CN114088588B - 一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，包括制作生物样本溶液；搭建无透镜成像图像采集***；使光线照射在微流控芯片上；采集红细胞的衍射图像；建立衍射光强模型；建立弧边衍射光强模型；建立红细胞的三维尺寸测量模型；采集待测红细胞的衍射图样，利用红细胞三维尺寸测量模型识别并估计出红细胞的大小和厚度。本发明利用红细胞在无透镜成像***微流控芯片内的运动过程中，特殊姿态下对应的衍射环图案，实现红细胞的三维尺寸的测量。
Description
技术领域
本发明属于医疗诊断和图像分析技术领域，涉及一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法。
背景技术
红细胞(RBC)大小是医学诊断的重要参数。全血细胞计数(CBC)是医生为临床诊断和预后所规定的常用血液检查方法之一。在国际血液学标准化理事会(ICSH)2014年《血细胞分析仪评估指南》中，与红细胞大小相关的参数，如红细胞分布宽度(RDW)也被确定为CBC的一部分。
目前主要通过两种方法对血细胞进行检测测量，一种是人工的方法，使用光学显微镜进行细胞检测；另一种是借助流式细胞仪进行细胞检测。但是这两种方法的检测设备都存在其体积大，价格昂贵，对操作人员专业知识要求高等问题。这些问题限制了血细胞检测在即时检测(Point-Of-Care Testing，POCT)方面的可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，利用红细胞在无透镜成像***微流控芯片内的运动过程中，特殊姿态下对应的衍射环图案，实现红细胞的三维尺寸的测量。
本发明所采用的技术方案是：一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，无透镜成像***包括光源、微流控芯片和CMOS图像传感器，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制作生物样本溶液；
步骤2、搭建无透镜成像图像采集***，将微流控芯片固定于CMOS图像传感器上，确定单色光源和传感器之间的距离；
步骤3、将生物样本通入微流控芯片中，打开单色光源，使光线照射在微流控芯片上；
步骤4、生物样本在微流控芯片中移动稳定后，打开图像采集装置，利用CMOS图像传感器采集红细胞的衍射图像；
步骤5、根据无透镜成像***的特点以及红细胞的形态特点，采用菲涅尔直边衍射理论，建立衍射光强模型；
步骤6、根据菲涅尔直边衍射光强模型，建立弧边衍射光强模型；
步骤7、考虑衍射叠加和光强衰减建立红细胞的三维尺寸测量模型；
步骤8、采集待测红细胞的衍射图样，利用红细胞三维尺寸测量模型识别并估计出红细胞的大小和厚度。
本发明的特点还在于，
单色光源为点光源或平行光源。
步骤5具体为：
红细胞为准球形细胞，其衍射边缘不是标准的圆，因此红细胞边缘任意一点的衍射可以看作为该点切线上的衍射。符合直边菲涅尔衍射，衍射发生在以锐利直边为界的半无限平面上，成像平面上的光强I，即直边菲涅尔衍射模型表示为：
式(1)中，I0是平均光强，C(w)、S(w)为菲涅耳积分；
C(w)、S(w)表示为：
式(3)中，r'是光源到生物细胞样品的距离，s'是生物细胞样品到CMOS图像传感器的距离，x是红细胞的衍射图像中衍射环到真实红细胞边界的距离，λ为光波长。
步骤6具体为：
对于弧形边缘，衍射光具有更大的扩散空间，因此衍射光强的衰减大于直线边缘的衍射光强。由于弧边上任意一点的衍射看作是在该点的切线上的衍射，基于直边菲涅耳衍射，考虑振幅衰减、周期变化，弧边衍射光强分布即弧边衍射模型表示为：
式(4)中，Iarc为弧边衍射光强，α是衰减系数；
根据弧边衍射光强积分面积与直边衍射光强积分面积之差得到
其中Rarc是弧边的半径，x是弧边到弧中心的距离，因此，衰减系数α表示为
步骤7具体按照以下步骤实施：
步骤7.1、根据菲涅尔衍射理论，红细胞的衍射图像中第一亮环的半径大于红细胞的直径，因此，红细胞衍射图像是多位置衍射叠加的结果，衍射叠加会影响红细胞衍射图像的光强分布，以红细胞的中心为坐标原点，红细胞的衍射图像的叠加光强分布即无透镜成像光强模型表示为：
式(7)中，Icell是准球细胞的衍射图的绝对光强分布；
步骤7.2、构建红细胞三维尺寸测量模型
衍射图案是积分的结果，对于一动点，被积函数的实部和虚部都会多次改变符号，因此，各元素的贡献通常会相互抵消，相消干涉，但对于一个静止点的元素来说，该静止点称为临界点或极点，其被积函数的变化很慢，各元素的贡献不会相互抵消；
微流控芯片中的细胞有两种移动模式，平移和翻转，平移不会改变发生衍射的边缘上点的相对位置，不会影响衍射图案的光强分布，翻转会改变发生衍射的边缘上点的相对位置，衍射图案的光强分布呈现出周期性的变化规律，根据衍射图案的光强分布特点识别红细胞；
确定红细胞的鞍点A、A'、B、B'即为静止点，鞍点A、A'、B、B'均位于红细胞的圆盘边缘，AA'的连线和BB'的连线均为圆盘直径且相互垂直，当红细胞以BB'为轴翻转，在B和B'点其具有较大的相对位移，因此在点B和B'处，衍射图像的光强较小，其对应于红细胞衍射图像的第一亮环的最小光强点，而在A和A'处，其相对位置未发生改变，其对应于衍射图像的第一亮环的最大光强点，利用该特点作为红细胞三维尺寸测量模型用于红细胞识别，即当BB'方向上有两个光强最小点，AA'方向上有两个光强最大点时，则该细胞为红细胞；
由于红细胞的形状是双凹圆盘，当红细胞以BB'为轴旋轴时，红细胞翻转到细胞圆盘表面与光源方向垂直时，在A、A'、B、B'的衍射图案具有相同的衍射环位置，根据红细胞三维尺寸测量模型，A、A'点处衍射图案第一个亮环的半径R1即为红细胞的半径r，测量R1获得红细胞的半径r；当红细胞翻转使双凹圆盘表面与光源方向平行时，在B、B'的衍射图案光强达到最小值，A、A'点处衍射图案第一个亮环的半径R2即为红细胞的厚度h，测量R2获得红细胞的厚度h，在该姿态下，B和B'圆弧半径较小，且是红细胞的旋转轴，其衍射图案不能实现有效的叠加，通过B、B'点处衍射图案第一个亮环的半径R3和细胞半径的关系测量红细胞的半径r。
步骤8具体为：
通过图像采集装置采集微流控芯片中不同时间红细胞翻转的衍射图象，计算衍射图像的第一个亮环的光强大小，根据构建的红细胞三维尺寸测量模型，当BB'方向上有两个光强最小点，AA'方向上有两个光强最大点，可以判断该细胞为红细胞。当在A、A'、B、B'四点的衍射图案光强相同时，此时根据红细胞三维尺寸测量模型测量出红细胞的半径，当在点A和A'衍射图案光强最大，B和B'衍射图案光强最小时，此时根据红细胞三维尺寸测量模型，利用A和A'处衍射图案的第一亮环的半径，测量出红细胞的厚度。
本发明的有益效果是：
本发明一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，能够利用红细胞在微流控芯片中移动时，通过周期性特征确定红细胞在微流控芯片中的姿态，然后利用特殊姿态下衍射图像获得红细胞的三维尺寸；该方法非常适合于微流控芯片和无透镜成像相结合的POTC，能够解决红细胞在微流控中三维尺寸无法确定的问题，操作简单，实时性高，对于医学诊断具有重要意义。
附图说明
图1是本发明一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法所应用的无透镜成像***的结构示意图；
图2是本发明一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法步骤7中红细胞翻转模型侧视俯视对应示意图，其中，图2(a)是红细胞翻转到细胞圆盘表面与光源方向垂直时的侧视俯视对应示意图，图2(b)是红细胞翻转使双凹圆盘表面与光源方向平行时的侧视俯视对应示意图；
图3是本发明一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法步骤7中两种典型姿势下第一个亮环在不同位置的位置示意图，其中，图3(a)是红细胞翻转到细胞圆盘表面与光源方向垂直时第一个亮环的位置示意图，图3(b)是红细胞翻转使双凹圆盘表面与光源方向平行时第一个亮环的位置示意图。
图中，9.单色光源，10.微孔，11.凸透镜，12.遮光板，13.微流控芯片，14.CMOS图像传感器。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，如图1所示，无透镜成像***包括光源、微流控芯片和CMOS图像传感器，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制作特定溶度的生物样本溶液。
步骤2、搭建无透镜成像图像采集***，将微流控芯片固定于CMOS图像传感器上，确定单色光源和传感器之间的距离。
步骤3、将生物样本通入微流控芯片中，打开单色光源，所述单色光源为点光源或平行光源，使光线照射在微流控芯片上。
步骤4、生物样本在微流控芯片中移动稳定后，打开图像采集装置，利用CMOS图像传感器采集红细胞的衍射图像。
步骤5、根据无透镜成像***的特点以及红细胞的形态特点，采用菲涅尔直边衍射理论，建立衍射光强模型；
所述步骤5具体为：
红细胞为准球形细胞，其衍射边缘不是标准的圆，因此红细胞边缘任意一点的衍射可以看作为该点切线上的衍射。符合直边菲涅尔衍射，衍射发生在以锐利直边为界的半无限平面上，成像平面上的光强I，即直边菲涅尔衍射模型表示为：
式(1)中，I0是平均光强，C(w)、S(w)为菲涅耳积分；
C(w)、S(w)表示为：
式(3)中，r'是光源到生物细胞样品的距离，s'是生物细胞样品到CMOS图像传感器的距离，x是红细胞的衍射图像中衍射环到真实红细胞边界的距离，λ为光波长。
步骤6、根据菲涅尔直边衍射光强模型，建立弧边衍射光强模型；
所述步骤6具体为：
对于弧形边缘，衍射光具有更大的扩散空间，因此衍射光强的衰减大于直线边缘的衍射光强。由于弧边上任意一点的衍射看作是在该点的切线上的衍射，基于直边菲涅耳衍射，考虑振幅衰减、周期变化，弧边衍射光强分布即弧边衍射模型表示为：
式(4)中，Iarc为弧边衍射光强，α是衰减系数；
根据弧边衍射光强积分面积与直边衍射光强积分面积之差得到
其中Rarc是弧边的半径，x是弧边到弧中心的距离，因此，衰减系数α表示为
步骤7、考虑衍射叠加和光强衰减建立红细胞的三维尺寸测量模型；
步骤7.1、根据菲涅尔衍射理论，红细胞的衍射图像中第一亮环的半径大于红细胞的直径，因此，红细胞衍射图像是多位置衍射叠加的结果，衍射叠加会影响红细胞衍射图像的光强分布，以红细胞的中心为坐标原点，红细胞的衍射图像的叠加光强分布即无透镜成像光强模型表示为：
式(7)中，Icell是准球细胞的衍射图的绝对光强分布；
步骤7.2、构建红细胞三维尺寸测量模型
衍射图案是积分的结果，对于一动点，被积函数的实部和虚部都会多次改变符号，因此，各元素的贡献通常会相互抵消，相消干涉，但对于一个静止点的元素来说，该静止点称为临界点或极点，其被积函数的变化很慢，各元素的贡献不会相互抵消；
微流控芯片中的细胞有两种移动模式，平移和翻转，平移不会改变发生衍射的边缘上点的相对位置，不会影响衍射图案的光强分布，翻转会改变发生衍射的边缘上点的相对位置，衍射图案的光强分布呈现出周期性的变化规律，根据衍射图案的光强分布特点识别红细胞；
如图2所示，确定红细胞的鞍点A、A'、B、B'即为静止点，鞍点A、A'、B、B'均位于红细胞的圆盘边缘，AA'的连线和BB'的连线均为圆盘直径且相互垂直，当红细胞以BB'为轴翻转，在B和B'点其具有较大的相对位移，因此在点B和B'处，衍射图像的光强较小，其对应于红细胞衍射图像的第一亮环的最小光强点，而在A和A'处，其相对位置未发生改变，其对应于衍射图像的第一亮环的最大光强点，利用该特点作为红细胞三维尺寸测量模型用于红细胞识别，即当BB'方向上有两个光强最小点，AA'方向上有两个光强最大点时，则该细胞为红细胞；
由于红细胞的形状是双凹圆盘，当红细胞以BB'为轴旋轴时，红细胞翻转到细胞圆盘表面与光源方向垂直时，如图2(a)所示，在该姿态下，在A、A'、B、B'的衍射图案具有相同的衍射环位置，其衍射光强分布如图3(a)所示，根据红细胞三维尺寸测量模型，A、A'点处衍射图案第一个亮环的半径R1即为红细胞的半径r，测量R1获得红细胞的半径r；当红细胞翻转使双凹圆盘表面与光源方向平行时，如图2(b)所示，在该姿态下，在B、B'的衍射图案光强达到最小值，其衍射光强分布如图3(b)所示，A、A'点处衍射图案第一个亮环的半径R2即为红细胞的厚度h，测量R2获得红细胞的厚度h，在该姿态下，B和B'圆弧半径较小，且是红细胞的旋转轴，其衍射图案不能实现有效的叠加，通过B、B'点处衍射图案第一个亮环的半径R3和细胞半径的关系测量红细胞的半径r。
步骤8、采集待测红细胞的衍射图样，利用红细胞三维尺寸测量模型识别并估计出红细胞的大小和厚度。
通过图像采集装置采集微流控芯片中不同时间红细胞翻转的衍射图象，计算衍射图像的第一个亮环的光强大小，根据构建的红细胞三维尺寸测量模型，当BB'方向上有两个光强最小点，AA'方向上有两个光强最大点，可以判断该细胞为红细胞。当在A、A'、B、B'四点的衍射图案光强相同时，此时根据红细胞三维尺寸测量模型测量出红细胞的半径，当在点A和A'衍射图案光强最大，B和B'衍射图案光强最小时，此时根据红细胞三维尺寸测量模型，利用A和A'处衍射图案的第一亮环的半径，测量出红细胞的厚度。
Claims (4)
1.一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，无透镜成像***包括光源、微流控芯片和CMOS图像传感器，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、制作生物样本溶液；
步骤2、搭建无透镜成像图像采集***，将微流控芯片固定于CMOS图像传感器上，确定单色光源和传感器之间的距离；
步骤3、将生物样本通入微流控芯片中，打开单色光源，使光线照射在微流控芯片上；
步骤4、生物样本在微流控芯片中移动稳定后，打开图像采集装置，利用CMOS图像传感器采集红细胞的衍射图像；
步骤5、根据无透镜成像***的特点以及红细胞的形态特点，采用菲涅尔直边衍射理论，建立衍射光强模型；
步骤6、根据菲涅尔直边衍射光强模型，建立弧边衍射光强模型；
步骤7、考虑衍射叠加和光强衰减建立红细胞的三维尺寸测量模型；
所述步骤7具体按照以下步骤实施：
步骤7.1、根据菲涅尔衍射理论，红细胞的衍射图像中第一亮环的半径大于红细胞的直径，因此，红细胞衍射图像是多位置衍射叠加的结果，衍射叠加会影响红细胞衍射图像的光强分布，以红细胞的中心为坐标原点，红细胞的衍射图像的叠加光强分布即无透镜成像光强模型表示为：
（7）
式（7）中，是准球细胞的衍射图的绝对光强分布，/>是平均光强，/>为弧边衍射光强，/>是弧边的半径，/>是弧边到弧中心的距离；
步骤7.2、构建红细胞三维尺寸测量模型
衍射图案是积分的结果，对于一动点，被积函数的实部和虚部都会多次改变符号，因此，各元素的贡献通常会相互抵消，相消干涉，但对于一个静止点的元素来说，该静止点称为临界点或极点，其被积函数的变化很慢，各元素的贡献不会相互抵消；
微流控芯片中的细胞有两种移动模式，平移和翻转，平移不会改变发生衍射的边缘上点的相对位置，不会影响衍射图案的光强分布，翻转会改变发生衍射的边缘上点的相对位置，衍射图案的光强分布呈现出周期性的变化规律，根据衍射图案的光强分布特点识别红细胞；
确定红细胞的鞍点A、A'、B、B'即为静止点，鞍点A、A'、B、B'均位于红细胞的圆盘边缘，AA'的连线和BB'的连线均为圆盘直径且相互垂直，当红细胞以BB'为轴翻转，在B和B'点其具有较大的相对位移，因此在点B和B'处，衍射图像的光强较小，其对应于红细胞衍射图像的第一亮环的最小光强点，而在A和A'处，其相对位置未发生改变，其对应于衍射图像的第一亮环的最大光强点，利用该特点作为红细胞三维尺寸测量模型用于红细胞识别，即当BB'方向上有两个光强最小点，AA'方向上有两个光强最大点时，则该细胞为红细胞；
由于红细胞的形状是双凹圆盘，当红细胞以BB'为轴旋轴时，红细胞翻转到细胞圆盘表面与光源方向垂直时，在 A、A'、B、B'的衍射图案具有相同的衍射环位置，根据红细胞三维尺寸测量模型，A、A'点处衍射图案第一个亮环的半径即为红细胞的半径r，测量/>获得红细胞的半径r；当红细胞翻转使双凹圆盘表面与光源方向平行时，在B、B'的衍射图案光强达到最小值， A、A'点处衍射图案第一个亮环的半径/>即为红细胞的厚度h，测量/>获得红细胞的厚度h，在该姿态下，B和B'圆弧半径较小，且是红细胞的旋转轴，其衍射图案不能实现有效的叠加，通过B、B'点处衍射图案第一个亮环的半径/>和细胞半径的关系测量红细胞的半径r；
步骤8、采集待测红细胞的衍射图样，利用红细胞三维尺寸测量模型识别并估计出红细胞的大小和厚度；
所述步骤8具体为：
通过图像采集装置采集微流控芯片中不同时间红细胞翻转的衍射图象，计算衍射图像的第一个亮环的光强大小，根据构建的红细胞三维尺寸测量模型，当BB'方向上有两个光强最小点，AA'方向上有两个光强最大点，可以判断该细胞为红细胞；当在A、A'、 B、B'四点的衍射图案光强相同时，此时根据红细胞三维尺寸测量模型测量出红细胞的半径，当在点A和A'衍射图案光强最大，B和B'衍射图案光强最小时，此时根据红细胞三维尺寸测量模型，利用A和A'处衍射图案的第一亮环的半径，测量出红细胞的厚度。
2.如权利要求1所述的一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，其特征在于，所述单色光源为点光源或平行光源。
3.如权利要求2所述的一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，其特征在于，所述步骤5具体为：
红细胞为准球形细胞，其衍射边缘不是标准的圆，因此红细胞边缘任意一点的衍射可以看作为该点切线上的衍射，符合直边菲涅尔衍射，衍射发生在以锐利直边为界的半无限平面上，成像平面上的光强，即直边菲涅尔衍射模型表示为：
（1）
式（1）中，是平均光强，/>、/>为菲涅耳积分；
、/>表示为：
（2）
（3）
式（3）中，是光源到生物细胞样品的距离，/>是生物细胞样品到CMOS图像传感器的距离，/>是红细胞的衍射图像中衍射环到真实红细胞边界的距离，/>为光波长。
4.如权利要求3所述的一种基于无透镜成像的红细胞三维尺寸测量方法，其特征在于，所述步骤6具体为：
对于弧形边缘，衍射光具有更大的扩散空间，因此衍射光强的衰减大于直线边缘的衍射光强，由于弧边上任意一点的衍射看作是在该点的切线上的衍射，基于直边菲涅耳衍射，考虑振幅衰减、周期变化，弧边衍射光强分布即弧边衍射模型表示为：
（4）
式（4）中，为弧边衍射光强，/>是衰减系数；
根据弧边衍射光强积分面积与直边衍射光强积分面积之差得到
（5）
其中是弧边的半径，/>是弧边到弧中心的距离，因此，衰减系数/>表示为
（6）。
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