CN114106207B - Ccl5的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种CCL5的用途。本发明利用CCL5与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将不同的抗原蛋白转运到DC细胞表面，提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了DC细胞防治相关疾病的效果。本发明还在抗原中添加了T2序列从而增强免疫效果。

Description

CCL5的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及CCL5的用途。

背景技术

树突状细胞（Dendritic cells, DC）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells, APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟的DC细胞可以以多种细胞表面蛋白与T细胞结合，并使之激活，将DC细胞本身捕获到的抗原蛋白表位肽最终交叉呈递给T细胞并促使其分化为抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。最终发挥细胞免疫过程对抗原物质进行识别和降解。

肿瘤疫苗通过免疫增强已有的抗肿瘤反应或启动初始T细胞来诱导患者的效应T细胞功能，抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在抗肿瘤过程中发挥重要作用。DC细胞是唯一能激活初始CD8+T细胞的专职抗原呈递细胞，对细胞外肿瘤抗原通过MHC-I进行摄取、加工和交叉提呈，对产生有效的CTL至关重要。因此，通过偶联DC细胞表面分子将肿瘤抗原递送至DC细胞是有效诱导CD8+T细胞免疫应答的肿瘤治疗策略。

目前，已经探明的能够对DC细胞的递呈起到曾强作用的分子包括XCL-1，但仍亟待探明更多的能够起到促进递呈作用的DC细胞表面分子。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供CCL5的用途，研究表明，CCL5能够递送物质到DC细胞，从而提高递呈效果。

本发明提供了CCL5在提高抗原递呈效果中的应用。

本发明中，所述CCL5为趋化因子CCL5，其来自于人类或其他动物，其为全长序列，或具有CCL5活性的部分片段。

本发明提供的融合蛋白包括CCL5和抗原，或者，所述融合蛋白包括CCL5、抗原和T2片段。

本发明实施例，所述融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、CCL5、linker、抗原和T2片段。

本发明中，所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤。

本发明中，所述CCL5为人源CCL5序列，所述抗原为HPV16的E6蛋白和/或HPV16的E7蛋白。

一些实施例中，所述所述融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、CCL5、linker、HPV16的E6蛋白、HPV16的E7蛋白和T2片段。

一些具体实施例中，所述IgE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述CCL5的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述linker为（G₅S）n，其中n为1~10；本发明实施例中，所述linker序列为GGGGGSGGGGG。

所述HPV16的E6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述HPV16的E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

一些具体实施例中，所述融合蛋白的C端还包括FLAG标签序列，其氨基酸序列为DYKDDDDK，但该序列只为鉴定蛋白表达的标签不影响序列的免疫效果。

本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸。

本发明所述的编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明还提供了含有编码所述融合蛋白的转录单元。

所述转录单元中包括启动子和编码所述融合蛋白的核酸。

一些实施例中，所述转录单元还包括终止子。

一些具体实施例中，所述启动子为CMV或者CMV/R启动子。

本发明还提供了表达载体，其包括骨架载体和编码所述融合蛋白的核酸。

本发明中，所述骨架载体选自pVAX1系列载体、或pVR系列载体。

本发明还提供了转化或转染所述重组载体的重组宿主。

本发明所述重组宿主的宿主细胞为细菌或哺乳动物细胞。

本发明所述融合蛋白的制备方法，其包括培养本发明所述重组宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。

本发明所述的融合蛋白、核酸、表达载体、宿主、所述制备方法制得的融合蛋白，和/或所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物在制备防治疾病的产品中的应用。

本发明还提供了一种防治疾病的产品，其包括：所述的融合蛋白、核酸、表达载体、宿主、所述制备方法制得的融合蛋白，和/或所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物。

本发明还提供了一种防治疾病的方法，其为给予本发明所述的防治疾病的产品。

本发明中，所述防治包括预防和/或治疗，具体包括提高血清中抗体水平、预防肿瘤的形成、抑制肿瘤生长，提高机体对肿瘤的免疫反应能力。

本发明中，所述疾病包括由病毒和/或病原菌引起的疾病。或者所述疾病为肿瘤。

本发明中，所述防治疾病的产品包括药物和/或疫苗。

本发明中，所述给予的方式包括口服、注射和/或电转。

本发明利用CCL5与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将不同的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。本发明中的T2序列经实验测定其具有非常强的免疫增强效果，可以在促进抗原呈递的过程中进一步激发体液和细胞免疫反应，最终达到抑制相关肿瘤生长的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 CCL5趋化各类专职抗原提呈细胞能力分析；

图2A示pVR-CCL5-E6E7-T2载体图谱、图2B示pVR-CCL5-E6E7载体图谱、图2C示pVR-E6E7载体图谱；

图3示检测pVR-CCL5-E6E7-T2、pVR-CCL5-E6E7和pVR-E6E7的三种质粒目的基因的表达情况，利用蛋白免疫印迹技术（Westernblot）检测C端带有Flag标签的融合蛋白编码核苷酸的表达情况；

图4示不同融合基因对小鼠进行预防型免疫用于后期测试特异性T细胞反应的时间轴；

图5示不同融合基因对小鼠进行免疫后特异性T细胞反应的流式检测结果；

图6示不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行预防型免疫和接瘤时间轴；

图7示上述预防型免疫的量瘤检测结果图；

图8示不同融合基因、mRNA和蛋白疫苗分别对小鼠进行治疗型免疫和接瘤时间轴；

图9示上述治疗型免疫的量瘤检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了CCL5的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

本发明所述CCL5是一种人体内重要的趋化因子，它属于CC趋化因子家族（CCchemokines）中的一员，其可以特异性的在人体巨噬细胞和T细胞中高水平表达。本发明研究表明CCL5能够用于递送物质到专职抗原提呈细胞，特别是DC细胞，从而增强DC细胞的递呈效果。

本发明中，所述CCL5可为人源片段，也可为其他动物来源的片段，例如鼠源，兔源、猴源、猪源等，其可为完整的CCL5，也可为其中具有CCL5活性的片段或突变体，本申请对此不做限定。本申请实施例中，以人源CCL5为实验对象，验证CCL5对抗原的递呈效果的提高。所述人源CCL5的氨基酸序列为：SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRA HIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS（SEQ ID NO:3）。

本发明所述融合蛋白中，所述T2序列是由T4噬菌体纤维蛋白C末端的一段短肽（T4phageheadfibritin）改造而来，种属来源属于外源序列，该序列在人体内完全没有，不会出现增强免疫后对人体其他蛋白造成杀伤的问题。有报道认为该序列可以在某些情况下促进某些蛋白的三聚体化。本发明中发现T2这段作为经过人工改造后的多肽序列具有人体内的免疫增强效果。本发明中，T2片段由31个氨基酸组成，其序列为PGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLG（SEQ ID NO:4）。

本发明所述融合蛋白中的抗原的个数至少为1个。例如，可为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个及以上。在本发明的研究中，对1个或2个抗原的融合效果进行实验，都表现出良好的效果。

本发明所述抗原来自病毒、病原菌和/或肿瘤。在本发明中，所述抗原可为来自病毒、病原菌和/或肿瘤的蛋白。一些实施例中，所述抗原来自病毒的衣壳蛋白或非结构蛋白、病原菌的膜蛋白、鞭毛蛋白或肿瘤的表面抗原。其可为的完整片段，也可为其抗原决定簇。其可仅含有一个抗原决定簇，也可以由多个抗原决定簇串联而成，也可以为一个抗原决定簇重复串联两次或以上。

本发明中，所述病毒包括但不限于HPV病毒、EBV、HCV、HIV、HBV、VZV或冠状病毒中至少一种；

本发明中，所述肿瘤包括但不限于肝癌、***、卵巢癌、肺癌、头颈癌、***癌、乳腺癌、血液肿瘤、卵巢癌、结直肠癌中至少一种。

一些实施例中，所述抗原为HPV病毒的E2、E5、E6和/或E7蛋白或其突变表位。所述HPV病毒包括各种亚型的HPV病毒，例如， HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和/或HPV58型。

一些实施例中，所述抗原为EB病毒的LMP1、LMP2、EBNA1或其突变表位。

一些实施例中，所述抗原为冠状病毒的S蛋白、N蛋白、E蛋白、M蛋白或其表位。所述冠状病毒为SARS病毒、MERS病毒和/或COVID_19。

一些实施例中，所述抗原为肝癌的GPC3蛋白和/或AFP蛋白。

一些实施例中，所述抗原为***癌的PSA，PSMA，PSCA，PAP和/或STEAP1。

一些实施例中，所述抗原为乳腺癌的Her2/neu和/或BCAR3的优势表位。

一些实施例中，所述抗原为黑色素瘤的MAGE-A3，ISR2，NY-ESO-1，Melan A，gp100，Tyrosinase，TRP1和/或TRP2。

一些实施例中，所述抗原为血癌的Immunoglobulin idiotype，Immunoglobulinκ-chain和/或Immunoglobulin λ-chain。

一些实施例中，所述抗原为结直肠癌的AIM2，HT001，TAF1B，Micoryx和/或TGFβRII。

一些实施例中，所述抗原为卵巢癌的folate receptor-α。

一些实施例中，所述抗原为多种原癌基因、抑癌基因和/或肿瘤特异性抗原的P53，IDH1/ 2， BAGE，GAGE1，GAGE2，CAG3，RAGE，CEA，CDK4，CASP-8，ras，bcr/abl和/或MUC-1。

本发明利用CCL5与DC细胞等免疫细胞表面受体的趋化结合能力将上述的抗原蛋白转运交叉呈递到DC细胞表面，从而提高了各种抗原蛋白被DC细胞吞噬、加工、呈递的效率，改善了其防治相关疾病的效果。在此前的预实验中，上述蛋白中包括HPV16的E6或E7的蛋白在内的多个抗原的递呈效率已经被验证能够被CCL5提高。本发明实施例中，以HPV16的E6和E7蛋白为案例，证明CCL5对抗原蛋白递呈效率的提高效果，其他蛋白与CCL5融合后也会起到良好的效果。

本发明中为了保证融合蛋白中各功能片段不受空间位阻影响而顺利地折叠，在片段间添加linker，其中，CCL5与HPV病毒抗原蛋白之间的linker为GGGGGSGGGGG。不同抗原之间可以通过（G₅S）n和/或AGA相连。

在本发明中，为了提高融合蛋白的表达效果，在CCL5的N端添加促使融合蛋白分泌到胞外的信号肽。一些实施例中，所述信号肽为IgE信号肽。具体的，其氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS（SEQ ID NO:5）

在本发明中，为了方便融合蛋白的纯化，在融合蛋白的C端添加标签。所述标签选自本领域熟知的重组蛋白纯化标签。一些实施例中，所述标签为DYKDDDDK。

一些具体实施例中，所述融合蛋白的结构为自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CCL5蛋白序列、linker序列（GGGGGSGGGGG）、E6E7蛋白序列、T2蛋白序列、Flag标签序列。具体的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15。

本发明所述的编码蛋白的核酸可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。在本发明实施例中，所述核酸为DNA或RNA形式。所述DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。所述DNA可以是单链的或是双链的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如编码区和非编码区如调控序列(例如启动子或转录终止子)。核酸在拓扑学上可以是线性或环状的。核酸可以是例如载体(如表达或克隆载体)的一部分，或一个片段。所述核酸可直接从天然来源获得，或者可由重组、酶法或化学技术辅助制备。所述RNA形式为由基因转录获得的mRNA等。

在本发明中，对表达融合蛋白的DNA序列进行了优化，这些优化包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。

本发明所述的预防是指在肿瘤发生前给予本发明所述的药物能够起到降低肿瘤发生风险的作用。本发明所述的治疗是指在肿瘤发生之后给予本发明所述的药物，能够抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积或延缓肿瘤的生长速度。本发明实施例中，以小鼠移植瘤细胞TC-1为实验对象，验证融合蛋白疫苗的效果。

本发明中还提供了融合蛋白的转录单元，所述转录单元是指启动子开始至终止子结束的 DNA序列。启动子和终止子两侧或之间还可包括调控片段，所述调控片段可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点，例如启动子的增强子，poly（A）信号等。本发明提供的转录单元中，包括CMV或CMV/R启动子、CMV增强子和编码融合蛋白的核酸片段。

本发明所述重组载体，是指重组的核酸载体，是一种重组DNA分子，其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列。对原核细胞中的表达必需的核酸序列包括启动子，任选包括操纵基因序列，核糖体结合位点及可能的其它序列。已知原核细胞利用启动子，增强子以及终止和多腺苷酸化信号。一经转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用，或者，在一些情况下，自己整合进入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以交换通用，因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而，本发明意图包括表达载体的这样的其它形式，其发挥等价作用，其在本领域是已知的或将变为已知的，包括但不限于：质粒，噬菌体颗粒，病毒载体和/或仅为潜在的基因组***物。具体实施例中，编码本发明提供的融合蛋白的核酸可构建于各种真核表达载体中。例如，其骨架载体可以是pVAX1系列载体、或pVR系列载体（参见中国专利ZL 202110624820.8）。

本发明所述的宿主细胞，为含有核酸载体和/或目标基因的原核或真核宿主。用使用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这样的转化宿主细胞有能力复制编码蛋白质的载体或表达期望蛋白质。

本发明实施例中，所述融合蛋白的制备方法采用诱导重组宿主表达的方式，所述培养物可以为培养获得的菌体、细胞体、培养液、或者有上述培养物中经提取和/或纯化获得的物质。

本发明提供的防治疾病的产品包括：所述的融合蛋白、核酸、表达载体、宿主、所述制备方法制得的融合蛋白，和/或所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物。本发明中，所述防治疾病的产品包括药物和/或疫苗。所述疫苗中还包括药学上可接受的运载体、赋形剂和/或佐剂。所述药物中还包括药学上可接受的辅料。

本发明所述的预防是指在疾病发生前给予本发明所述的防治疾病的产品，从而能够起到降低疾病发生风险的作用。本发明所述的治疗是指在疾病发生之后给予本发明所述的防治疾病的产品，能够改善病症，抑制疾病发展，使患者恢复健康。例如，将本发明所述的产品用于防治肿瘤，能够提高血清中抗体水平、抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积或延缓肿瘤的生长速度。本发明实施例中，以小鼠移植瘤细胞TC-1为实验对象，验证融合蛋白疫苗的效果并获得良好的效果。

本发明实施例中，涉及的片段的氨基酸序列和编码的核酸片段如表1：

表1片段的氨基酸序列和编码的核酸片段

SEQ ID NO.1	HPV16的E6蛋白的氨基酸序列
		SEQ ID NO.2	HPV16的E7蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.3	CCL5的氨基酸序列
		SEQ ID NO.4	T2多肽氨基酸序列
SEQ ID NO:5	IgE信号肽
		SEQ ID NO.6	质粒pVR-CCL5-E6E7-T2的核苷酸序列
SEQ ID NO.7	质粒pVR-CCL5-E6E7的核苷酸序列
		SEQ ID NO.8	质粒pVR-E6E7的核苷酸序列
SEQ ID NO.9	质粒pVR-CCL5-E6E7-T2中编码融合蛋白的DNA序列
		SEQ ID NO.10	质粒pVR-CCL5-E6E7中编码融合蛋白的DNA序列
SEQ ID NO.11	质粒pVR-E6E7中编码融合蛋白的DNA序列
		SEQ ID NO.12	质粒pVR-CCL5-E6E7-T2中编码融合蛋白的mRNA序列
SEQ ID NO.13	质粒pVR-CCL5-E6E7中编码融合蛋白的mRNA序列
		SEQ ID NO.14	质粒pVR-E6E7中编码融合蛋白的mRNA序列
SEQ ID NO.15	质粒pVR-CCL5-E6E7-T2中融合蛋白的氨基酸序列
		SEQ ID NO.16	质粒pVR-CCL5-E6E7中融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO.17	质粒pVR-E6E7中融合蛋白的氨基酸序列

本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

从小鼠骨髓以及外周血分别分离单核和单核细胞、T 细胞亚群、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。其中骨髓单核细胞分别加入M-CSF和GM-CSF、IL4诱导分化为巨噬细胞和DC细胞后进行趋化实验。趋化小室(碳酸脂膜Transwell小室：5μm；Costar，Cat：3422)的上室中放入上述分离或这诱导分化的细胞，根据实验室前期工作基础加入细胞数量为1× 10⁶/100μl/孔。同时设置自发迁移对照组以及CCL5细胞因子组，所加入的细胞数目相同。CCL5因子采用E.coli纯化重组鼠CCL5蛋白，根据实验室前期已有的工作基础，100ng/ml为最佳趋化效率剂量。4小时后收集趋化下室中的细胞，并进行流式分析CCL5对各类免疫细胞的趋化能力。结果显示：CCL5能有效的从上室中募集各类免疫细胞细胞到下室中(P＜0 .001)(图1)。

实施例2

融合基因或蛋白疫苗的抗原设计方案及哺乳动物表达质粒的构建与制备

构建pVR-CCL5-E6E7-T2质粒：根据人***瘤病毒亚型HPV16的E6和E7蛋白，人源CCL5蛋白及T2多肽序列构建融合蛋白CCL5-E6E7-T2。在融合蛋白CCL5-E6E7-T2的N末端连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽；在融合蛋白CCL5-E6E7-T2的C末端连接一个DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。

最终得到的融合蛋白，自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CCL5蛋白序列、linker序列（GGGGGSGGGGG）、E6蛋白序列、E7蛋白序列、T2蛋白序列、Flag标签序列。

将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:8将该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CCL5-E6E7-T2质粒。如图2A所示。

构建pVR-E6E7质粒：在人***瘤病毒亚型HPV16的E6和E7蛋白序列之前在连接一个氨基酸序列为MDWTWILFLVAAATRVHS的IgE信号肽，之后连接DYKDDDDK的8个氨基酸组成的Flag标签。

使得最终得到的融合蛋白自N端→C端依次包括：IgE信号肽、E6E7蛋白序列、Flag标签序列。如图2 C所示。

将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:11该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-E6E7质粒。

构建质粒pVR-CCL5-E6E7：同样的令最终构建的融合基因自N端→C端依次包括：IgE信号肽、人源CCL5蛋白序列、linker序列（GGGGGSGGGGG）、E6E7蛋白序列、Flag标签序列。

将融合蛋白的氨基酸序列进行哺乳动物细胞表达偏好的密码子优化，确定其融合基因序列为SEQ ID NO:10将该融合基因序列进行基因合成，之后将其整体构建到pVR质粒载体的对应多克隆位点区域，使其能够以正确的密码子翻译顺序表达融合蛋白。最终构建形成的质粒命名为pVR-CCL5-E6E7质粒。如图2 B所示。

具体的，在本实施例所阐述的实验中构建的质粒模式实际上为：pVR-CCL5-抗原-T2、pVR-CCL5-抗原及其对照质粒pVR-抗原。在本实施例的实验中抗原使用的是HPV16亚型的E6E7融合蛋白。

实施例3

构建质粒的体外细胞转染实验(以实施例2构建的抗原为HPV16 E6和E7蛋白的载体为例，对含有其他抗原的载体转染的方式与此相同):

转染前24小时，在6孔细胞培养板内接种2.5×10⁵个HEK293T细胞，待细胞密度长到60%-70%时开始转染试验。转染时提前在37℃水浴锅中预热细胞培养基、无血清的Opti-MEM 培养基。转染时将 5 微克空载体（Vector），pVR-CCL5-E6E7-T2表达载体，pVR-CCL5-E6E7表达载体，pVR-E6E7表达载体和20μL PEI 转染试剂先后加入到 200 μL无血清的Opti-MEM 中，混合均匀后，室温下静置20分钟。将需要转染的细胞更换新鲜培养基，轻柔加入上述转染体系，轻轻摇匀。将细胞放回细胞培养箱中培养 6 小时后换液。转 48小时后收取细胞用Western Blot检测E6E7融合基因质粒HEK293T细胞中的表达效果。

将收集细胞，加入60μL的含有 PMSF 或 Cocktail 蛋白酶抑制剂的 0.5% NP40裂解缓冲液。充分重悬细胞， 4℃旋转裂解细胞 30 分钟。12000 rpm， 4℃离心裂解液 10分钟，收集上清至新的 1.5 mL EP 管中，弃掉沉淀。根据样品实际体积加入 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混合均匀后将样品放在 100℃空气浴中加热 10分钟，立即进行 Westernblot，利用Flag标签抗体(Sigma, F3165)进行检测,结果如图3显示空载体（Vector）无蛋白表达，pVR-CCL5-E6E7-T2和pVR-CCL5-E6E7表达蛋白大小位置明显高于pVR-E6E7，说明实验组质粒pVR-CCL5-E6E7-T2、 pVR-CCL5-E6E7和对照组质粒pVR-E6E7都能够顺利正常在哺乳动物细胞中表达。

实施例4

探索CCL5趋化因子和T2多肽分别对于融合基因疫苗诱导细胞特异性T细胞反应的影响(以抗原为HPV16 E6和E7蛋白的疫苗为例，对含有其他抗原的疫苗诱导T细胞反应的步骤与此相同):

鉴于融合基因在哺乳动物细胞可以正常表达。我们提取单独pVR-CCL5-E6E7-T2、pVR-CCL5-E6E7、pVR-E6E7质粒，利用TERESA活体基因导入仪对小鼠进行免疫质粒电转，质粒剂量25ug，加上阴性对照PBS组共4组，每组5只。按照图4的时间轴标注的免疫策略对小鼠进行免疫，之后在D14对各组小鼠进行采血并加入加了肝素的PBS溶液中。将样品整体进行3000rpm离心5min。弃上清，剩余沉淀采用震荡法打散后加入1mL裂红液于室温裂解1min。后将全部样品进行1200rpm离心6min。弃去上清，使用700μL的PBS溶液洗涤一次。第二次1200rpm离心6min。弃去上清后加入300μL灭活过的10%FBS的1640培养基，重悬沉淀后，加入5μL E7蛋白tetramer（E7-tetramer）染色1h。流式染色：cd8-pe；E7-tetramer-Fitc。流式结果如图5所示。结果显示，在相同剂量组别的比较中所有CCL5-E6E7-T2组的E7特异性T细胞数量都远远多于E6E7组。在相同剂量组别的比较中所有CCL5-E6E7-T2组的E7特异性T细胞数量都多于CCL5-E6E7组。在相同剂量组别的比较中所有CCL5-E6E7组的E7特异性T细胞数量都多于E6E7组。这说明，CCL5趋化因子在抗原蛋白的N端可以有效诱导抗原分子与特异性免疫细胞的结合，从而大大加强了抗原分子交叉呈递的效果，使得CCL5最终能够诱导出抗原分子更强的特异性免疫反应。另外，T2多肽在抗原蛋白C端可以有效加强抗原分子在细胞免疫过程中的免疫强度，大大增加了特异性T细胞产生的数量，起到了免疫增强因子的决定性作用。

实施例5

融合基因DNA和mRNA以及蛋白形式疫苗对小鼠移植瘤细胞TC-1同种移植瘤发生的干预效果(以抗原为HPV16 E6和E7蛋白的蛋白形式疫苗为例，对含有其他抗原的疫苗对肿瘤干预效果的验证步骤与此相同):

鉴于融合基因在哺乳动物细胞可以正常表达。我们提取单独pVR-CCL5-E6E7-T2和pVR-E6E7质粒，利用TERESA活体基因导入仪对小鼠进行免疫质粒电转，并体外转录制备表达pVR-CCL5-E6E7-T2的mRNA疫苗与体内转染试剂in vivo-jetPEI包裹成脂质纳米颗粒作为mRNA形式疫苗（记做CCL5-E6E7-T2-mRNA）。

另纯化融合蛋白作为蛋白疫苗，其中pVR-CCL5-E6E7-T2质粒对应的融合蛋白记做CCL5-E6E7-T2。

同种移植TC-1细胞后观察融合基因免疫对TC-1移植瘤细胞生长的抑制情况。

确定TC-1细胞成瘤后，我们按照图6时间轴标注的免疫策略对小鼠进行质粒电转和mRNA肌肉注射以及蛋白皮下注射。将C57B6（购自为通利华）周龄雌性小鼠和雄性小鼠分为A、B两组，每组分别注射PBS、pVR-E6E7质粒、pVR-CCL5-E6E7-T2质粒、CCL5-E6E7-T2-mRNA以及CCL5-E6E7-T2蛋白的五小组，每小组五只，利用脱毛膏进行小鼠右侧靠近腹股沟***处脱毛处理。之后直接注射mRNA，蛋白或利用电转仪在脱毛处注射质粒，每只25μg，每两周一次，共注射两次，在最后一次注射后一周接种之前摸索好成瘤条件的TC-1瘤细胞，观察肿瘤形成时间并每两天测量肿瘤的长径a和短径b，按照a×b×b/2进行肿瘤体积计算，绘制肿瘤生长曲线。结果如图7所示，免疫pVR-CCL5-E6E7-T2质粒、pVR-E6E7质粒、CCL5-E6E7-T2-mRNA以及CCL5-E6E7-T2蛋白的组别均能使得小鼠体内移植瘤无法成瘤，疫苗效果显著。而且在D30天对所有小鼠进行二次接瘤挑战，结果显示移植瘤仍然无法成瘤。这说明四组疫苗均有非常明显的预防肿瘤的效果。

实施例6

融合基因疫苗对小鼠移植瘤细胞TC-1同种移植瘤的治疗效果(以抗原为HPV16 E6和E7蛋白的融合基因疫苗为例，对含有其他抗原的疫苗对肿瘤干预效果的验证步骤与此相同):

鉴于在预防免疫实验中CCL5-E6E7-T2等疫苗的效果优良。我们又对融合基因免疫的TC-1同种移植瘤的治疗效果进行实验探索。采用如图8中的时间轴对小鼠进行接瘤和质粒治疗性免疫。每次免疫接种量为25μg。在接瘤后开始对小鼠进行免疫两次分别为4d和11d。之后按照相同方法进行量瘤，统计肿瘤体积。绘制肿瘤生长曲线如图9所示。结果显示，pVR-CCL5-E6E7-T2质粒、CCL5-E6E7-T2-mRNA以及CCL5-E6E7-T2蛋白的三组相较pVR-E6E7质粒组更早发生肿瘤生长抑制，且pVR-CCL5-E6E7-T2质粒、CCL5-E6E7-T2-mRNA以及CCL5-E6E7-T2蛋白的三组在接瘤第17天前后移植瘤完全消失，达到了完全的肿瘤治疗效果。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 诺未科技（北京）有限公司

<120> CCL5的用途

<130> MP21034053

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg

1 5 10 15

Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile

20 25 30

Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val

35 40 45

Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

50 55 60

Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser

65 70 75 80

Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln

85 90 95

Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys

100 105 110

Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys

115 120 125

Gln Arg Phe His Asn Thr Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser

130 135 140

Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

145 150 155

<210> 2

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro

1 5 10 15

Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Gly Ser Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp

20 25 30

Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu

35 40 45

Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp

50 55 60

Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr

65 70 75 80

Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys

85 90 95

Ser Gln Lys Pro

100

<210> 3

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala

1 5 10 15

Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly

20 25 30

Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser

50 55 60

Leu Glu Met Ser

65

<210> 4

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr

1 5 10 15

Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly

20 25 30

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser

<210> 6

<211> 4538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttccatt gcatacgttg tatccatatc 60

ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat 120

tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 180

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 240

cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 300

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 360

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 420

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 480

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 540

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 600

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 660

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 720

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccatc 780

ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 840

gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 900

aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 960

actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctact ctggctaact 1020

agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 1080

gctggctagc gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccgccacc atggactgga 1140

cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca caagggtgca cagcagccca tacagcagcg 1200

atacaacccc gtgctgcttt gcctacattg ctagaccact gcctagagcc catatcaaag 1260

aatactttta tacttctggg aaatgttcaa accccgccgt ggtattcgtg actaggaaaa 1320

acaggcaggt ctgtgcaaat cctgagaaga agtgggtccg ggaatacatc aactccctgg 1380

aaatgtctgg aggaggagga gggagcggag gaggaggcgg acaccagaag aggacagcaa 1440

tgttccagga cccacaggag aggccaagga agctgccaca gctgtgcaca gagctgcaga 1500

caacaatcca cgatattatc ctggagtgcg tgtattgcaa gcagcagctg ctgaggaggg 1560

aggtgtatga cttcgctttc agagacctgt gtatcgtgta ccgggacggg aacccttacg 1620

cagtgggcga caagtgcctg aagttctata gcaagatcag cgagtacagg cactactgtt 1680

acagcctgta tggaaccacc ctggagcagc agtataacaa acctctgtgc gacctgctga 1740

tcaggtgcat caactgccag aagcccctgt gccccgagga gaagcagaga cacctggaca 1800

agaagcagag gttccacaat accaggggcc gctggaccgg ccgctgcatg tcttgctgca 1860

ggtccagccg gaccaggaga gagacccagc tggccggagc acacggagat acacccaccc 1920

tgcacgagta catgctggac ctgcagcctg agaccaccga cctgtactgc gggagtggat 1980

acgaacagct gaacgacagc agcgaggagg aggacgagat cgacggcccc gccggacagg 2040

ctgagcctga tagggcccac tacaacattg tgacattttg ctgcaagtgc gacagcaccc 2100

tgaggctgtg cgtgcagagc acccacgtgg atatcaggac cctggaggat ctgctgatgg 2160

gaaccctggg catcgtgtgc cccatctgct cccagaagcc tcctggatct ggctacattc 2220

ctgaagcccc tcgcgacggc caggcctacg tgagaaaaga cggcgaatgg gtgctgctga 2280

gcacctttct gggcgactac aaggacgacg acgacaagtg atgactcgag tctagagggc 2340

ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2400

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2460

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2520

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2580

tgggctctat ggcttctact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc 2640

tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc 2700

gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt 2760

tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 2820

attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 2880

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 2940

actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 3000

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 3060

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 3120

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 3180

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 3240

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc 3300

cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 3360

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 3420

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 3480

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 3540

tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct 3600

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc 3660

ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 3720

taaccctgat aaatgcttca ataatagcac gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg 3780

atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3840

ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3900

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3960

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4020

ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4080

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4140

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4200

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4260

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4320

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4380

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 4440

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 4500

ttcctgggct tttgctggcc ttttgctcac atgttctt 4538

<210> 7

<211> 4445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttccatt gcatacgttg tatccatatc 60

ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat 120

tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 180

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 240

cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 300

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 360

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 420

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 480

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 540

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 600

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 660

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 720

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccatc 780

ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 840

gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 900

aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 960

actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctact ctggctaact 1020

agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 1080

gctggctagc gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccgccacc atggactgga 1140

cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca caagggtgca cagcagccca tacagcagcg 1200

atacaacccc gtgctgcttt gcctacattg ctagaccact gcctagagcc catatcaaag 1260

aatactttta tacttctggg aaatgttcaa accccgccgt ggtattcgtg actaggaaaa 1320

acaggcaggt ctgtgcaaat cctgagaaga agtgggtccg ggaatacatc aactccctgg 1380

aaatgtctgg aggaggagga gggagcggag gaggaggcgg acaccagaag aggacagcaa 1440

tgttccagga cccacaggag aggccaagga agctgccaca gctgtgcaca gagctgcaga 1500

caacaatcca cgatattatc ctggagtgcg tgtattgcaa gcagcagctg ctgaggaggg 1560

aggtgtatga cttcgctttc agagacctgt gtatcgtgta ccgggacggg aacccttacg 1620

cagtgggcga caagtgcctg aagttctata gcaagatcag cgagtacagg cactactgtt 1680

acagcctgta tggaaccacc ctggagcagc agtataacaa acctctgtgc gacctgctga 1740

tcaggtgcat caactgccag aagcccctgt gccccgagga gaagcagaga cacctggaca 1800

agaagcagag gttccacaat accaggggcc gctggaccgg ccgctgcatg tcttgctgca 1860

ggtccagccg gaccaggaga gagacccagc tggccggagc acacggagat acacccaccc 1920

tgcacgagta catgctggac ctgcagcctg agaccaccga cctgtactgc gggagtggat 1980

acgaacagct gaacgacagc agcgaggagg aggacgagat cgacggcccc gccggacagg 2040

ctgagcctga tagggcccac tacaacattg tgacattttg ctgcaagtgc gacagcaccc 2100

tgaggctgtg cgtgcagagc acccacgtgg atatcaggac cctggaggat ctgctgatgg 2160

gaaccctggg catcgtgtgc cccatctgct cccagaagcc tgactacaag gacgacgacg 2220

acaagtgatg actcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc 2280

cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2340

gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta 2400

ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag 2460

acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctactggg cggttttatg 2520

gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg 2580

caaagtaaac tggatggctt tctcgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagctc 2640

tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 2700

ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 2760

ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 2820

gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct 2880

ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 2940

ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 3000

cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 3060

ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 3120

cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 3180

gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 3240

tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 3300

ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 3360

agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 3420

ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgaatta ttaacgctta 3480

caatttcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcataca 3540

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 3600

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atagcacgtg 3660

ctaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 3720

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 3780

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 3840

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 3900

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 3960

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 4020

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 4080

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 4140

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 4200

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 4260

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 4320

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 4380

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctgggctttt gctggccttt tgctcacatg 4440

ttctt 4445

<210> 8

<211> 4208

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttccatt gcatacgttg tatccatatc 60

ataatatgta catttatatt ggctcatgtc caacattacc gccatgttga cattgattat 120

tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 180

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 240

cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 300

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 360

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ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 540

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gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 720

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccatc 780

ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 840

gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 900

aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 960

actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctact ctggctaact 1020

agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 1080

gctggctagc gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccgccacc atggactgga 1140

cctggatcct gttcctggtg gccgccgcca caagggtgca cagccaccag aagaggacag 1200

caatgttcca ggacccacag gagaggccaa ggaagctgcc acagctgtgc acagagctgc 1260

agacaacaat ccacgatatt atcctggagt gcgtgtattg caagcagcag ctgctgagga 1320

gggaggtgta tgacttcgct ttcagagacc tgtgtatcgt gtaccgggac gggaaccctt 1380

acgcagtggg cgacaagtgc ctgaagttct atagcaagat cagcgagtac aggcactact 1440

gttacagcct gtatggaacc accctggagc agcagtataa caaacctctg tgcgacctgc 1500

tgatcaggtg catcaactgc cagaagcccc tgtgccccga ggagaagcag agacacctgg 1560

acaagaagca gaggttccac aataccaggg gccgctggac cggccgctgc atgtcttgct 1620

gcaggtccag ccggaccagg agagagaccc agctggccgg agcacacgga gatacaccca 1680

ccctgcacga gtacatgctg gacctgcagc ctgagaccac cgacctgtac tgcgggagtg 1740

gatacgaaca gctgaacgac agcagcgagg aggaggacga gatcgacggc cccgccggac 1800

aggctgagcc tgatagggcc cactacaaca ttgtgacatt ttgctgcaag tgcgacagca 1860

ccctgaggct gtgcgtgcag agcacccacg tggatatcag gaccctggag gatctgctga 1920

tgggaaccct gggcatcgtg tgccccatct gctcccagaa gcctgactac aaggacgacg 1980

acgacaagtg atgactcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg 2040

tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2100

aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2160

gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2220

aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact gggcggtttt 2280

atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 2340

ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 2400

ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 2460

aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 2520

cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 2580

caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg 2640

gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 2700

ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 2760

tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 2820

tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 2880

agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 2940

actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 3000

cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 3060

tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 3120

tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 3180

cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc 3240

ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 3300

acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3360

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac 3420

gtgctaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 3480

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 3540

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 3600

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 3660

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 3720

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3780

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 3840

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 3900

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 3960

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 4020

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 4080

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 4140

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctgggct tttgctggcc ttttgctcac 4200

atgttctt 4208

<210> 9

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcccataca gcagcgatac aaccccgtgc tgctttgcct acattgctag accactgcct 60

agagcccata tcaaagaata cttttatact tctgggaaat gttcaaaccc cgccgtggta 120

ttcgtgacta ggaaaaacag gcaggtctgt gcaaatcctg agaagaagtg ggtccgggaa 180

tacatcaact ccctggaaat gtctggagga ggaggaggga gcggaggagg aggcggacac 240

cagaagagga cagcaatgtt ccaggaccca caggagaggc caaggaagct gccacagctg 300

tgcacagagc tgcagacaac aatccacgat attatcctgg agtgcgtgta ttgcaagcag 360

cagctgctga ggagggaggt gtatgacttc gctttcagag acctgtgtat cgtgtaccgg 420

gacgggaacc cttacgcagt gggcgacaag tgcctgaagt tctatagcaa gatcagcgag 480

tacaggcact actgttacag cctgtatgga accaccctgg agcagcagta taacaaacct 540

ctgtgcgacc tgctgatcag gtgcatcaac tgccagaagc ccctgtgccc cgaggagaag 600

cagagacacc tggacaagaa gcagaggttc cacaatacca ggggccgctg gaccggccgc 660

tgcatgtctt gctgcaggtc cagccggacc aggagagaga cccagctggc cggagcacac 720

ggagatacac ccaccctgca cgagtacatg ctggacctgc agcctgagac caccgacctg 780

tactgcggga gtggatacga acagctgaac gacagcagcg aggaggagga cgagatcgac 840

ggccccgccg gacaggctga gcctgatagg gcccactaca acattgtgac attttgctgc 900

aagtgcgaca gcaccctgag gctgtgcgtg cagagcaccc acgtggatat caggaccctg 960

gaggatctgc tgatgggaac cctgggcatc gtgtgcccca tctgctccca gaagcctcct 1020

ggatctggct acattcctga agcccctcgc gacggccagg cctacgtgag aaaagacggc 1080

gaatgggtgc tgctgagcac ctttctgggc 1110

<210> 10

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcccataca gcagcgatac aaccccgtgc tgctttgcct acattgctag accactgcct 60

agagcccata tcaaagaata cttttatact tctgggaaat gttcaaaccc cgccgtggta 120

ttcgtgacta ggaaaaacag gcaggtctgt gcaaatcctg agaagaagtg ggtccgggaa 180

tacatcaact ccctggaaat gtctggagga ggaggaggga gcggaggagg aggcggacac 240

cagaagagga cagcaatgtt ccaggaccca caggagaggc caaggaagct gccacagctg 300

tgcacagagc tgcagacaac aatccacgat attatcctgg agtgcgtgta ttgcaagcag 360

cagctgctga ggagggaggt gtatgacttc gctttcagag acctgtgtat cgtgtaccgg 420

gacgggaacc cttacgcagt gggcgacaag tgcctgaagt tctatagcaa gatcagcgag 480

tacaggcact actgttacag cctgtatgga accaccctgg agcagcagta taacaaacct 540

ctgtgcgacc tgctgatcag gtgcatcaac tgccagaagc ccctgtgccc cgaggagaag 600

cagagacacc tggacaagaa gcagaggttc cacaatacca ggggccgctg gaccggccgc 660

tgcatgtctt gctgcaggtc cagccggacc aggagagaga cccagctggc cggagcacac 720

ggagatacac ccaccctgca cgagtacatg ctggacctgc agcctgagac caccgacctg 780

tactgcggga gtggatacga acagctgaac gacagcagcg aggaggagga cgagatcgac 840

ggccccgccg gacaggctga gcctgatagg gcccactaca acattgtgac attttgctgc 900

aagtgcgaca gcaccctgag gctgtgcgtg cagagcaccc acgtggatat caggaccctg 960

gaggatctgc tgatgggaac cctgggcatc gtgtgcccca tctgctccca gaagcct 1017

<210> 11

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccagaaga ggacagcaat gttccaggac ccacaggaga ggccaaggaa gctgccacag 60

ctgtgcacag agctgcagac aacaatccac gatattatcc tggagtgcgt gtattgcaag 120

cagcagctgc tgaggaggga ggtgtatgac ttcgctttca gagacctgtg tatcgtgtac 180

cgggacggga acccttacgc agtgggcgac aagtgcctga agttctatag caagatcagc 240

gagtacaggc actactgtta cagcctgtat ggaaccaccc tggagcagca gtataacaaa 300

cctctgtgcg acctgctgat caggtgcatc aactgccaga agcccctgtg ccccgaggag 360

aagcagagac acctggacaa gaagcagagg ttccacaata ccaggggccg ctggaccggc 420

cgctgcatgt cttgctgcag gtccagccgg accaggagag agacccagct ggccggagca 480

cacggagata cacccaccct gcacgagtac atgctggacc tgcagcctga gaccaccgac 540

ctgtactgcg ggagtggata cgaacagctg aacgacagca gcgaggagga ggacgagatc 600

gacggccccg ccggacaggc tgagcctgat agggcccact acaacattgt gacattttgc 660

tgcaagtgcg acagcaccct gaggctgtgc gtgcagagca cccacgtgga tatcaggacc 720

ctggaggatc tgctgatggg aaccctgggc atcgtgtgcc ccatctgctc ccagaagcct 780

<210> 12

<211> 1110

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcccauaca gcagcgauac aaccccgugc ugcuuugccu acauugcuag accacugccu 60

agagcccaua ucaaagaaua cuuuuauacu ucugggaaau guucaaaccc cgccguggua 120

uucgugacua ggaaaaacag gcaggucugu gcaaauccug agaagaagug gguccgggaa 180

uacaucaacu cccuggaaau gucuggagga ggaggaggga gcggaggagg aggcggacac 240

cagaagagga cagcaauguu ccaggaccca caggagaggc caaggaagcu gccacagcug 300

ugcacagagc ugcagacaac aauccacgau auuauccugg agugcgugua uugcaagcag 360

cagcugcuga ggagggaggu guaugacuuc gcuuucagag accuguguau cguguaccgg 420

gacgggaacc cuuacgcagu gggcgacaag ugccugaagu ucuauagcaa gaucagcgag 480

uacaggcacu acuguuacag ccuguaugga accacccugg agcagcagua uaacaaaccu 540

cugugcgacc ugcugaucag gugcaucaac ugccagaagc cccugugccc cgaggagaag 600

cagagacacc uggacaagaa gcagagguuc cacaauacca ggggccgcug gaccggccgc 660

ugcaugucuu gcugcagguc cagccggacc aggagagaga cccagcuggc cggagcacac 720

ggagauacac ccacccugca cgaguacaug cuggaccugc agccugagac caccgaccug 780

uacugcggga guggauacga acagcugaac gacagcagcg aggaggagga cgagaucgac 840

ggccccgccg gacaggcuga gccugauagg gcccacuaca acauugugac auuuugcugc 900

aagugcgaca gcacccugag gcugugcgug cagagcaccc acguggauau caggacccug 960

gaggaucugc ugaugggaac ccugggcauc gugugcccca ucugcuccca gaagccuccu 1020

ggaucuggcu acauuccuga agccccucgc gacggccagg ccuacgugag aaaagacggc 1080

gaaugggugc ugcugagcac cuuucugggc 1110

<210> 13

<211> 1017

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcccauaca gcagcgauac aaccccgugc ugcuuugccu acauugcuag accacugccu 60

agagcccaua ucaaagaaua cuuuuauacu ucugggaaau guucaaaccc cgccguggua 120

uucgugacua ggaaaaacag gcaggucugu gcaaauccug agaagaagug gguccgggaa 180

uacaucaacu cccuggaaau gucuggagga ggaggaggga gcggaggagg aggcggacac 240

cagaagagga cagcaauguu ccaggaccca caggagaggc caaggaagcu gccacagcug 300

ugcacagagc ugcagacaac aauccacgau auuauccugg agugcgugua uugcaagcag 360

cagcugcuga ggagggaggu guaugacuuc gcuuucagag accuguguau cguguaccgg 420

gacgggaacc cuuacgcagu gggcgacaag ugccugaagu ucuauagcaa gaucagcgag 480

uacaggcacu acuguuacag ccuguaugga accacccugg agcagcagua uaacaaaccu 540

cugugcgacc ugcugaucag gugcaucaac ugccagaagc cccugugccc cgaggagaag 600

cagagacacc uggacaagaa gcagagguuc cacaauacca ggggccgcug gaccggccgc 660

ugcaugucuu gcugcagguc cagccggacc aggagagaga cccagcuggc cggagcacac 720

ggagauacac ccacccugca cgaguacaug cuggaccugc agccugagac caccgaccug 780

uacugcggga guggauacga acagcugaac gacagcagcg aggaggagga cgagaucgac 840

ggccccgccg gacaggcuga gccugauagg gcccacuaca acauugugac auuuugcugc 900

aagugcgaca gcacccugag gcugugcgug cagagcaccc acguggauau caggacccug 960

gaggaucugc ugaugggaac ccugggcauc gugugcccca ucugcuccca gaagccu 1017

<210> 14

<211> 780

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caccagaaga ggacagcaau guuccaggac ccacaggaga ggccaaggaa gcugccacag 60

cugugcacag agcugcagac aacaauccac gauauuaucc uggagugcgu guauugcaag 120

cagcagcugc ugaggaggga gguguaugac uucgcuuuca gagaccugug uaucguguac 180

cgggacggga acccuuacgc agugggcgac aagugccuga aguucuauag caagaucagc 240

gaguacaggc acuacuguua cagccuguau ggaaccaccc uggagcagca guauaacaaa 300

ccucugugcg accugcugau caggugcauc aacugccaga agccccugug ccccgaggag 360

aagcagagac accuggacaa gaagcagagg uuccacaaua ccaggggccg cuggaccggc 420

cgcugcaugu cuugcugcag guccagccgg accaggagag agacccagcu ggccggagca 480

cacggagaua cacccacccu gcacgaguac augcuggacc ugcagccuga gaccaccgac 540

cuguacugcg ggaguggaua cgaacagcug aacgacagca gcgaggagga ggacgagauc 600

gacggccccg ccggacaggc ugagccugau agggcccacu acaacauugu gacauuuugc 660

ugcaagugcg acagcacccu gaggcugugc gugcagagca cccacgugga uaucaggacc 720

cuggaggauc ugcugauggg aacccugggc aucgugugcc ccaucugcuc ccagaagccu 780

<210> 15

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala

1 5 10 15

Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly

20 25 30

Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser

50 55 60

Leu Glu Met Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly His

65 70 75 80

Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys

85 90 95

Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

100 105 110

Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

115 120 125

Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro

130 135 140

Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu

145 150 155 160

Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln

165 170 175

Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln

180 185 190

Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln

195 200 205

Arg Phe His Asn Thr Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys

210 215 220

Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Ala Gly Ala His

225 230 235 240

Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu

245 250 255

Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Gly Ser Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser

260 265 270

Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro

275 280 285

Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser

290 295 300

Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu

305 310 315 320

Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser

325 330 335

Gln Lys Pro Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly

340 345 350

Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe

355 360 365

Leu Gly

370

<210> 16

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala

1 5 10 15

Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly

20 25 30

Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln

35 40 45

Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser

50 55 60

Leu Glu Met Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly His

65 70 75 80

Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg Lys

85 90 95

Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

100 105 110

Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

115 120 125

Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro

130 135 140

Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu

145 150 155 160

Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln

165 170 175

Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln

180 185 190

Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Gln

195 200 205

Arg Phe His Asn Thr Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys

210 215 220

Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Ala Gly Ala His

225 230 235 240

Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu

245 250 255

Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Gly Ser Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser

260 265 270

Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro

275 280 285

Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser

290 295 300

Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu

305 310 315 320

Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser

325 330 335

Gln Lys Pro

<210> 17

<211> 260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro Arg

1 5 10 15

Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile

20 25 30

Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val

35 40 45

Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

50 55 60

Pro Tyr Ala Val Gly Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser

65 70 75 80

Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln

85 90 95

Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys

100 105 110

Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys

115 120 125

Gln Arg Phe His Asn Thr Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser

130 135 140

Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu Ala Gly Ala

145 150 155 160

His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro

165 170 175

Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Gly Ser Gly Tyr Glu Gln Leu Asn Asp

180 185 190

Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu

195 200 205

Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp

210 215 220

Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr

225 230 235 240

Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys

245 250 255

Ser Gln Lys Pro

260

Claims (8)

1.融合蛋白，其自N端→C端依次包括：IgE信号肽、CCL5、linker、抗原和T2片段，

所述T2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述IgE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述CCL5的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述linker为（G₅S）n，其中n为1~10；

所述抗原为HPV16的E6蛋白和HPV16的E7蛋白；

所述HPV16的E6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述HPV16的E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：9所示。

4.表达载体，其包括骨架载体和权利要求2或3所述的核酸。

5.转化或转染权利要求4所述表达载体的宿主。

6.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，培养权利要求5所述宿主，获得含有所述融合蛋白的培养物。

7.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2或3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的宿主、权利要求6所述制备方法制得的融合蛋白，和/或权利要求6所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物在制备防治HPV相关疾病的产品中的应用。

8.一种防治HPV相关疾病的产品，其特征在于，其包括：权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2或3所述的核酸、权利要求4所述的表达载体、权利要求5所述的宿主、权利要求6所述制备方法制得的融合蛋白，和/或权利要求6所述制备方法制得的含有所述融合蛋白的培养物。

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