg aaaaaagtca ttgcattcat gaagccgaac gcgatgaaat gccggaaaat 900

ctgccggcca ttaccgaaca gtttgcagaa gataaagatg tgtgcaaaca ttataccgaa 960

gaaaaagatg ttttcctggg tatgtttctg catgaatatg cccgtcgtca tcctgaatat 1020

gccgtgagtc tgctgctgcg tattgccaaa gaatatgaag ccaccctgga agattgctgc 1080

gccaaagatg atccgcatgc atgttatgcc accgtttttg ataaactgca gcatctggcc 1140

gatgaaccgc agaatctggt gaaacagaat tgcgaactgt ttgaaaaact gggcgaatat 1200

ggctttcaga atgatattct ggtgcgctat accaaacgtc tgccgcaggt tagtaccccg 1260

accctggtgg aagtggcacg cggcctgggt cgtgtgggca caaaatgctg taccctgccg 1320

gaaagcaatc gtatgagttg cgccgaagat tatctgagtc tgattctgaa tcgtctgtgt 1380

gtgctgcatg aaaaaacccc ggttagtccg cgcgttacca aatgctgtac agaaagcctg 1440

gttaatcgtc gtccgtgctt tagcagtctg accgccgatg aaacctatga accgaaagaa 1500

tttgatgaaa aaacctttac cttccatgcc gatctgtgca gcgtgagtga accggaaaaa 1560

cagattaaga aacagaccgc actggcagaa ctgctgaaac ataaaccgaa agccaccgat 1620

gaacagctga aaaccgttat ggaaaaattt gtggcctttg tggataaatg ctgcgcagca 1680

gttgataaag aagcctgctt taccgtggaa ggtccgctgc tggttgcagc cacccgtacc 1740

gcactggcgt aactcgag 1758

<210> 2

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly His His His His His His Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln

1 5 10 15

Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile

20 25 30

Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys

35 40 45

Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln

50 55 60

Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile

65 70 75 80

Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile

85 90 95

Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Asp Thr His Lys Ser Glu

100 105 110

Ile Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Asp Asp Phe Lys Gly Leu

115 120 125

Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Asp Asp

130 135 140

His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val

145 150 155 160

Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asp Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe

165 170 175

Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu

180 185 190

Met Ala Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe

195 200 205

Leu Gln His Lys Ser Asp Asn Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Glu

210 215 220

Pro Glu Ala Leu Cys Thr Ala Phe Gln Glu Asn Glu Lys Arg Phe Gly

225 230 235 240

Gly Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala

245 250 255

Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala His Gln Tyr Lys His Val Phe Glu Glu

260 265 270

Cys Cys Lys Asp Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp

275 280 285

Ala Leu Lys Glu Arg Ile Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Arg Leu Arg

290 295 300

Cys Thr Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser

305 310 315 320

Val Gly His Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Asp Phe Ala Glu Ile

325 330 335

Ser Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Ile His Lys Glu Cys Cys Gln

340 345 350

Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr

355 360 365

Phe Cys Asp Asn Gln Glu Thr Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys

370 375 380

Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile His Glu Ala Glu Arg

385 390 395 400

Asp Glu Met Pro Glu Asn Leu Pro Ala Ile Thr Glu Gln Phe Ala Glu

405 410 415

Asp Lys Asp Val Cys Lys His Tyr Thr Glu Glu Lys Asp Val Phe Leu

420 425 430

Gly Met Phe Leu His Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val

435 440 445

Ser Leu Leu Leu Arg Ile Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp

450 455 460

Cys Cys Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp

465 470 475 480

Lys Leu Gln His Leu Ala Asp Glu Pro Gln Asn Leu Val Lys Gln Asn

485 490 495

Cys Glu Leu Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Asp Ile

500 505 510

Leu Val Arg Tyr Thr Lys Arg Leu Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu

515 520 525

Val Glu Val Ala Arg Gly Leu Gly Arg Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr

530 535 540

Leu Pro Glu Ser Asn Arg Met Ser Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Leu

545 550 555 560

Ile Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Pro

565 570 575

Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys

580 585 590

Phe Ser Ser Leu Thr Ala Asp Glu Thr Tyr Glu Pro Lys Glu Phe Asp

595 600 605

Glu Lys Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Ser Val Ser Glu Pro

610 615 620

Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Ala Glu Leu Leu Lys His

625 630 635 640

Lys Pro Lys Ala Thr Asp Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Lys Phe

645 650 655

Val Ala Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Val Asp Lys Glu Ala Cys

660 665 670

Phe Thr Val Glu Gly Pro Leu Leu Val Ala Ala Thr Arg Thr Ala Leu

675 680 685

Ala

Claims (3)

1.一种重组驼源血清白蛋白的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、将编码重组驼源血清白蛋白的基因片段先经PCR扩增、再与质粒载体重组构建出重组质粒；所述重组驼源血清白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

第二步、采用以大肠杆菌制出的化学感受态细胞；将重组质粒转化入化学感受态细胞，然后经培养获得单菌落；以单菌落为种子进行液体培养，然后加入诱导剂诱导表达目的蛋白，获得主要以包涵体形式存在的目的蛋白；

第三步、超声破碎菌体后离心收集沉淀；之后对该沉淀先用清洗缓冲液洗涤，再用溶解缓冲液溶解，获得含目的蛋白的溶解液；对该溶解液进行提纯，并获得目的蛋白；采用逐步梯度透析的方式，使该目的蛋白重新折叠成生理状态，即复性；

第四步、对复性后目的蛋白进行精纯，即得重组驼源血清白蛋白；

第一步中，所述质粒载体为pSmart-I；重组构建时选择的酶切位点为：BamHI内切酶位点，以及XhoI内切酶位点；

第二步中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)大肠杆菌菌株；所述诱导剂为IPTG；

在将重组质粒转化入化学感受态细胞的具体过程中：先置冰浴中30 min，再42℃热激45 s，然后再置冰浴中静置2 min；培养条件为37℃，220 rpm，培养60 min；

在经培养获得单菌落的具体过程中：培养条件为37℃倒置培养16 h；

在以单菌落为种子进行液体培养、然后加入诱导剂的具体过程中：复苏培养条件为37℃，220 rpm，振荡培养过夜；正式培养条件为37℃，220 rpm；加入诱导剂的终浓度为1 mM，诱导培养条件为15℃，220 rpm，培养16 h；

第三步中，用清洗缓冲液洗涤的具体过程为：

先用第一清洗缓冲液重悬沉淀，然后离心收集沉淀，重复预定次数；

再用第二清洗缓冲液重悬沉淀，然后离心收集沉淀，重复预定次数；

所述第一清洗缓冲液为：含5 ± 0.05 mM DTT，50 ± 0.5 mM pH 8.0 ± 0.1 Tris-HCl，500 ± 5 mM NaCl，1 ± 0.01% Triton X-100，1 ± 0.01 mM EDTA的缓冲液；

所述第二清洗缓冲液为：含5 ± 0.05 mM DTT，50 ± 0.5 mM pH 8.0 ± 0.1 Tris-HCl，500 ± 5 mM NaCl，1 ± 0.01 mM EDTA的缓冲液；

用溶解缓冲液溶解的具体过程为：

用溶解缓冲液重悬沉淀，搅拌预定时间后，离心收集上清，即获得含目的蛋白的溶解液；

所述溶解缓冲液为：含50 ± 0.5 mM pH 6.0 ~ 6.3 Tris，8 ± 0.08 M 尿素，1 ±0.01 mM EDTA，5 ± 0.05 mM DTT的缓冲液；

提纯溶解液获得目的蛋白的具体过程为：

将溶解液先以镍柱亲和层析法粗提纯化目的蛋白，再以SDS-PAGE法鉴定分离并收集含有目的蛋白的条带；

逐步梯度透析的具体过程为：

先依次在缓冲液R1、缓冲液R2、缓冲液R3、缓冲液R4、缓冲液R5中分别透析预定时间，再进行超滤浓缩；

所述缓冲液R1为含50 ± 0.5 mM pH 8.0±0.1 Tris-HCl，100 ± 1 mM NaCl，10 ±0.1% 甘油，1 ± 0.01 mM DTT，4 ± 0.04 mM 尿素的缓冲液；

所述缓冲液R2为含50 ± 0.5 mM pH 8.0±0.1 Tris-HCl，100 ± 1 mM NaCl，10 ±0.1% 甘油，1 ± 0.01 mM DTT，2 ± 0.02 mM 尿素的缓冲液；

所述缓冲液R3为含50 ± 0.5 mM pH 8.0±0.1 Tris-HCl，100 ± 1 mM NaCl，10 ±0.1% 甘油，1 ± 0.01 mM DTT，1 ± 0.01 mM 尿素，600 ± 6 mM L-精氨酸的缓冲液；

所述缓冲液R4为含50 ± 0.5 mM pH 8.0±0.1 Tris-HCl，100 ± 1 mM NaCl，10 ±0.1% 甘油，1 ± 0.01 mM DTT，0.5 ± 0.005 mM 尿素，600 ± 6 mM L-精氨酸的缓冲液；

所述缓冲液R5为含50 ± 0.5 mM pH 8.0±0.1 Tris-HCl，100 ± 1 mM NaCl，10 ±0.1% 甘油，1 ± 0.01 mM DTT，600 ± 6 mM L-精氨酸的缓冲液；

第四步中，采用凝胶尺寸排阻柱精纯复性后目的蛋白。

2.根据权利要求1所述重组驼源血清白蛋白的制备方法，其特征是，

第一步中，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

第二步中，将重组质粒转化入化学感受态细胞的具体过程为：将预冻的化学感受态细胞、预冻的重组质粒分别置于冰上融化；然后将重组质粒加入化学感受态细胞并混匀；先置冰浴中，再进行热激，然后再置冰浴中静置；加入不含抗生素的LB肉汤培养基进行培养，使菌体复苏；

经培养获得单菌落的具体过程为：采用复苏后的菌体，在含有卡那霉素的LB平板上进行培养，获得白色单菌落；

以单菌落为种子进行液体培养、然后加入诱导剂的具体过程为：挑取单菌落并接种在含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行复苏培养；将复苏后的菌液接种在新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，进行正式培养，培养至OD₆₀₀达到预设值时，加入诱导剂并进行诱导培养。

3.根据权利要求1所述重组驼源血清白蛋白的制备方法，其特征是，

第三步中，超声破碎菌体后离心的条件为12500 rpm，4℃，离心30 min；

在用清洗缓冲液洗涤的具体过程中：各离心条件分别为12500 rpm，4℃，离心30 min；所述预定次数为3次；

在用溶解缓冲液溶解的具体过程中：所述预定时间为1 h；离心条件为12500 rpm，4℃，离心15 min；

在提纯溶解液获得目的蛋白的具体过程中：所述镍柱的具体型号为GE 5 mL Histrap；所述镍柱亲和层析法采用结合缓冲液、洗杂缓冲液、以及洗脱缓冲液，所述结合缓冲液为pH7.4的含20 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，10 mM咪唑的缓冲液，所述洗杂缓冲液为pH7.4的含20 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，40 mM咪唑的缓冲液，所述洗脱缓冲液为pH7.4的含20 mM磷酸钠，500 mM氯化钠，250 mM咪唑的缓冲液；

在逐步梯度透析的具体过程中：透析温度为4℃，预定时间为8 h；超滤浓缩条件为5000g，离心25 min；

第四步中，所述凝胶尺寸排阻柱的具体型号为GE Superdex 75 10/300 increase；采用的洗脱缓冲液为pH7.0的含50 ± 0.5 mM磷酸钠，500 ± 5mM氯化钠的缓冲液。

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