CN114106120B

CN114106120B - 一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1及其相关产品和用途

Info

Publication number: CN114106120B
Application number: CN202111154498.3A
Authority: CN
Inventors: 李彦邦; 吴静磊; 连红莉; 李凯
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN114106120A

Abstract

本发明公开了一种重金属转运蛋白PhHMA5II‑1及其相关产品和用途。所述蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白。本发明的重金属转运蛋白PhHMA5II‑1的靶序列，经基因编辑技术与pYLCRISPR/Cas9载体连接后导入矮牵牛中形成矮牵牛突变体，经铜胁迫后，该矮牵牛突变体的花瓣中的铁含量明显降低，铜和锰含量也有不同程度的下降；同时矮牵牛突变体的生长得到了促进，特别是花瓣的数量性状得到了提高，尤其是花瓣的重量。

Description

一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1及其相关产品和用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1及其相关产品和用途。

背景技术

重金属如铜，是我国土壤的重要污染源之一，过量的铜会严重影响植物的生长。若铜通过食物链进入人体内，将影响人体的健康。所以在铜污染严重的土壤上，用花卉等经济作物代替粮食作物种植能够有效合理的利用土地。

高浓度铜，能够引起植物体叶片和花瓣内铁离子平衡的失调，从而导致植物的光合作用速率降低，生物量降低，从而严重影响植物的生长和发育。但由于对植物特别是花瓣内中重金属，例如铜转运的分子机理，特别是铁和铜离子互作的分子调控机理尚不清楚，严重影响了抗性花卉植物的筛选和选育。

矮牵牛是重要的园林造景植物，因其花色丰富，花期长等特点，是世界最受欢迎的道路和园林布景花卉，有花坛之王的美誉。HMA5属于植物重金属转运家族蛋白，是植物中最重要的铜解毒蛋白之一。它能够利用水解ATP产生的能量将单价的铜离子泵出细胞或者泵入液泡，从而达到铜解毒的作用。但目前对其功能机理的研究主要集中在拟南芥和水稻等植物的根部。然而，其在花卉植物中的研究尚少，尤其是在花瓣中的提高重金属转运能力或提高重金属耐受性的研究很少。此外，HMA5家族蛋白转运铁的功能也未见报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1及其相关产品和用途，进而解决现有技术中的问题。

本发明目的之一在于提供一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1，所述蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白。

本发明目的之二在于提供上述所述蛋白相关的生物材料，包括如下任一种：

a)编码如上述所述蛋白的多核苷酸；

b)含有a)所述多核苷酸的重组表达载体；

c)含有a)所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌；

d)含有a)所述多核苷酸的转基因植物细胞，或含有b)所述重组表达载体的转基因植物。

根据本申请的技术方案，a)中，所述多核苷酸包括如SEQ ID NO.1所示序列。

本发明目的之三在于提供如上述所述蛋白作为靶标用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力中的用途；优选包括促进植物生长，包括促进根系生长、提高花瓣的数量性状。本申请中，花瓣的数量性状包括花径、花型、花瓣大小和花瓣重量。

本发明目的之四在于提供如上述所述的蛋白质或如上述所述的生物材料在筛选用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力产品中的用途；优选包括促进植物生长，包括促进根系生长、提高花朵的数量性状。

本发明目的之五在于提供一种用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力的产品，包括PhHMA5II-1抑制剂或PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体；

所述PhHMA5II-1抑制剂是指使权利要求1所述的蛋白PhHMA5II-1质突变或失活或功能下降的化合物；

或，所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体是指使权利要求1所述的蛋白PhHMA5II-1质突变或失活或功能下降的编辑***。

本发明目的之六在于提供一种构建转基因植物的方法，向植物导入上述所述的PhHMA5II-1抑制剂或PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体，得到植物突变体。

根据本申请的技术方案，采用农杆菌介导法将如上述所述的PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体导入所述植物。

优选地，所述农杆菌介导法为：

将上述所述的PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体转化于农杆菌；

将含有所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体的农杆菌导入所述植物。

本发明目的之七在于提供一种培育对重金属耐受性高或对重金属转运能力高的植物的方法，在铜胁迫下，种植如上述所述的植物突变体，进行培育。

根据本申请的技术方案，所述铜选自硫酸铜。具体地，所述硫酸铜的浓度不高于10μM。

根据本申请的技术方案，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。

在一个具体实施方式中，所述植物为双子叶植物。

较佳的，所述双子叶植物选自拟南芥、紫花苜宿、矮牵牛、棉花、蓖麻和矮牵牛。具体地，所述双子叶植物为矮牵牛。

根据本申请的技术方案，所述重金属包括铜、锌、锰和铁。

在一个具体实施方式中，所述重金属为铁和铜。

较佳的，所述重金属为铁。

本发明具有以下有益效果：

本发明从矮牵牛W115中获得一个重金属转运基因PhHMA5II-1，该基因与拟南芥AtHMA5基因具有较高的同源性。该基因的靶序列，经基因编辑技术与pYLCRISPR/Cas9载体连接后导入矮牵牛中形成矮牵牛突变体，在高铜胁迫下，该矮牵牛突变体的花瓣中的铁含量明显降低，铜和锰含量也有不同程度的下降；同时该矮牵牛突变体的生长得到了促进，特别是花瓣的数量性状得到了提高，尤其是花瓣的重量。

附图说明

图1显示为本发明实施例1的矮牵牛PhHMA5II-1氨基酸序列与拟南芥AtHMA5氨基酸序列的比较图。

图2显示为本发明实施例1的矮牵牛PhHMA5II-1蛋白的功能结构域图。

图3显示为本发明实施例2的重组质粒的谱图。

图4显示为本发明实施例3的矮牵牛突变体和野生型矮牵牛的部分基因序列对比图。

图5显示为本发明实施例4中在10μM硫酸铜胁迫下，野生型矮牵牛和矮牵牛突变体的花瓣中铜离子、锰离子和锌离子的含量图。

图6显示为本发明实施例4中在10μM硫酸铜胁迫下，野生型矮牵牛和矮牵牛突变体的花瓣中铁离子的含量图。

图7显示为本发明实施例4中在10μM硫酸铜胁迫下，野生型矮牵牛和矮牵牛突变体的花瓣干重图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例的目的在于填补矮牵牛“W115”PhHMA5II-1基因的克隆、以及基因的功能分析的空白。

本发明的第一方面，提供了一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1，所述蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白。

SEQ ID NO：2所示序列具体为：

MATAKFLSFACIRNESKYGDFSSRPHYPSMPKYPKGVTISTDEEKSIHGTESKAIYSVHGMSCSACAGSVEKAIKRLAGIKEAVVDVLNNRAQVIFYPSYVNEEMIRETIEDVGFQATLITEEATEKSSQVCRIRIKGMTCTSCSTTVESALQLIPGVQKAQVALATEEAEIQYDPRILTYNQLLETIENTGFEAILISTGEDRSKILLKIDGVHTGDSMRIIESSLRALPGVEDIDIDPELKKLSVSYKSDIIGPRDFIRVIESTGSGQFNAMLYPEGGGEQSHRQEEIGNYRRSFLWSLFFTIPVFLTSMVFMYIPGLKDGLDIKVVNMLSIGEILRWVLSTPVQFIIGRRFYSGSYKALRHGSANMDVLIALGTNAAYFYSVYSVLRAATSPSFKSTDFFETSSMLISFILLGKYLEVLAKGKTSEAIAKLMNLTPDTATLLQHGDEGNVVNEEEIDSRLIQKNDVIRIVPGAKVACDGFVIWGQSHVNESMITGESRPVAKRKGDIVIGGTVNENGVLHIRATRVGSESALSQIVRLVESAQMAKAPVQKFADGISKYFVPLVIIVSFSTWLAWFLAGKYAAYPKSWIPSSMDSFQLALQFGISVMVIACPCALGLATPTAVMVGTGVGASRGVLIKGGQALESAQKVNCIVFDKTGTLTMGKPVVVNTRLFRTMVLREFYELVAAAEVNSEHPLAKAIVEYAKKFREDEENPVWPEIQDFESITGHGVKAIVHSKKVIVGNKSLMLAQGISVSADADEVLAETEELAQTGILVSVDGVLTGVVAISDPVKPGAREVISLLKSMNVESKLVTGDNWGTANAIAKEVGITDVIAEAKPEDKAEKVKELQSSGKVVAMVGDGINDSPALVAADVGMAIGAGTDIAIEAADIVLMKSNLEDVITAIDLSRKTFGRIRLNYFWAFGYNLLGIPIAAGALFPSTRFRLPPWVAGAAMAASSVSVVCSSLLLKNYTRPKKLDNLGIGGITVE。

本发明第二方面，还提供了与第一方面所述蛋白相关的生物材料，包括如下任一种：

a)编码如第一方面所述蛋白的多核苷酸；

b)含有a)所述多核苷酸的重组表达载体；

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式，DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1中的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2所示序列的蛋白，但与SEQ ID NO:1中的编码区序列有差别的核酸序列。在本发明的一个具体实施例中，所述多核苷酸从矮牵牛“W115”的组织中提取出来。所述多核苷酸具体为PhHMA5II-1基因。

SEQ ID NO：1所示序列具体为：

ATGGCAACTGCAAAGTTTCTTTCATTTGCATGCATAAGAAATGAAAGTAAATATGGAGATTTTTCATCAAGACCACATTATCCATCAATGCCAAAATATCCAAAGGGTGTTACTATATCAACTGATGAAGAAAAAAGTATACATGGAACAGAATCAAAGGCAATATATTCAGTACATGGAATGAGTTGTTCTGCATGTGCAGGTTCTGTAGAGAAAGCAATTAAAAGACTTGCTGGTATTAAAGAAGCTGTTGTTGATGTCTTGAATAATAGAGCTCAAGTTATTTTTTATCCTAGCTATGTTAATGAGGAAATGATCCGTGAGACCATAGAAGATGTTGGATTCCAGGCTACTCTGATTACAGAGGAGGCAACGGAGAAATCCTCCCAAGTCTGCCGGATACGTATAAAAGGAATGACCTGCACTTCTTGCTCCACAACTGTTGAATCTGCTTTACAGTTGATCCCAGGTGTACAGAAAGCACAAGTAGCATTAGCAACTGAAGAGGCTGAAATTCAATATGATCCAAGGATATTAACTTACAATCAGCTTTTAGAGACCATAGAAAATACTGGATTTGAAGCCATATTAATTAGCACAGGAGAAGATAGGAGCAAAATATTGCTGAAAATTGATGGAGTACACACTGGCGATTCCATGAGGATCATTGAAAGTTCTCTTAGAGCACTCCCGGGTGTTGAAGACATTGATATTGATCCTGAGTTGAAGAAGTTATCCGTTTCTTATAAATCAGATATAATAGGACCTAGAGATTTCATTCGAGTAATTGAGTCAACTGGTTCCGGACAGTTCAATGCAATGTTATATCCTGAAGGAGGTGGGGAACAATCGCATAGACAGGAGGAAATTGGAAACTATCGTCGGTCCTTTCTCTGGAGCTTGTTTTTTACCATTCCAGTTTTCTTGACTTCCATGGTCTTTATGTATATTCCTGGTCTGAAGGATGGATTGGATATTAAAGTTGTTAACATGCTTAGCATTGGAGAGATTTTGCGGTGGGTGCTTTCAACTCCAGTGCAATTCATCATTGGCCGTCGTTTCTATTCTGGTTCTTACAAAGCATTACGTCATGGTTCTGCAAATATGGATGTTTTGATTGCTTTGGGAACAAATGCGGCCTACTTTTATTCAGTCTACTCGGTGTTGAGAGCTGCTACTTCCCCAAGCTTCAAGTCTACTGATTTTTTTGAGACCAGCTCAATGCTCATTTCCTTCATTCTACTCGGGAAGTATCTTGAAGTTTTGGCCAAAGGGAAGACATCGGAGGCCATTGCTAAACTCATGAACTTGACCCCTGATACTGCAACATTATTACAGCATGGTGATGAAGGAAATGTGGTAAATGAGGAAGAAATTGATAGCCGACTGATACAGAAGAATGATGTGATCAGAATCGTTCCAGGTGCAAAAGTAGCCTGTGATGGTTTTGTCATCTGGGGACAAAGCCACGTCAACGAGAGTATGATAACCGGAGAATCTCGGCCAGTGGCCAAACGGAAGGGCGACATAGTGATTGGAGGAACTGTGAATGAGAATGGTGTTCTGCATATTAGAGCTACTAGAGTTGGATCAGAGAGTGCGCTTTCACAGATTGTTAGGCTGGTTGAATCAGCACAGATGGCTAAAGCTCCTGTTCAAAAATTTGCTGATGGCATTTCTAAATATTTTGTGCCTCTTGTTATTATTGTCTCCTTTTCCACTTGGCTAGCCTGGTTTTTAGCTGGGAAATACGCCGCCTATCCTAAATCCTGGATTCCATCTTCCATGGATAGCTTTCAGCTTGCCTTGCAATTTGGTATATCTGTTATGGTCATAGCTTGCCCGTGTGCCCTTGGTCTTGCTACTCCAACTGCTGTCATGGTTGGCACAGGAGTTGGTGCTTCTCGTGGTGTCCTGATTAAAGGTGGGCAGGCTTTGGAAAGCGCTCAAAAGGTGAACTGTATAGTGTTTGATAAGACGGGTACACTTACAATGGGGAAACCAGTCGTTGTAAATACAAGGCTTTTCAGAACTATGGTACTTCGAGAATTTTATGAATTGGTTGCTGCAGCTGAGGTAAATAGTGAGCACCCCTTAGCCAAGGCAATTGTCGAATATGCCAAAAAGTTTAGAGAGGATGAGGAGAACCCGGTATGGCCTGAAATCCAGGACTTTGAGTCAATAACTGGCCATGGCGTGAAGGCTATTGTCCACAGCAAGAAAGTAATAGTTGGAAACAAGAGCTTGATGTTAGCACAAGGCATTTCTGTTTCAGCTGATGCCGATGAAGTTCTAGCTGAAACAGAAGAATTGGCTCAAACTGGAATACTTGTATCAGTTGATGGTGTACTGACTGGAGTTGTTGCTATATCAGATCCTGTGAAGCCCGGAGCTCGTGAAGTCATTTCTCTTCTTAAGTCTATGAATGTCGAGAGTAAACTAGTAACAGGTGACAATTGGGGAACAGCTAATGCCATTGCCAAGGAAGTTGGCATTACGGATGTTATTGCAGAAGCAAAACCTGAAGACAAAGCAGAAAAAGTGAAGGAATTGCAGAGTTCAGGAAAAGTTGTTGCAATGGTCGGAGATGGAATTAACGATTCTCCAGCTCTCGTAGCAGCAGATGTTGGAATGGCAATAGGGGCGGGGACAGATATAGCTATTGAGGCAGCTGATATTGTCCTAATGAAAAGCAATCTGGAAGATGTCATAACTGCTATTGACCTTTCCAGGAAAACATTTGGTCGAATTCGTCTGAACTACTTTTGGGCATTTGGCTATAACCTTCTTGGCATCCCAATTGCTGCTGGAGCTCTTTTCCCATCTACTAGATTTCGCCTGCCACCGTGGGTAGCAGGTGCAGCAATGGCTGCTTCTTCAGTGAGTGTTGTCTGCAGCTCTCTTTTGTTGAAGAATTACACGAGACCAAAGAAGCTTGATAATCTTGGGATTGGAGGCATAACTGTTGAGTGA。

本发明对矮牵牛基因进行分析，获得一个转运重金属的基因，具体为PhHMA5II-1基因。PhHMA5II-1基因与拟南芥AtHMA5的基因相似性极高。

在本发明中，矮牵牛“W115”的PhHMA5II-1基因的多核苷酸全长序列或其片段可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的实施例记载的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，可以根据本发明实施例记载的矮牵牛“W115”的PhHMA5II-1核苷酸序列，在核酸同源性的基础上，筛选矮牵牛“W115”的PhHMA5II-1相关同源基因。

在本发明一个具体实施例中，所述SEQ ID NO：1所示的多核苷酸通过包括如下步骤的方法获得：以矮牵牛的cDNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的正向引物如序列SEQID NO：8所示，所述PCR扩增的反向引物如序列SEQ ID NO：9所示。

SEQ ID NO：8所示序列具体为：

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATGGCAACTGCAAAGTTTCTTTC-3'

SEQ ID NO：9所示序列具体为：

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTCAACAGTTATGCCTCCAATC-3'

需要说明的是，在本发明实施例中，“多核苷酸”可以是指，该多核苷酸已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，也可以指该多核苷酸已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

本发明的含有a)所述多核苷酸的重组表达载体。本发明中，编码所述蛋白质的多核苷酸序列可***到表达载体中形成重组表达载体中。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本发明中的表达载体不局限于下述实施例中提到的pYLCRISPR/Cas9载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含抗逆蛋白编码的核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明的含有a)所述多核苷酸的生物工程菌、或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌，所述生物工程菌含有如上述所述的重组表达载体或基因组内整合有如第二方面所述的多核苷酸。生物工程菌以使其能够表达蛋白质。生物工程菌可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。不局限于本申请中所采用的农杆菌Agl0。

本发明的含有a)所述多核苷酸的转基因植物细胞，或含有b)所述重组表达载体的转基因植物。本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作既可以。

本发明第三方面，提供如第一方面所述蛋白作为靶标用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力中的用途；优选包括促进植物生长，包括促进根系生长、提高花瓣的数量性状。本申请中，花瓣的数量性状包括花径、花型、花瓣大小和花瓣重量。

本发明第四方面，提供如第一方面所述蛋白或第二方面所述的生物材料筛选用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力产品中的用途；优选包括促进植物生长，包括促进根系生长、提高花瓣的数量性状。

本发明，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将第一方面所述的重金属转运蛋白PhHMA5II-1失活导入矮牵牛，形成矮牵牛突变体，经铜胁迫实验验证，该矮牵牛突变体的花瓣中的铁含量明显降低，铜和锰含量也有不同程度的下降；同时矮牵牛突变体的生长得到了促进，特别是花瓣的数量性状得到了提高，尤其是花瓣的重量。说明该基因其能提高植物体内重金属转运能力或提高植物对重金属耐受性，特别是提高铁和铜的转运能力，由此显示了其在抗重金属植物培育的过程中起到了重要的作用。

本发明第五方面，提供一种用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力的产品，包括PhHMA5II-1抑制剂或PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体；

所述PhHMA5II-1抑制剂是指使第一方面所述的蛋白PhHMA5II-1质突变或失活或功能下降的化合物；

或，所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体是指使第一方面所述的蛋白PhHMA5II-1质突变或失活或功能下降的编辑***。

本发明的一个具体实施方式中，所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体为：1)选择PhHMA5II-1基因的编码区如gtcaAGAAACTTTGCAGTTGCCA所示序列(SEQ ID NO.10)和如attgGCTACTCTGATTACAGAGG所示序列(SEQ ID NO.12)，作为CRISPR/Cas9***的靶序列；2)将所述靶序列与载体片段pYLCRISPR/Cas9进行连接，得到所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体。

本发明第六方面，提供一种构建转基因植物的方法，所述方法包括：向植物导入第五方面所述的PhHMA5II-1抑制剂或PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体，得到植物突变体。

当采用重组DNA技术转化生物工程菌时，可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当生物工程菌为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明中，采用农杆菌介导法将如上述所述的多核苷酸或如上述所述的重组表达载体转入植物中。较佳的，所述农杆菌介导法为：将所述的重组表达载体转化于农杆菌；将含有所述重组表达载体的农杆菌转化于所述植物。

在本发明的一个具体实施例中，构建植物突变体的方法，包括1)选择PhHMA5II-1基因的编码区如gtcaAGAAACTTTGCAGTTGCCA所示序列(SEQ ID NO.10)和如attgGCTACTCTGATTACAGAGG所示序列(SEQ ID NO.12)，作为CRISPR/Cas9***的靶序列；2)将所述靶序列与载体片段pYLCRISPR/Cas9进行连接，得到重组质粒；3)用含有所述重组质粒的农杆菌Agl 0浸染矮牵牛的愈伤组织，通过筛选，获得所述植物突变体。

本发明第七方面，提供一种培育对重金属耐受性高或对重金属转运能力高的植物的方法，在铜胁迫下，培育如第四方面得到的转基因植物。本发明中，所述铜为硫酸铜；所述硫酸铜的浓度不高于10μM。

本发明中，所述重金属包括铜、锌、锰和铁。较佳的，所述重金属为铜和铁。尤其是铁。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作既可以。所述的植物不限于双子叶植物或单子叶植物。更具体地，所述双子叶植物包括拟南芥、紫花苜宿、矮牵牛、棉花、矮牵牛和蓖麻。在本发明的一个具体实施例中，所述植物优选矮牵牛。

本申请的下述实施例中，矮牵牛的品种为W115。

本申请的下述实施例中，LB固体培养基的配方为：10g胰蛋白胨(购于oxoid)，5g酵母粉(购于oxoid)，10g氯化钠(购于国药)，10g琼脂粉(购于上海生工)，补水至1000mL。

本申请的下述实施例中，LB液体培养基的配方为：10g胰蛋白胨(购于oxoid)，5g酵母粉(购于oxoid)，10g氯化钠(购于国药)，补水至1000mL。

本申请的下述实施例中，固体MS共培养基的配方为：5g蔗糖，2.5g葡萄糖，2g琼脂，1.1g MS，250μL 1mg/mL叶酸，250μL 2mg/mL 6-苄基腺嘌呤，250μL 0.1mg/mL 1-萘乙酸，250μL 1mg/mL玉米素，250μL 200mM乙酰丁香酮，加水至250mL，调节pH至5.8。

本申请的下述实施例中，MS固体选择培养基的配方为：5g蔗糖，2.5g葡萄糖，2g琼脂，1.1g MS，500μL 1mg/mL玉米素，250μL 1mg/mL叶酸，50mg/L卡那霉素，250mg/L羧苄青霉素，加水至250mL，调节pH至5.8。

本申请的下述实施例中，生根培养基的配方为：5g蔗糖，2.5g葡萄糖，2g琼脂,1.1gMS，250μL 1mg/mL叶酸，250mg/L羧苄青霉素，加水至250mL，调节pH至5.8。

本申请的下述实施例中，农杆菌菌株Agl0。

实施例1金属转运PhHMA5II-1基因的克隆

本实施例中，进行矮牵牛PhHMA5II-1基因的克隆，包括如下：

1.1植物材料的获得

取矮牵牛W115的叶片组织，用于提取RNA。

1.2总RNA的提取

取上述叶片组织，冻存后研磨得到粉末，然后与1.5mL的RNAiso Plus(Takara)在离心管混合，静置5min。

在上述离心管中加入300μL氯仿充分混匀，室温静置2分钟，于13200rpm离心15分钟，取800μL上清液转移至新的离心管中。加入800μL异丙醇(麦克林)，充分混匀，静置10分钟，于13200rpm离心10分钟，弃去上清。加1.5mL的70％酒精，涡旋10分钟，于13200rpm离心10分钟，弃去上清，空离2分钟，吸尽酒精。加入20μL～50μL的RNase FreeddH₂O(生工生物工程(上海)股份有限公司)，室温30分钟，得到植物总RNA。

采用NanoDrop微量分光光度计，检测提取的RNA浓度。

1.3cDNA的获得

以1μg上述得到的总RNA为模板，进行cDNA的合成。采用PrimeScript^TM RT reagentKit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行反转录，操作参考试剂盒说明书。

引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ IDNO.3)

1.4获得PhHMA5II-1基因的3'端基因序列

现有技术中仅对矮牵牛品种Petunia axillaris和Petunia inflata的基因组进行了测序，而对矮牵牛品种W115的基因组尚未测序。且矮牵牛品种Petunia axillaris和Petunia inflata基因组的3'端注释存在错误，为了得到矮牵牛W115中PhHMA5II-1基因的序列全长，通过3’RACE获得正确的矮牵牛PhHMA5II-1基因3'端基因序列。

以2.5μL的步骤1.3)得到的cDNA为模板，利用下述中的第一轮PCR引物，按照PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)试剂盒体系进行第一轮PCR扩增，反应条件如下：98℃预变性60s，接着32个循环：98℃变性10s；58℃退火20s；72℃延伸30s，之后72℃后延伸10min，获得第一轮PCR产物。

3'RACE PCR的第一轮PCR的引物序列为：

F:5'-CAAGGCAATTGTCGAATATGCC-3'(SEQ ID NO.4)

R:5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3'(SEQ ID NO.5)

将上述第一轮PCR产物用水稀释20倍，取1μL为模板，利用下述中的第二轮PCR引物，按照PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)试剂盒体系进行第二轮PCR扩增，反应条件为：98℃预变性60s，接着32个循环：98℃变性10s；55℃退火20s；72℃延伸20s，之后72℃后延伸10min，获得第二轮PCR产物。将获得的第二轮PCR产物送苏州金唯智公司进行测序。

3'RACE PCR的第二轮PCR的引物序列为：

F:5'-CTGTTTCAGCTGATGCCGGT-3'(SEQ ID NO.6)

R:5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3'(SEQ ID NO.7)

1.5获得PhHMA5II-1全长基因

根据步骤1.4)中的测序结果，设计PhHMA5II-1全长基因的引物的序列如下：

正向引物

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCAATGGCAACTGCAAAGTTTCTTTC-3'(SEQ IDNO.8)

反向引物

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTCAACAGTTATGCCTCCAATC-3'(SEQ IDNO.9)

以上述步骤1.3)获得的cDNA为模板，用如SEQ ID NO.8所示引物和SEQ ID NO.9所示引物，按照PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)试剂盒体系进行PhHMA5II-1基因全长的扩增，得到长度为2973bp的PhHMA5II-1基因，序列如SEQ ID NO.1所示；根据开放读码框序列推导出共990个氨基酸的PhHMA5II-1蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示。

上述PCR扩增的程序为：在PCR仪上，94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，反应35个循环；最后72℃延伸7分钟，4℃暂存。

序列通过在NCBI网站进行BLASTP(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(Genbank)，比较结果见图1。将PhHMA5II-1蛋白的氨基酸序列，采用参考文献1(Nuria Andrés-Colás,Vicente Sancenón,Susana Rodríguez-Navarro,et.TheArabidopsis heavy metal P-type ATPase HMA5 interacts with metallochaperonesand functions in copper detoxification of roots.The plant journal,45:225-236(2005))中记载，进行功能结构区域比较，比较结果见图2。

图1为本实施例扩增得到PhHMA5II-1的氨基酸序列和拟南芥AtHMA5氨基酸序列的同源比较结果图。

从图1可知，发现矮牵牛PhHMA5II-1的氨基酸序列与拟南芥AtHMA5氨基酸序列的序列一致性为73.5％。

图2为本实施例扩增得到PhHMA5II-1蛋白和拟南芥AtHMA5蛋白的氨基酸序列的功能结构域的比较结果图。

从图2可知，PhHMA5II-1蛋白含有HMA5家族蛋白含有的典型的保守结构域，如两个金属离子结合位点，1个ATP结合位点和8个跨膜结构域等。

实施例2 pYLCRISPR/Cas9的质粒构建和转化

本实施例中，将实施例1获得的PhHMA5II-1经基因编辑后与pYLCRISPR/Cas9连接，并转化于农杆菌中。包括如下：

2.1获得重组质粒

通过CRISPR-P 2.0和CRISPR-GE在线软件选取PhHMA5II-1基因敲除的两个靶序列，并通过CRISPR-GE在线软件设计相应的引物。参考文献2(Ma,X.et al.A RobustCRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants.Mol.Plant 8,1274–1284(2015))中记载的pYLCRISPR/Cas9进行酶切和连接的条件进行。

靶序列1由AtU3b启动子驱动表达，其用于构建载体的序列为：

正链：gtcaAGAAACTTTGCAGTTGCCA(SEQ ID NO.10)

负链：aaacTGGCAACTGCAAAGTTTCT(SEQ ID NO.11)

其中，小写字母gtca和aaac代表接头。

靶序列2由AtU6-1启动子驱动表达，其用于构建载体的序列为：

正链：attgGCTACTCTGATTACAGAGG(SEQ ID NO.12)

负链：aaacCCTCTGTAATCAGAGTAGC(SEQ ID NO.13)

其中，小写字母attg和aaac代表接头。

将靶序列1和靶序列2同时连入pYLCRISPR/Cas9载体，得到重组质粒，重组质粒的图谱如图3所示。

2.2重组质粒转化于农杆菌菌株中

取1μL步骤2.1得到的重组质粒与10μL农杆菌菌株Agl 0小心混匀，用电转仪(eppendorf)在1500v进行转化。

取30μL复苏液体涂布于含有150μg/mL卡那霉素(Kanamycine)的LB固体培养基上，并在28℃培养48h。

培养过夜后，挑取单菌落进行菌落PCR，甘油保存阳性单克隆菌落，放入-80℃冰箱保存。

实施例3将重组质粒转入模式植物矮牵牛

本实施例中，采用实施例2获得的阳性单克隆菌落侵染叶片，并培养，得到矮牵牛突变体，包括如下：

(1)预摇农杆菌

吸取40μL的阳性单克隆菌落至7mL的LB液体培养基中，并在28℃于200rpm摇菌培养12～16h；培养至吸光度OD600＝1.5～2.0，得到预摇农杆菌。预摇农杆菌中加入水至35mL并加3.5μL的200mM乙酰丁香酮，混匀，得到菌液。

(2)叶片灭菌

取矮牵牛“W115”的绿色无黄枯叶片，用70％酒精消毒15s，用0.4％次氯酸钠消毒10min，灭菌水泡2min，重复5次。

(3)转化植株：

配制35mL含有乙酰丁香酮的水溶液，其中水溶液中含有3.5μL的200mM乙酰丁香酮，用含有乙酰丁香酮的水溶液重悬预摇农杆菌。将灭菌后的叶片浸泡于前述重悬预摇农杆菌的溶液中15分钟。

(4)共培养：将浸泡后的叶片置于MS共培养基上，并在人工气候箱中黑暗培养48小时。

(5)愈伤组织和幼苗的诱导：共培养好的叶片移入含有MS固体选择培养基中；每隔2-3周将叶片转移至新的MS固体培养基中。

(6)生根：待愈伤转化成长茎的芽后，将茎切下，移入生根培养基中，待植株长出根后移入土中，培养，得到转化后的植株。

(7)突变体株系的鉴定

对上述转化后的植株提取DNA，采用如SEQ ID NO.14所示序列和SEQ ID NO.15所示序列的引物筛选获得阳性基因矮牵牛突变体。

引物F：ATGTTGACCGGTAAGGCGCG(SEQ ID NO.14)

引物R：AAACTTGCAGAATGGCTAGAGTCA(SEQ ID NO.15)

然后，以筛选得到的阳性植物的DNA为模板，采用如SEQ ID NO.16所示序列和SEQID NO.17所示序列的引物，按Master Mix(With Dye)(翌圣)试剂盒体系进行PCR，获得的PCR扩增产物用如SEQ ID NO.18所示序列的引物进行测序。PCR反应程序为：98℃预变性30s，接着32个循环：98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延申30s，之后72℃后延伸10min。

引物F：CCATAGTCGGTTGATCAAATGT(SEQ ID NO.16)

引物R：ATGAGCACTGCTATTCAAGAATC(SEQ ID NO.17)

进行PCR，对PCR扩增产物，用引物CAACAACAGCTTCTTTAATACCAG(SEQ ID NO.18)进行测序，找出阳性矮牵牛突变体的突变位点。

图4为本实施例的矮牵牛突变体和野生型矮牵牛的部分基因序列对比图。图中-代表删除一个C碱基。

从图4可知，已成功获得矮牵牛突变体。

实施例4矮牵牛突变体和野生型矮牵牛的高铜胁迫考察

本实施例中，将实施例3获得的矮牵牛突变体进行自交，自交后的种子进行高铜胁迫考察，包括如下：

野生型矮牵牛W115种子(记为CK)以及矮牵牛突变体(记为PhHMA5II-1)的种子用0.08％次氯酸钠、70％酒精，涡旋仪振荡10min后，用灭菌水浸泡1min，重复5次，加入灭菌水后，4℃黑暗培养2d；然后将消毒后的种子分别播种在MS培养基上生长14d，生长期间给予光照16h，黑暗8h，温度25℃，得到幼苗。

用海绵条包裹幼苗茎部，每条海绵包裹一株。将包裹好的幼苗塞进泡沫浮板的圆孔中，在水培盒中用1/2Hoagland营养液培养28天。28天后，将幼苗移至由10μM硫酸铜和1/2Hoagland营养液组成的溶液中继续培养3～4周，期间收集新长出的花瓣。植物的生长条件为：在温度25℃和湿度为65％，光照和黑暗交替进行，光照时间为16h和黑暗时间为8h。用KOH将营养液的pH值调节至5.5，每7天更换一次。

每三朵花为一个重复样品，收集好的花瓣于105℃杀青30min，80℃过夜烘干至恒重，用于后续金属离子浓度测定。

称取烘干后的植物材料，与硝酸和30％过氧化氢(1：1)在120℃消解1.5h，用去离子水定容。用电感耦合等离子体发射光谱仪Optima 8000测定花瓣中的铜、锌、锰和铁的离子浓度。

图5为本实施例在10μM硫酸铜胁迫下，野生型矮牵牛和矮牵牛突变体的花瓣中铜离子、锰离子和锌离子的含量图。

图6为本实施例在10μM硫酸铜胁迫下，野生型矮牵牛和矮牵牛突变体的花瓣中铁离子的含量图。

图7为本实施例在10μM硫酸铜胁迫下，野生型矮牵牛和矮牵牛突变体的花瓣干重图。

从图5可知，铜胁迫后，与野生型矮牵牛相比，矮牵牛突变体的花瓣中铜和锰均有所下降，锌含量有所升高，但是均差异不显著。

从图6可知，矮牵牛突变体的花瓣中铁离子的含量，显著低于野生型矮牵牛。

从图7可知，矮牵牛突变体的花瓣的干重，显著高于野生型矮牵牛。

图5、图6和图7说明，本申请的重金属转运蛋白能提高植物体内重金属转运能力或提高植物对重金属耐受性，尤其是提高铁和铜的转运能力，特别是铁的转运能力，此外还能促进植物生长，提高花瓣数量性状，尤其是花瓣的干重。究其原因，可能是在高铜胁迫下，重金属转运蛋白能通过降低植物花瓣中的铁含量，来降低铜胁迫带来的负面影响，平衡重金属的浓度，从而促进植物生长，尤其是提高花瓣数量性状，特别是提高花瓣的干重。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

/>

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1及其相关产品和用途

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2973

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：1(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcaactg caaagtttct ttcatttgca tgcataagaa atgaaagtaa atatggagat 60

ttttcatcaa gaccacatta tccatcaatg ccaaaatatc caaagggtgt tactatatca 120

actgatgaag aaaaaagtat acatggaaca gaatcaaagg caatatattc agtacatgga 180

atgagttgtt ctgcatgtgc aggttctgta gagaaagcaa ttaaaagact tgctggtatt 240

aaagaagctg ttgttgatgt cttgaataat agagctcaag ttatttttta tcctagctat 300

gttaatgagg aaatgatccg tgagaccata gaagatgttg gattccaggc tactctgatt 360

acagaggagg caacggagaa atcctcccaa gtctgccgga tacgtataaa aggaatgacc 420

tgcacttctt gctccacaac tgttgaatct gctttacagt tgatcccagg tgtacagaaa 480

gcacaagtag cattagcaac tgaagaggct gaaattcaat atgatccaag gatattaact 540

tacaatcagc ttttagagac catagaaaat actggatttg aagccatatt aattagcaca 600

ggagaagata ggagcaaaat attgctgaaa attgatggag tacacactgg cgattccatg 660

aggatcattg aaagttctct tagagcactc ccgggtgttg aagacattga tattgatcct 720

gagttgaaga agttatccgt ttcttataaa tcagatataa taggacctag agatttcatt 780

cgagtaattg agtcaactgg ttccggacag ttcaatgcaa tgttatatcc tgaaggaggt 840

ggggaacaat cgcatagaca ggaggaaatt ggaaactatc gtcggtcctt tctctggagc 900

ttgtttttta ccattccagt tttcttgact tccatggtct ttatgtatat tcctggtctg 960

aaggatggat tggatattaa agttgttaac atgcttagca ttggagagat tttgcggtgg 1020

gtgctttcaa ctccagtgca attcatcatt ggccgtcgtt tctattctgg ttcttacaaa 1080

gcattacgtc atggttctgc aaatatggat gttttgattg ctttgggaac aaatgcggcc 1140

tacttttatt cagtctactc ggtgttgaga gctgctactt ccccaagctt caagtctact 1200

gatttttttg agaccagctc aatgctcatt tccttcattc tactcgggaa gtatcttgaa 1260

gttttggcca aagggaagac atcggaggcc attgctaaac tcatgaactt gacccctgat 1320

actgcaacat tattacagca tggtgatgaa ggaaatgtgg taaatgagga agaaattgat 1380

agccgactga tacagaagaa tgatgtgatc agaatcgttc caggtgcaaa agtagcctgt 1440

gatggttttg tcatctgggg acaaagccac gtcaacgaga gtatgataac cggagaatct 1500

cggccagtgg ccaaacggaa gggcgacata gtgattggag gaactgtgaa tgagaatggt 1560

gttctgcata ttagagctac tagagttgga tcagagagtg cgctttcaca gattgttagg 1620

ctggttgaat cagcacagat ggctaaagct cctgttcaaa aatttgctga tggcatttct 1680

aaatattttg tgcctcttgt tattattgtc tccttttcca cttggctagc ctggttttta 1740

gctgggaaat acgccgccta tcctaaatcc tggattccat cttccatgga tagctttcag 1800

cttgccttgc aatttggtat atctgttatg gtcatagctt gcccgtgtgc ccttggtctt 1860

gctactccaa ctgctgtcat ggttggcaca ggagttggtg cttctcgtgg tgtcctgatt 1920

aaaggtgggc aggctttgga aagcgctcaa aaggtgaact gtatagtgtt tgataagacg 1980

ggtacactta caatggggaa accagtcgtt gtaaatacaa ggcttttcag aactatggta 2040

cttcgagaat tttatgaatt ggttgctgca gctgaggtaa atagtgagca ccccttagcc 2100

aaggcaattg tcgaatatgc caaaaagttt agagaggatg aggagaaccc ggtatggcct 2160

gaaatccagg actttgagtc aataactggc catggcgtga aggctattgt ccacagcaag 2220

aaagtaatag ttggaaacaa gagcttgatg ttagcacaag gcatttctgt ttcagctgat 2280

gccgatgaag ttctagctga aacagaagaa ttggctcaaa ctggaatact tgtatcagtt 2340

gatggtgtac tgactggagt tgttgctata tcagatcctg tgaagcccgg agctcgtgaa 2400

gtcatttctc ttcttaagtc tatgaatgtc gagagtaaac tagtaacagg tgacaattgg 2460

ggaacagcta atgccattgc caaggaagtt ggcattacgg atgttattgc agaagcaaaa 2520

cctgaagaca aagcagaaaa agtgaaggaa ttgcagagtt caggaaaagt tgttgcaatg 2580

gtcggagatg gaattaacga ttctccagct ctcgtagcag cagatgttgg aatggcaata 2640

ggggcgggga cagatatagc tattgaggca gctgatattg tcctaatgaa aagcaatctg 2700

gaagatgtca taactgctat tgacctttcc aggaaaacat ttggtcgaat tcgtctgaac 2760

tacttttggg catttggcta taaccttctt ggcatcccaa ttgctgctgg agctcttttc 2820

ccatctacta gatttcgcct gccaccgtgg gtagcaggtg cagcaatggc tgcttcttca 2880

gtgagtgttg tctgcagctc tcttttgttg aagaattaca cgagaccaaa gaagcttgat 2940

aatcttggga ttggaggcat aactgttgag tga 2973

<210> 2

<211> 990

<212> PRT

<213> SEQ ID NO：2(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Ala Lys Phe Leu Ser Phe Ala Cys Ile Arg Asn Glu Ser

1 5 10 15

Lys Tyr Gly Asp Phe Ser Ser Arg Pro His Tyr Pro Ser Met Pro Lys

20 25 30

Tyr Pro Lys Gly Val Thr Ile Ser Thr Asp Glu Glu Lys Ser Ile His

35 40 45

Gly Thr Glu Ser Lys Ala Ile Tyr Ser Val His Gly Met Ser Cys Ser

50 55 60

Ala Cys Ala Gly Ser Val Glu Lys Ala Ile Lys Arg Leu Ala Gly Ile

65 70 75 80

Lys Glu Ala Val Val Asp Val Leu Asn Asn Arg Ala Gln Val Ile Phe

85 90 95

Tyr Pro Ser Tyr Val Asn Glu Glu Met Ile Arg Glu Thr Ile Glu Asp

100 105 110

Val Gly Phe Gln Ala Thr Leu Ile Thr Glu Glu Ala Thr Glu Lys Ser

115 120 125

Ser Gln Val Cys Arg Ile Arg Ile Lys Gly Met Thr Cys Thr Ser Cys

130 135 140

Ser Thr Thr Val Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ile Pro Gly Val Gln Lys

145 150 155 160

Ala Gln Val Ala Leu Ala Thr Glu Glu Ala Glu Ile Gln Tyr Asp Pro

165 170 175

Arg Ile Leu Thr Tyr Asn Gln Leu Leu Glu Thr Ile Glu Asn Thr Gly

180 185 190

Phe Glu Ala Ile Leu Ile Ser Thr Gly Glu Asp Arg Ser Lys Ile Leu

195 200 205

Leu Lys Ile Asp Gly Val His Thr Gly Asp Ser Met Arg Ile Ile Glu

210 215 220

Ser Ser Leu Arg Ala Leu Pro Gly Val Glu Asp Ile Asp Ile Asp Pro

225 230 235 240

Glu Leu Lys Lys Leu Ser Val Ser Tyr Lys Ser Asp Ile Ile Gly Pro

245 250 255

Arg Asp Phe Ile Arg Val Ile Glu Ser Thr Gly Ser Gly Gln Phe Asn

260 265 270

Ala Met Leu Tyr Pro Glu Gly Gly Gly Glu Gln Ser His Arg Gln Glu

275 280 285

Glu Ile Gly Asn Tyr Arg Arg Ser Phe Leu Trp Ser Leu Phe Phe Thr

290 295 300

Ile Pro Val Phe Leu Thr Ser Met Val Phe Met Tyr Ile Pro Gly Leu

305 310 315 320

Lys Asp Gly Leu Asp Ile Lys Val Val Asn Met Leu Ser Ile Gly Glu

325 330 335

Ile Leu Arg Trp Val Leu Ser Thr Pro Val Gln Phe Ile Ile Gly Arg

340 345 350

Arg Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Lys Ala Leu Arg His Gly Ser Ala Asn

355 360 365

Met Asp Val Leu Ile Ala Leu Gly Thr Asn Ala Ala Tyr Phe Tyr Ser

370 375 380

Val Tyr Ser Val Leu Arg Ala Ala Thr Ser Pro Ser Phe Lys Ser Thr

385 390 395 400

Asp Phe Phe Glu Thr Ser Ser Met Leu Ile Ser Phe Ile Leu Leu Gly

405 410 415

Lys Tyr Leu Glu Val Leu Ala Lys Gly Lys Thr Ser Glu Ala Ile Ala

420 425 430

Lys Leu Met Asn Leu Thr Pro Asp Thr Ala Thr Leu Leu Gln His Gly

435 440 445

Asp Glu Gly Asn Val Val Asn Glu Glu Glu Ile Asp Ser Arg Leu Ile

450 455 460

Gln Lys Asn Asp Val Ile Arg Ile Val Pro Gly Ala Lys Val Ala Cys

465 470 475 480

Asp Gly Phe Val Ile Trp Gly Gln Ser His Val Asn Glu Ser Met Ile

485 490 495

Thr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Lys Arg Lys Gly Asp Ile Val Ile

500 505 510

Gly Gly Thr Val Asn Glu Asn Gly Val Leu His Ile Arg Ala Thr Arg

515 520 525

Val Gly Ser Glu Ser Ala Leu Ser Gln Ile Val Arg Leu Val Glu Ser

530 535 540

Ala Gln Met Ala Lys Ala Pro Val Gln Lys Phe Ala Asp Gly Ile Ser

545 550 555 560

Lys Tyr Phe Val Pro Leu Val Ile Ile Val Ser Phe Ser Thr Trp Leu

565 570 575

Ala Trp Phe Leu Ala Gly Lys Tyr Ala Ala Tyr Pro Lys Ser Trp Ile

580 585 590

Pro Ser Ser Met Asp Ser Phe Gln Leu Ala Leu Gln Phe Gly Ile Ser

595 600 605

Val Met Val Ile Ala Cys Pro Cys Ala Leu Gly Leu Ala Thr Pro Thr

610 615 620

Ala Val Met Val Gly Thr Gly Val Gly Ala Ser Arg Gly Val Leu Ile

625 630 635 640

Lys Gly Gly Gln Ala Leu Glu Ser Ala Gln Lys Val Asn Cys Ile Val

645 650 655

Phe Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Met Gly Lys Pro Val Val Val Asn

660 665 670

Thr Arg Leu Phe Arg Thr Met Val Leu Arg Glu Phe Tyr Glu Leu Val

675 680 685

Ala Ala Ala Glu Val Asn Ser Glu His Pro Leu Ala Lys Ala Ile Val

690 695 700

Glu Tyr Ala Lys Lys Phe Arg Glu Asp Glu Glu Asn Pro Val Trp Pro

705 710 715 720

Glu Ile Gln Asp Phe Glu Ser Ile Thr Gly His Gly Val Lys Ala Ile

725 730 735

Val His Ser Lys Lys Val Ile Val Gly Asn Lys Ser Leu Met Leu Ala

740 745 750

Gln Gly Ile Ser Val Ser Ala Asp Ala Asp Glu Val Leu Ala Glu Thr

755 760 765

Glu Glu Leu Ala Gln Thr Gly Ile Leu Val Ser Val Asp Gly Val Leu

770 775 780

Thr Gly Val Val Ala Ile Ser Asp Pro Val Lys Pro Gly Ala Arg Glu

785 790 795 800

Val Ile Ser Leu Leu Lys Ser Met Asn Val Glu Ser Lys Leu Val Thr

805 810 815

Gly Asp Asn Trp Gly Thr Ala Asn Ala Ile Ala Lys Glu Val Gly Ile

820 825 830

Thr Asp Val Ile Ala Glu Ala Lys Pro Glu Asp Lys Ala Glu Lys Val

835 840 845

Lys Glu Leu Gln Ser Ser Gly Lys Val Val Ala Met Val Gly Asp Gly

850 855 860

Ile Asn Asp Ser Pro Ala Leu Val Ala Ala Asp Val Gly Met Ala Ile

865 870 875 880

Gly Ala Gly Thr Asp Ile Ala Ile Glu Ala Ala Asp Ile Val Leu Met

885 890 895

Lys Ser Asn Leu Glu Asp Val Ile Thr Ala Ile Asp Leu Ser Arg Lys

900 905 910

Thr Phe Gly Arg Ile Arg Leu Asn Tyr Phe Trp Ala Phe Gly Tyr Asn

915 920 925

Leu Leu Gly Ile Pro Ile Ala Ala Gly Ala Leu Phe Pro Ser Thr Arg

930 935 940

Phe Arg Leu Pro Pro Trp Val Ala Gly Ala Ala Met Ala Ala Ser Ser

945 950 955 960

Val Ser Val Val Cys Ser Ser Leu Leu Leu Lys Asn Tyr Thr Arg Pro

965 970 975

Lys Lys Leu Asp Asn Leu Gly Ile Gly Gly Ile Thr Val Glu

980 985 990

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：3(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgagcacag aattaatacg actcactata ggtttttttt ttttttt 47

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：4(Artificial Sequence)

<400> 4

caaggcaatt gtcgaatatg cc 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：5(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgagcacag aattaatacg act 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：6(Artificial Sequence)

<400> 6

ctgtttcagc tgatgccggt 20

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：7(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatccg aattaatacg actcactata gg 32

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：8(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc aatggcaact gcaaagtttc tttc 54

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.9(Artificial Sequence)

<400> 9

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cactcaacag ttatgcctcc aatc 54

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.10(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcaagaaac tttgcagttg cca 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.11(Artificial Sequence)

<400> 11

aaactggcaa ctgcaaagtt tct 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.12(Artificial Sequence)

<400> 12

attggctact ctgattacag agg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.13(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaccctctg taatcagagt agc 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.14(Artificial Sequence)

<400> 14

atgttgaccg gtaaggcgcg 20

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.15(Artificial Sequence)

<400> 15

aaacttgcag aatggctaga gtca 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.16(Artificial Sequence)

<400> 16

ccatagtcgg ttgatcaaat gt 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.17(Artificial Sequence)

<400> 17

atgagcactg ctattcaaga atc 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.18(Artificial Sequence)

<400> 18

caacaacagc ttctttaata ccag 24

Claims

1.一种重金属转运蛋白PhHMA5II-1，其特征在于，所述蛋白为由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白。

2.与如权利要求1所述蛋白相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：

a)编码如权利要求1所述蛋白的多核苷酸；

b)含有a)所述多核苷酸的重组表达载体；

c)含有a)所述多核苷酸的生物工程菌，或含有b)所述重组表达载体的生物工程菌。

3.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，a)中，所述多核苷酸的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列。

4.如权利要求1所述的蛋白作为靶标用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力中的用途，所述提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力是通过使植物中所述蛋白失活或功能下降获得，所述植物为矮牵牛。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途还包括促进植物生长和/或提高花瓣重量。

6.如权利要求1所述的蛋白或如权利要求2或3所述的生物材料在筛选用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力产品中的用途，所述提高对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力是通过使植物中所述蛋白失活或功能下降获得，所述植物为矮牵牛。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述用途还包括促进植物生长和/或提高花瓣的重量。

8.一种用于提高植物对重金属耐受性或提高植物重金属转运能力的产品，其特征在于，所述产品为PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体，所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体是指使权利要求1所述的蛋白PhHMA5II-1突变或失活或功能下降的编辑***，所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体为：1)选择PhHMA5II-1基因的编码区如SEQ ID NO.10所示序列和如SEQ ID NO.12所示序列，作为CRISPR/Cas9***的靶序列；2)将所述靶序列与载体片段pYLCRISPR/Cas9进行连接，得到所述PhHMA5II-1基因干扰核酸构建体。

9.一种制备植物突变体的方法，其特征在于，向植物导入权利要求8所述的产品，得到植物突变体，所述植物为矮牵牛。

10.一种培育对重金属耐受性高或对重金属转运能力高的植物的方法，其特征在于，在铜胁迫下，种植如权利要求9所述的方法得到的植物突变体，进行培育。

11.如权利要求4-7任一项所述的用途，其特征在于，所述重金属包括铜、锌、锰和铁。