CN114085291B

CN114085291B - 一种降低或消除重组蛋白cex酸性峰的方法

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Publication number: CN114085291B
Application number: CN202210057229.3A
Authority: CN
Inventors: 汤玉环; 董无善; 欧阳子均; 李纲
Original assignee: Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-01-19
Also published as: CN114085291A

Abstract

本发明针对含有GS类连接子的重组蛋白纯化后存在影响生物活性酸性峰的技术问题，根据酸性峰的产生受GS类连接子中丝氨酸残基上以木糖为核心的O‑糖基化修饰影响的机理，提供了一种除去重组蛋白酸性峰的方法，采用多模式阴离子交换层析，除去O‑木糖修饰酸性变异体，通过阳离子交换色谱鉴定重组蛋白酸性峰降低至30%以下。本发明所述方法尤其适用于重组双特异性抗体（例如抗NKG2A/PD‑L1双特异性抗体）亲和层析后的进一步纯化。

Description

一种降低或消除重组蛋白CEX酸性峰的方法

技术领域

本发明涉及药物纯化工艺研究领域，特别是涉及一种降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法。具体而言，本发明涉及一种降低或消除重组人源化抗NKG2A和PD-L1双特异性抗体（6MW3411双抗）中含O-木糖修饰的酸性变异体的纯化方法。

背景技术

近几年来，肿瘤免疫治疗取得了前所未有的成功，仍只有少数患者表现出持久的疗效。改善临床响应以及克服耐药机制是肿瘤免疫治疗领域正面临的挑战，而阻断其它抑制性免疫受体可能是一种可行的策略。

NKG2A（killer cell lectin like receptor C1）又名KLRC1或CD159A，是一类II型跨膜蛋白，属于NKG2/CD94自然杀伤细胞凝集素受体家族。NKG2A在胞外具有识别碳水化合物的结构域CRD(Carbohydrate-recognitiondomain，通常由115-130个氨基酸组成，含2-3个二硫键，有2-3个N连接的糖基化位点，其配体识别的过程往往是Ca2+依赖性的)。NKG2A主要在NK细胞、NKT细胞以及T细胞中表达；相对分子质量为43000，由233个氨基酸组成，其胞外区有135个氨基酸。NKG2A通过与其配体HLA-E的相互作用来抑制免疫细胞的激活。HLA-E广泛表达于头颈癌、肺癌、***癌以及结直肠癌等多种肿瘤细胞表面，而免疫细胞释放的IFN-γ会进一步上调HLA-E的表达（J Clin Invest. 2019; 129(5): 2094-2106）。与其它受体-配体（如PD-1/PD-L1）类似，NKG2A/HLA-E这对免疫检查点也是肿瘤免疫逃逸的重要信号通路，阻断NKG2A/HLA-E之间的相互作用成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的靶点。目前有多家公司（如Innate Pharma/Novo Nordisk/AstraZeneca 和 ChemPartner）开发了针对NKG2A的单克隆抗体，通过阻断NKG2A/HLA-E的相互作用来提高NK细胞以及T细胞的免疫活性来杀伤肿瘤细胞。

最新的研究发现，NKG2A与PD-1在头颈癌及黑色素瘤浸润性的CD8+ T细胞上共表达，同时阻断NKG2A/HLA-E及PD-1/PD-L1两条信号通路有很强的协同抗肿瘤作用（Cell.2018; 175: 1-13, Cell. 2018; 175: 1744-1755）。同时针对多种靶点进行治疗对提高肿瘤免疫治疗的响应率及降低免疫耐受有积极的作用。目前针对NKG2A的治疗性抗体对抗原的亲和力不足、结合NKG2A单靶点对肿瘤的治疗效果不佳，全球范围内尚没有针对NKG2A的上市药物。法国Paoli-Calmettes研究院正在推进一项人源化抗NKG2A单抗IPH2201与同种异体干细胞移植联用治疗血液恶性肿瘤的I期临床安全性实验（NCT02921685）。申请人已经通过构建轻重链突变抗体库进行亲和力提高和/或解离常数改善的突变抗体，将突变抗体的CDRs区构建人Fab重链基因表达载体和含人κ亚类轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中，将亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对，筛选获得抗NKG2A的突变Fab抗体，连接人抗体Fc段。将抗PD-L1纳米抗体通过linker连接到Fc段的C端，获得对NKG2A和PD-L1具有双特异性的抗体。

与普通抗体相比，双特异抗体具有特异性好、靶向性强、起效剂量低、毒副作用小等优点，在肿瘤的临床治疗意义重大。人源化重组双特异性抗体为非天然结构的生物大分子，在重组表达的翻译后修饰、折叠、组装、细胞内转运、分泌等过程中面临多种不确定因素。申请人针对前期研发的抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体的结构和纯化方法研究发现，采用本领域常用的抗体纯化方法（亲和层析、阴离子层析和阳离子层析）纯化抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体仍存在较高水平的酸性峰。这些酸性峰的存在不仅影响双特异性抗体制剂的理化性能，而且在临床研究中还会影响双特异性抗体药物的安全性及有效性。

对于双特异抗体酸性峰问题，申请人以抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体6MW3411为研究对象结合现有技术进行结构分析，推测其中采用的连接子是导致酸性峰产生的因素之一。6MW3411双抗含有(GGGGS)₄连接子，用于连接抗NKG2A抗体重链的C端与抗PD-L1纳米抗体（VHH）。(GGGGS)_n n≥2是人工设计的连接子，在融合蛋白、双特异性抗体等大分子药物中已被广泛应用。如已在FDA和EMA上市的Amgen的双抗药物Blincyto®（通用名Blinatumomab），使用了(GGGGS)₃作为连接两个scFv的连接子。此类GS连接子普遍存在S上以木糖（xylose）为核心的O-糖基化修饰情况，这种O-糖基化修饰不仅导致双抗产生电荷异质性、表现为酸性变异体，而且还可能会对药物的免疫原性产生一定的影响、通过异源性激发不希望的免疫应答。

发明内容

针对含有GS类连接子的重组蛋白中存在酸性峰、影响生物活性的技术问题，本发明以抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体6MW3411为例，首先通过阳离子交换树脂证实了采用常规三步层析法纯化的双特异性抗体产品中存在酸性峰；然后对收集的酸性峰进行质谱分析发现所述酸性峰中6MW3411双抗的(GGGGS)₄连接子上存在三种不同形式的O-木糖修饰；进而通过对不同复合模式离子层析填料进行筛选，确定以纳微的NM90 Agarose HAM填料制备复合模式离子层析柱能够减少酸性峰的种类、降低酸性峰的比例。因此，本发明根据重组蛋白酸性峰的产生受GS类连接子中丝氨酸残基上以木糖为核心的O-糖基化修饰影响的机理，提供了一种除去重组蛋白酸性峰的方法，采用多模式阴离子交换层析，除去O-木糖修饰酸性变异体，通过阳离子交换色谱鉴定重组蛋白酸性峰降低至30%以下。本发明所述方法尤其适用于重组双特异性抗体（例如抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体）亲和层析后的进一步纯化。

具体而言：

一方面，本发明提供一种降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于将已经过常规方法纯化、CEX鉴定仍存在酸性峰的重组蛋白进一步采用复合型离子交换层析进行分离，去除所述重组蛋白的酸性变异体；

其中，所述重组蛋白分子中含有GS连接子，所述重组蛋白的酸性变异体是由GS连接子丝氨酸残基上以木糖为核心的O-糖基化修饰产生。

进一步，本发明所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述GS连接子由式(GS)n表示，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

进一步，本发明所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述GS连接子由式(GGGGS)n表示，其中n为1、2、3、4或5。

进一步，本发明所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白包括一个或多个选自下组的元件：Fc、F(ab’)2、Fab、ScFv、sdAb。

进一步，本发明所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白为重组双特异性抗体，优选重组抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体。

进一步，本发明所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白是由哺乳动物细胞***表达，所述常规方法纯化包括亲和层析纯化。

进一步，本发明所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白是以CHO为宿主细胞表达、经过亲和层析纯化的重组双特异性抗体。

进一步，本发明所述所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述复合型离子交换层析采用纳微的NM90 Agarose HAM作为填料；载量≤60 mg/mL，洗脱pH为pH 4.75±0.05。

第二方面，本发明提供复合型离子交换层析在去除重组蛋白的酸性变异体中的应用，其中，所述重组蛋白的酸性变异体是由丝氨酸残基上以木糖为核心的O-糖基化修饰产生的，所述复合型离子交换层析柱优秀采用纳微的NM90 Agarose HAM作为填料。

第三方面，本发明还提供前述任一项降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法在制备预防或治疗性生物药品中的应用。

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“NKG2A”是存在于NK、NKT和T细胞亚组中的抑制性受体，NKG2A (OMIM161555，其全部公开内容通过引用结合于本文中)是转录物的NKG2组的成员(Houchins,等(1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020)。NKG2A由跨度25kb显示出一些差别剪接的7个外显子编码。NKG2A与CD94一起形成发现于NK细胞、α/β T细胞、γ/δ T细胞和NKT细胞的亚组的表面上的异二聚体抑制性受体CD94/NKG2A。与抑制性KIR受体类似，其在其胞质结构域具有ITIM。如用于本文中，“NKG2A”指NKG2A基因或编码的蛋白的任何变体、衍生物或同种型(isoform)。还包括与野生型全长NKG2A共享一个或多个生物学性质或功能，并共享至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序列。人NKG2A在3个结构域中包含233个氨基酸，其中胞质结构域包含残基1-70，跨膜区包含残基71-93，和胞外区包含残基94-233。

术语“PD-L1”，即PD-L1(programmed death ligand 1)全称程序性死亡受体配体1，也称为表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）或 B7同源体（B7homolog 1，B7-H1），由CD274基因编码，是PD-1（programmed cell death 1,程序性死亡受体1）的配体。PD-L1 是大小为 40kDa 的第一型跨膜蛋白，表达在T细胞、B细胞等免疫细胞以及肿瘤细胞上，正常情形下免疫***会对聚集在***或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞（CD8+ Tcell增生）。当肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞等免疫细胞上的PD-1结合后，肿瘤细胞发出抑制性信号，减低***CD8+ T细胞的增殖，进而导致T细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制。

术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫***细胞(例如，效应细胞)和传统补体***的第一组分(C1q)。

术语“双特异性抗体”(bispecific antibodies)，一种可与相同或不同抗原上的不同表位结合的抗体结构。因此，双特异性抗体能够桥连两种不同的分子，起到将效应分子、效应细胞、病毒和药物载体***招募至靶标结构的作用。双特异性抗体这种可同时识别两种不同分子(受体和/或配体) 的特点，提高了抗体的选择性和功能性亲和力。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F（ab'）₂、Fv片段、单链Fv（scFv）片段和单结构域片段。

Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域（CH1）。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F（ab'）2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F（ab'）2片段缺乏完整抗体的片段可结晶（Fc）区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合（参见例如，Wahl等人，1983，J. Nucl. Med. 24:316）。

如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域（分别为CH2和CH3结构域）。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域（CH2、CH3和CH4结构域）。

“单结构域片段”，sdA（single domain antibody）由抗原显示出足够亲和力的单个VH或VL结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的（参见例如，Riechmann，1999，Journal ofImmunological Methods 231:25–38）。

术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间经历的共价修饰(共翻译修饰)或者肽在其核糖体合成之后经历的共价修饰(翻译后修饰)。PTM一般通过特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质主链内的特定特征性蛋白质序列(签名序列)的位点处。已记录了数百个PTM，且这些修饰总是影响蛋白质的结构或功能的一些方面(Walsh,G.“Proteins”(2014)second edition,published by Wiley and Sons,Ltd.,ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包括但不限于断裂、N末端扩展、蛋白质降解、N末端酰化、生物素化(用生物素酰化赖氨酸残基)、C末端酰胺化、糖基化、碘化、辅基共价连接、乙酰化(通常在蛋白质的N末端处添加乙酰基)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基(例如，甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷酰化、ADP核糖基化、多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、戊烯基化(prenylation)、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K是谷氨酸残基羧基化的辅因子，从而引起γ-羧基谷氨酸(glu残基)的形成)、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价连键)、甘氨酰化(glycylation)(甘氨酸残基的共价连键)、糖基化(向天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸中添加糖基，从而产生糖蛋白)、异戊烯基化(isoprenylation)(添加类异戊烯基团(isoprenoid)，如法尼醇(farnesol)和香叶基香叶醇(geranylgeraniol))、硫辛酰化(lipoylation)(硫辛酸根官能团的连接)、磷酸泛酰巯基乙胺基化(从辅酶a中添加4′-磷酸泛酰巯基乙胺基部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中添加)、磷酸化(添加磷酸根基团，通常添加到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸中)和硫酸化(添加硫酸根基团，通常添加到酪氨酸残基中)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包括但不限于瓜氨酸化(通过脱亚胺基化作用将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺化(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包括但不限于形成二硫桥(两个半胱氨酸氨基酸的共价连键)和蛋白水解性断裂(肽键处的蛋白质断裂)。某些翻译后修饰涉及添加其它蛋白质或肽，如ISG化(与ISG15蛋白质(干扰素刺激的基因)的共价连键)、SUMO化(与SUMO蛋白质(与泛素相关的小分子修饰剂)的共价连键)和泛素化(与蛋白质泛素的共价连键)。关于由UniProt策划的PTM的更详细的受控词汇，请参见http://www.uniprot.org/docs/ptmlist。

术语“混合模式色谱”或“多模式色谱”包括其中溶质通过超过一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱方法。MMC可用作传统反相(RP)色谱、离子交换(IEX)色谱和正相(NP)色谱的替代或补充工具。不同于其中疏水相互作用、亲水相互作用和离子相互作用分别为占主导的相互作用模式的RP、NP和IEX色谱，混合模式色谱可采用这些相互作用模式中的两种或更多种的组合。混合模式色谱介质可提供无法通过单一模式色谱重现的独特选择性。与基于亲和力的方法相比，混合模式色谱还可提供潜在的成本节约和操作灵活性。

本发明所述“复合型离子交换层析”是多模式色谱的一种具体类型，其填充介质的识别基团中即具有带电荷的离子、也具有苯环等疏水基团，其分离原理和分离效果不同于传统的离子交换层析。

术语“阳离子交换色谱”或“CEX”，填充介质带负电荷并且具有可以与通过或穿过固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。可通过将一种以上带电配体连接至固相(例如通过共价连接)来提供负电荷。替代地或另外地，电荷可为固相的固有性质(例如，二氧化硅具有整体负电荷)。阳离子交换基质(例如，CEX树脂)可被放置或填充到用于纯化蛋白质的色谱柱中。CEX是去除高分子量(HMW)蛋白质类以及宿主细胞蛋白质、DNA和残留蛋白A的有效步骤(Zeid等(2008)，Biotechnology and Bioengineering 102，971-976；Yigzaw，Y.等(2009)，Current Pharmaceutical Biotechnology 10，421-426；Gagnon，P.，Purification tools for monoclonal antibodies(单克隆抗体的纯化工具)，1996：Validated Biosystems，Inc.；Stein，A.和Kiesewetter，A.(2007)，JournalofChromatography B 848，151-158；Staby，A.等(2006)，Journal of Chromatography1118，168-179)。通常，CEX以结合-洗脱模式(BEM，bind-and-elute mode)操作，其中，在低于目标分子的pI的pH下，在低电导率条件下，蛋白质结合至CEX基质(例如，CEX树脂)。然后通常通过增加电导率和/或诱导pH变化，来实现结合蛋白的洗脱。这可通过线性梯度或逐步洗脱至预定条件来进行。通常杂质(特别是HMW类)比mAb产物结合得更紧，并且可通过调整洗脱条件和合并液收集标准，从主要所需馏分中分离出杂质(Yigzaw，Y.等(2009)，同上；Gagnon，P等(1996)，同上；Pabst，T.M.等(2009)，Journal of Chromatography 1216，7950-7956)。

术语“尺寸排阻色谱法”或“SEC”或“凝胶过滤”包括液相柱色谱技术，所述技术可根据分子在溶液中的大小来分选分子。

如本文所用，术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”在本文中可互换使用，并且可包括在SEC中使用的从所需产物分离杂质(例如，对于双特异性抗体产物为同源二聚体污染物)的任何种类的固相。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径以及动态容量和流速可取决于几个参数，诸如待处理的流体体积、待经受过程的流体中蛋白质的浓度。

术语“结合亲和力”在本文中用作为两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和力，可通过测定解离常数(KD)来定量测定。继而，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过SPR方法，来测定KD。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD = kd / ka与ka和kd相联系。根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值进行比较。类似地，可通过测定，并比较感兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与不感兴趣的相互作用的KD值，来评价相互作用的特异性。通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值，例如，通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定，例如SPR，还可评价抗体的结合动力学和结合亲和力。可进行竞争性结合测定，其中，将抗体与靶的结合，和该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合，进行比较。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x 10^-6M以下，优选5.0x 10^-8M以下，更优选1.0x 10^-8M以下、5.0x 10^-9M以下，更优选1.0x 10^-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10^-6M以下，优选10^-7M以下，更优选10^-8M以下。

术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感***例如BiacoreTM***测得。

术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

1、本发明针对常规的抗体纯化三步层析法（亲和层析、阴离子层析和阳离子层析）转用于双特异性抗体纯化时产生酸性峰的技术问题，通过结构分析、色谱和质谱鉴定，发现GS连接子上的O-木糖修饰产生的酸性变异体是形成酸性峰的主要因素之一。

2、本发明针对常规的抗体纯化三步层析法无法达到“去除O-木糖修饰酸性变异体、并控制6MW3411双抗酸性峰”的目的。为去除6MW3411双抗的O-木糖修饰酸性变异体，同时解决该双抗酸性变异体含量较高的问题。在单抗纯化制备平台工艺的基础上在亲和层析之后采用复合型离子交换层析纯化，经过条件优化可以“去除O-木糖修饰变异体，并将酸性峰控制在较低水平。

3、本发明通过对不同类型多模式层析填料进行筛选，纳微的NM90 Agarose HAM填料具有较好的优势，并对该填料的洗脱pH和上样载量进行研究，结合质量数据最终确定了双特异性抗体6MW3411的复合模式离子层析的工艺方法。所述方法能够将O-木糖修饰产生的酸性变异体的量控制在1.5%以内，并且将总的酸性峰控制在30%以内。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1显示了根据本发明一个实施例的重组抗NKG2A/PD-L1双特异抗体6MW3411亲和层析后样品CEX图谱；

图2显示了根据本发明一个实施例的亲和层析后样品6MW3411的CEX图谱中主峰及酸性峰的质谱分析图谱；

图3显示了根据本发明一个实施例的复合型离子交换层析纯化6MW3411的洗脱曲线；

图4显示了根据本发明一个实施例的亲和层析后样品6MW3411与本发明方法纯化6MW3411的CEX图谱对比。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1. 6MW3411双抗中酸性峰的色谱分析

6MW3411双抗实验样品，是使用DNA重组技术构建的CHO（中国仓鼠卵巢）细胞表达。细胞培养流程为通常的抗体药物培养工艺，包括在细胞株种子复苏，摇瓶中扩增培养，然后接种到2 L流加生物反应器中培养14天后收获的细胞培养上清液，再经过一步Protein A亲和层析纯化获得的含所述双抗的样品。

使用pH梯度CEX对实验样品进行分析。pH梯度CEX方法如下：

液相***：Waters Acquity Arc

色谱柱：Thermo ProPac WCX-10 4×250mm

流动相A：4 mM Piperazine，4 mM Imidazole，4 mM Tris，pH 5.0

流动相B：4 mM Piperazine，4 mM Imidazole，4 mM Tris

流动相C：500 mM NaCl

柱温：40℃

流速：1.0 ml/min

样品处理：以6MW3411双抗蛋白质量计，使用10mM醋酸钠，pH 5.5，将样品稀释至2mg/ml左右，然后直接进样，进样量约100 μg。

以流动相A、流动相B和流动相C进行线性梯度洗脱，以86.0% ~ 46.0%的流动相A、14.0% ~ 52.6%的流动相B和0.0% ~ 1.4%的流动相C洗脱36分钟。

获得的CEX图谱如图 1所示，图1的结果表明，采用常规的抗体纯化方法制备的双特异性抗体中含有酸性峰，亲和层析、阴离子层析和阳离子层析并不能有效除去双特异性抗体的酸性峰。

实施例2. 6MW3411双抗中酸性峰的结构分析及双抗酸性变异体的确认

将实施例1中通过pH梯度CEX方法分离出的酸性峰1、酸性峰2、酸性峰3进行峰收集，并通过质谱鉴定，结合文献报道和数据分析，确定各酸性峰中均含有以O-木糖连接的糖基化修饰组分，不同酸性峰含有O-木糖修饰的糖基化形式不同，结果见图 2。

图2的结果表明经过亲和层析法获得的双特异性抗体CEX三个酸性峰中分别含有-Xyl-Gal-Gal-GlcA、-Xyl(PO₃)-Gal-Gal-GlcA、-Xyl(PO₃)-Gal。

实施例3. 采用复合型离子交换层析除去双抗酸性变异体、降低酸性峰

将实施例1中表达CHO双抗的细胞培养上清，经过一步Protein A亲和层析纯化获得的含所述双抗的样品。

采用纳微的NM90 Agarose HAM（NM90-AgaroseTM HAM，苏州纳微科技股份有限公司）填料制备复合型离子交换层析柱。

配制以下溶液：

平衡缓冲液：50 mM NaAc-Hac pH5.5

洗脱缓冲液：50 mM NaAc-Hac pH4.75±0.05

再生/预平衡缓冲液：50 mM NaAc-Hac+1 M NaCl pH5.5

CIP：1 M NaOH

层析操作

样品预处理：取亲和层析后样品，用1 M HAC调节样品pH至pH5.5，用超纯水调节电导至3-5 mS/cm后准备上样。

层析柱消毒：1 M NaOH消毒层析柱30 min，保留时间≥5 min。

预平衡层析柱：再生/预平衡缓冲液冲洗层析柱≥3 CV，至pH、电导稳定，保留时间≥5 min。

平衡柱子和上样：平衡缓冲液液平衡层析柱≥4 CV，至pH、电导稳定后上样，保留时间≥6 min，载量≤60 mg/mL。

再平衡和洗脱：上样结束后，使用平衡缓冲液平衡层析柱≥3 CV，然后同洗脱缓冲液进行洗脱，当UV A280nm吸收高于200 mAu开始收集，降至500 mAu停止收集。

层析柱的清洗和维护：样品洗脱完成后，使用再生/预平衡缓冲液冲洗层析柱≥3CV，然后用1 M NaOH清洗层析柱，最后使用10 mM NaOH保存层析柱。复合型离子交换层析纯化6MW3411的洗脱曲线如图3所示。

将经过本发明方法纯化后收集的洗脱峰，按照实施例1的方法进行pH梯度CEX确认，结果如图4所示。图4表明酸性峰2、酸性峰3已经基本完全去除，即两种O-木糖修饰酸性变异体已经基本被完全去除。按照实施例2的方法进行质谱确认，结果表明经过本发明方法纯化后获得的样品中仅存在一种-Xyl-Gal-Gal-GlcA类型的O-木糖修饰，其比例约为1.5%。

将本发明纯化方法获得的样品与亲和层析后获得的样品进行尺寸排阻色谱（SEC）和阳离子交换色谱（CEX）对比，结果如表1、图4所示。

表1.常规三步法与本发明方法纯化6MW3411的SEC和CEX结果

表1的结果表明，本发明的方法能够显著降低CEX酸性峰的比例、提高主产物峰的比例。同时，SEC排阻鉴定本发明的方法也不会提高抗体纯化制备中常见的聚集体等不希望的产物。

本发明中涉及的氨基酸和核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1：抗NKG2A轻链可变区氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO.2：抗NKG2A重链可变区氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASSYDFSWYWINWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO.3：抗PD-L1单可变域抗体VHH-F2可变区氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRDSDEGASCMGWFRQAPGKEREGVAIIFNAGERTDYGDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATVWCGSWVARSWGQGTLVTVSS

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司

<120> 一种降低或消除重组蛋白CEX酸性峰的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ser Tyr Asp Phe Ser Trp Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Asp Ser Asp Glu Gly Ala

20 25 30

Ser Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

35 40 45

Val Ala Ile Ile Phe Asn Ala Gly Glu Arg Thr Asp Tyr Gly Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Thr Val Trp Cys Gly Ser Trp Val Ala Arg Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims

1.一种降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于将已经过纯化、CEX鉴定仍存在酸性峰的重组蛋白进一步采用以NM90-Agarose^TMHAM为填料的复合型离子交换层析进行分离，载量≤60 mg/mL，洗脱pH为pH 4.75±0.05，去除所述重组蛋白的酸性变异体；

其中，所述重组蛋白分子中含有GS连接子，所述重组蛋白的酸性变异体是由所述GS连接子丝氨酸残基上以木糖为核心的O-糖基化修饰产生的-Xyl(PO3)-Gal-Gal-GlcA结构和-Xyl(PO3)-Gal结构，所述重组蛋白包含有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述GS连接子由式(GS)n表示，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。

3.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述GS连接子由式(GGGGS)n表示，其中n为1、2、3、4或5。

4.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白包括一个或多个选自下组的元件：Fc、F(ab’)2、Fab、ScFv、sdAb。

5.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白为重组抗NKG2A/PD-L1双特异性抗体。

6.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白是由哺乳动物细胞***表达，所述纯化包括亲和层析纯化。

7.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白是以CHO为宿主细胞表达、经过亲和层析纯化的重组双特异性抗体。

8.复合型离子交换层析在去除重组蛋白的酸性变异体中的应用，其中，所述重组蛋白的酸性变异体是由丝氨酸残基上以木糖为核心的O-糖基化修饰产生的-Xyl(PO3)-Gal-Gal-GlcA结构和-Xyl(PO3)-Gal结构，所述复合型离子交换层析采用NM90-Agarose^TMHAM作为填料。