CN114075571A - 表皮生长因子的核酸构建体、生产方法及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸构建体，包括***片段，其特征在于，所述***片段从5’端到3’端包括编码亲和标签，内含肽，表皮生长因子的多核苷酸序列，其中所述亲和标签为GST亲和标签，内含肽为gp41‑1蛋白。这项研究揭示了gp41‑1微型内含子在处理EGF融合蛋白的细胞内表达和裂解C‑外显子方面的能力。最终纯化的EGF被证明在加速褥疮，糖尿病足溃疡和皮肤破裂的愈合速度方面具有很高的活性。

Description

表皮生长因子的核酸构建体、生产方法及其组合物
技术领域
本发明涉及生物学领域，尤其涉及一种表皮生长因子的核酸构建体，其表达载体、宿主细胞，以及该构建体的生产方法，所使用的引物，及利用该构建体或表达载体或宿主细胞生产EGF的方法及用该方法生产的EGF，及其组合物。
背景技术
表皮生长因子(EGF)是具有三个二硫键的53个氨基酸的寡肽，已在60年前被发现。EGF可以结合EGF受体，从而在触发表皮细胞增殖中激活下游信号转导级联反应。研究表明，EGF不仅在伤口愈合的改善中发挥了很好的作用(Su,Z.,et al.(2014).Enhancement ofskin wound healing with decellularized scaffolds loaded with hyaluronic acidand epidermal growth factor.Materials Science and Engineering:C,44,440-448.)，而且还参与了各种生理途径，如组织和骨骼的再生(Marquez,L.,et al.(2013).Enhancedbone healing of rat tooth sockets after administration of epidermal growthfactor(EGF)carried by liposome.Injury,44(4),558-564；Laflamme,C.,et al.(2010).Epidermal growth factor and bone morphogenetic proteins upregulateosteoblast proliferation and osteoblastic markers and inhibit bone noduleformation.Archives of Oral Biology,55(9),689-701；Yun,Y.R.,et al.(2012).Administration of growth factors for bone regeneration.Regenerativemedicine,7(3),369-385)。
由于EGF具有多种有价值的生物学功能，因此已用于治疗难以愈合的伤口，包括糖尿病足溃疡(Singla,S.,et al.(2012).Role of epidermal growth factor in healingof diabetic foot ulcers.Indian Journal of surgery,74(6),451-455；Tiaka,E.K.,etal.(2012).Epidermal growth factor in the treatment of diabetic foot ulcers:anupdate.Perspectives in Vascular Surgery and Endovascular Therapy,24(1),37-44.)和褥疮(Rao,B.A.R.,&Prasad,M.D.(2017).Recombinant Human Epidermal GrowthFactor in Healing of Pressure Ulcers.International Journal of HealthSciences&Research(www.ijhsr.org),7(11).)。EGF还可以刺激胶原蛋白和弹性蛋白的产生(FAAD,R.L.M.M.(2015).Improvement in atrophic acne scars using topicalsynthetic epidermal growth factor(EGF)serum:a pilot study.J Drugs Dermatol,14(9),1005-1010；Stoddard,M.A.,et al.(2017).Improvement of Atrophic Acne Scarsin Skin of Color Using Topical Synthetic Epidermal Growth Factor(EGF)Serum:APilot Study.Journal of drugs in dermatology:JDD,16(4),322-326.)，这进一步扩展了其在药妆用途中的应用。尽管EGF有各种各样的应用，但是EGF的商业利用率非常低，这是因为在天然宿主中提取足够量的EGF成本很高，而EGF的丰度却很低。
为了扩大其在医学或药妆行业中的应用，许多组织尝试通过重组技术通过不同的方法生产EGF，包括合成(Schroeder,C.I.,et al.(2014).Design and synthesis oftruncated EGF-A peptides that restore LDL-R recycling in the presence ofPCSK9 in vitro.Chemistry&biology,21(2),284-294.)，细胞内表达(Kim,D.G.,et al.(2015).Construction of chimeric human epidermal growth factor containingshort collagen-binding domain moieties for use as a woundtissue healingagent.J Microbiol Biotechnol,25(1),119-126.)和分泌(Huang,B.R.,et al.(2001).Purification of recombinant hEGF expressed in yeast Pichia pastoris and thestudy on its characters.Zhongguo yi xue ke xue yuan xue bao.Acta AcademiaeMedicinae Sinicae,23(2),106-110.)。但是，由于无法去除信号肽或亲和标签，只能产生融合蛋白。
发明内容
在大肠杆菌(E.coli)中，不需要翻译后修饰就可以使用不同的方法表达重组蛋白。尽管大肠杆菌在产生内毒素方面可能有一个缺点，但它的短***时间和最终产物的高表达是用作宿主生产各种重组蛋白的主要优势。内含蛋白(也称为“蛋白质内含子”)已在多种微生物中被发现，以促进同源蛋白的表达。本发明采用了公认的gp41-1微型内含子表达***来促进表皮生长因子(EGF)的表达。这项研究揭示了gp41-1微型内含子在处理EGF融合蛋白的细胞内表达和裂解C-外显子方面的能力。最终纯化的EGF被证明在加速褥疮，糖尿病足溃疡和皮肤破裂的愈合速度方面具有很高的活性。
具体的，
一方面，本发明提供了一种核酸构建体，包括***片段，其特征在于，所述***片段从5’端到3’端包括编码亲和标签，内含肽，表皮生长因子的多核苷酸序列，其中所述亲和标签为GST亲和标签，内含肽为gp41-1蛋白。
在本发明所述的核酸构建体的实施例中，所述***片段从5’端到3’端包括编码T7启动子，乳糖操纵子，GST亲和标签，gp41-1蛋白内含肽，表皮生长因子的多核苷酸序列。
在本发明所述的核酸构建体的一些实施例中，所述***片段从5’端到3’端包括编码T7启动子，乳糖操纵子，RBS，GST亲和标签，凝血酶位点，gp41-1蛋白内含肽，表皮生长因子，8x His标签，T7终止子的多核苷酸序列。
在本发明所述的核酸构建体的一些实施例中，所述核酸构建体用于在宿主大肠杆菌(Escherichia coli)中生产表皮生长因子(EGF)。
另一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含本发明所述的核酸构建体。
另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明所述的表达载体。
在本发明所述宿主细胞的一些实施例中，其为转化的大肠杆菌(Escherichiacoli)。
另一方面，本发明提供了EGF表达载体的构建方法，包括：
1)合成的DNA片段，该片段编码5'至3'端的NotI-终止密码子-EGF-gp41-1-凝血酶位点-SpeI；
2)使用正向引物5'-AAAAAGCGGCCGCTTAGCGCAGTTC-3'和反向引物5'-AAAAAACTAGTCTGGTGCCACGCGGTAGTT-3'通过PCR延伸扩增合成的DNA片段；
3)扩增的PCR产物通过PCR清洗试剂盒纯化，并用NotI和SpeI消化；
4)消化的片段从1％的琼脂糖中纯化并连接到用相同的限制酶消化的pET42a(+)中。
另一方面，本发明提供了一种构建EGF表达载体的引物对为：
SEQ ID NO:1，正向引物5'-AAAAAGCGGCCGCTTAGCGCAGTTC-3'；
SEQ ID NO:2，反向引物5'-AAAAAACTAGTCTGGTGCCACGCGGTAGTT-3'。
另一方面，本发明提供了一种利用本发明所述核酸构建体或本发明所述的表达载体或者本发明所述的宿主细胞生产EGF的方法。
在本发明所述生产EGF的方法一些实施方案中，其包括在允许EGF表达的条件下培养本发明的转化的大肠杆菌。
对于表达基因产物的聚积，在足以聚积基因产物的条件下培养宿主细胞。此类条件可包括例如，允许细胞表达和聚积蛋白质的温度、营养和细胞密度条件。此外，如本领域技术人员已知，此类条件是这样的条件，在该条件下细胞可以进行基本细胞功能，如转录、翻译，以及细胞内表达。
在合适的温度培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌培养，例如，一般的温度为约20℃至约39℃。在一个实施方案中，温度为约25℃至约37℃，如37℃。
对于诱导，通常培养细胞直到达到确定的光密度，例如约80-100的A55tl，在此时开始诱导(例如，通过添加诱导物，通过耗竭阻遏物、抑制剂或培养基组分等)，以诱导编码异源多肽的基因的表达。
产物聚积后，可以使用本领域已知的任何机械方法机械地裂解培养物中存在的细胞，以从宿主细胞中释放所述蛋白质。可选的，还可采用其它裂解法，包括但不限于碱裂解法、SDS裂解法等。用于裂解细胞的细胞裂解液可包括但不限于Tris-HCl、EDTA、NaCl、葡萄糖、溶菌酶等。任选地在产物回收之前，将裂解物温育足够的时间，以使细胞中含有的异源多肽释放。
裂解物可进行进一步处理，例如用水稀释、添加缓冲液或絮凝剂、pH调节，或者改变或维持用于后续回收步骤的制备物中裂解物/匀浆的温度。
在后续的步骤中，以最小化共回收的细胞碎片和产物的方式，从裂解物中回收异源多肽。可以通过任何方法进行回收。在一个实施方案中，可以包括沉降含异源多肽的可折射颗粒或者收集含可溶性产物的上清液。沉降的实例可以是离心。可以在吸附或者沉降之前，在破坏外层细胞壁以增加渗透性并允许回收更多固体的试剂存在的情况下，进行回收。此类试剂的实例包括螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或者兼性离子例如偶极离子去垢剂如ZWITTERGENT 316TM去垢剂。在一个实施方案中，在EDTA存在的情况下进行回收。
在一个实施方案中，在需要时，可进一步包括分离聚集的异源多肽，然后同时进行多肽的增溶和再折叠。备选地，可通过如下所述的标准技术回收可溶性产物：免疫亲或离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅上或阳离子交换树脂例如DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；以及使用例如SEPHADEXTMG-75的凝胶过滤；肝素-琼脂糖(HA)色谱等。
在一个实施方案中，本发明的产生外源多肽的方法进一步包括通过顺序采用谷胱甘肽琼脂糖4B树脂从所述细胞裂解液纯化所述EGF。发明人惊讶地发现，在使用谷胱甘肽琼脂糖4B树脂后，通过透析可获得了预料不到的高纯度的EGF蛋白。
大肠杆菌(E.coli)中，不需要翻译后修饰就可以使用不同的方法表达重组蛋白。尽管大肠杆菌在产生内毒素方面可能有一个缺点，但它的短***时间和最终产物的高表达是用作宿主生产各种重组蛋白的主要优势。内含蛋白(也称为“蛋白质内含子”)已在多种微生物中被发现，以促进同源蛋白的表达。本发明采用了公认的gp41-1微型内含子表达***来促进表皮生长因子(EGF)的表达。这项研究揭示了gp41-1微型内含子在处理EGF融合蛋白的细胞内表达和裂解C-外显子方面的能力。最终纯化的EGF被证明在加速褥疮，糖尿病足溃疡和皮肤破裂的愈合速度方面具有很高的活性。
在本发明生产EGF的方法的一些实施例中，其包括：
1)质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF的表达，包括：将质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF被转化到T7表达(T7 Express)中；添加40μg·mL-1卡那霉素LB培养基中，于37℃生长；当A600值达到0.5，将生长温度降低至16℃，并添加最终浓度0.1mM IPTG，培养。
2)将步骤1)得到的细胞沉淀进行裂解和纯化，包括：细胞沉淀进行裂解后，利用谷胱甘肽琼脂糖4B树脂纯化，先缓冲液A洗涤，再用缓冲液C进行孵育和洗脱；缓冲液A包括1xPBS、1x PMSF、抑肽酶、苯甲酰胺和亮肽素；缓冲液C包括50mM Tris–Cl、1mM EDTA、300mMNaCl、2mM DTT，pH 8。
在本发明所述生产EGF的方法的一些实施例中，步骤1)的质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF的表达，包括：将质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF转化到T7表达中，转化子的单个菌落在补充有40μg·mL-1卡那霉素的1L的LB培养基中于37℃下生长，250rpm旋转；当A600值达到0.5时，将生长温度降低至16℃，并添加0.1mM终浓度的IPTG；培养过夜。
在本发明所述生产EGF的方法的一些实施例中，步骤1)的质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF的表达，包括：T7表达pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF转化子，在添加40μg·mL-1卡那霉素的1L的LB培养基中于37℃下生长；当A600值达到1时，将全部培养物继代培养到50升的含有44升LB培养基的发酵罐中。使培养物在37℃下生长，以100rpm旋转，通气比1.5vvm，直到A600值达到0.5，将生长温度降低至16℃，并添加0.1mM终浓度的IPTG；用1M H2SO4和1MNaOH保持pH值为7.0，培养过夜。
在本发明所述生产EGF的方法的一些实施例中，步骤2)中将细胞沉淀进行裂解和纯化，包括：将获得的细胞团块重悬于400mL缓冲液A中；通过超声对重悬液进行裂解处理，10s声处理，间隔30s进行30x；然后以10,000rpm离心30分钟；上清液澄清后，装入谷胱甘肽琼脂糖4B树脂柱上，然后用缓冲液A洗涤10倍床体积；将诱导缓冲液C，添加到色谱柱上，并在室温下孵育24小时，通过添加3倍床体积的缓冲液C进行洗脱；保存洗脱液，用Western印迹分析，0.1x PBS透析后冻干备用；缓冲液A包括1x PBS、1x PMSF、抑肽酶、苯甲酰胺和亮肽素；缓冲液C包括50mM Tris–Cl，1mM EDTA，300mM NaCl，2mM DTT，pH 8。
另一方面，本发明提供了一种利用本发明所述生产EGF的方法生产的EGF。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明所述的EGF及辅料。
在本发明所述的组合物的一些实施例中，所述组合物还包括bFGF。
在本发明所述的组合物的一些实施例中，所述EGF的含量为0.005％至0.05％，所述bFGF的含量为0至0.0005％。
在本发明所述的组合物的一些实施例中，所述EGF的含量为0.005％至0.04％，所述bFGF的含量为0至0.0003％
在本发明所述的组合物的一些实施例中，辅料包括：水，苯氧乙醇，鲸蜡硬脂醇，鲸蜡硬脂20，液体石蜡和白色软石蜡。
在本发明所述的组合物的一些实施例中，所述组合物以乳液、霜、软膏、凝胶或液体制剂的形式提供。
在本发明所述的组合物的一些实施例中，所述组合物用于皮肤伤口愈合，包括但不限于糖尿病足溃疡、褥疮或外科伤口。
为了使融合蛋白的表达和溶解度最大化，选择具有T7启动子和N端GST标签的pET42a(+)载体作为表达EGF融合蛋白的质粒骨架。合成编码gp41-1内含子和EGF的***片段，并通过PCR延伸进一步扩增。在EGF的编码序列后立即***一个终止密码子，以防止嵌入载体主链中的下游C末端8x His的翻译。GST标签设计融合在gp41-1的N末端，为纯化表达后的整个融合蛋白，而EGF融合在经过充分研究的gp41-1微型内含子的C末端，其中可以通过添加DTT来完成C末端裂解。选择较低的诱导温度和较低浓度的IPTG以进一步提高EGF融合蛋白的溶解度。结果表明，在较低温度和低浓度的IPTG下，构建体pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF(图1)在摇瓶和发酵规模中都表达高水平的可溶性融合蛋白，表达水平没有显着差异。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方案及实施方案中的特征可以相互组合。
术语定义
在本申请中，除非另外明确指出，否则单数的使用包括复数。必须注意，如在本说明书中所用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另外指出，否则“或”的使用意指“和/或”。
如本文所用，本说明书中“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其它实施方案”的提及意指关于该实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如本文所用，术语“包含(comprising)”意指“主要包括，但是不必然唯一地包括”。此外，措词“包含(comprising)”的变化，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有相应变化的意义。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”可交换地使用并且表示包含一个或多个核苷酸、或寡核苷酸、或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核苷酸或其组合。如本文所用的“编码序列”是指编码多肽的多核苷酸区段。该区域或序列由5’端附近的起始密码子和3’端附近的终止密码子来界定。编码序列也可以被称为开放阅读框。
如本文所用，核酸构建体，为编码该多肽构建体的多核苷酸，携带和/或表达该多肽构建体和多核苷酸的工程化细胞，以及调节工程化细胞的活性的方法。如本文所述的工程化细胞可以包括经工程改造以编码并表达细胞因子、嵌合抗原受体和T细胞受体的免疫效应细胞。在本发明的一些实施例中，本发明的核酸构建体可进一步包含位于***物上游的第一克隆位点和位于***物下游的第二克隆位点，其中第一克隆位点和第二克隆位点允许核酸构建体***表达载体。
克隆位点允许克隆编码异源性多肽的多核苷酸。优选地，克隆位点组合在一起形成多克隆位点。如本文所使用，术语“多克隆位点”指包含一系列两个或更多个彼此相邻定位的限制内切核酸酶靶序列的核酸序列。多克隆位点包含限制内切核酸酶靶位，其允许具有平末端、黏性5’末端或黏性3’末端的片段***。使用标准分子生物学方法进行目标多核苷酸的***，例如，如Sambrook et al.(Sambrook et al.Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,1989)和/或Ausubel etal.(Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988)所描述。
如本文所使用，术语“核糖体结合位点”(ribosome binding site，简称RBS)，是指位于mRNA的起始密码子上游，在翻译起始时可用于结合核糖体的一段序列。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可交换地使用来提及氨基酸残基的聚合物以及提及其片段、变体、类似物、同系物(orthologues)或同源物(homologues)。因而，这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及应用于天然存在的氨基酸聚合物。在术语“蛋白”、“多肽”、“肽”、“多核苷酸”以及“核酸”的范畴内为片段及其变体，包括但不限于多核苷酸和核酸的反向互补形式和反义形式。
如本文所使用，表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。在本发明的一些实施例中，表皮生长因子(EGF)为人的表皮生长因子(hEGF)。在本发明的另一些实施例中，表皮生长因子(EGF)是天然hEGF。在本发明的另一些实施例中，人的表皮生长因子(hEGF)可具有或包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，或者可具有或包含与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性的核苷酸序列，或者可以由上述核苷酸序列组成。
如本文所使用，成纤维细胞生长因子是一类由约150-200氨基酸组成的多肽，以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。在一个实施方式中，可用于本发明的成纤维细胞生长因子可以是碱性成纤维细胞生长因子，尤其是人bFGF，更具体是天然人bFGF。在一个方面，本发明的bFGF可具有或包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或者可具有或包含与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的序列同一性的核苷酸序列，或者可以由上述核苷酸序列组成。
如本文所使用，信号肽是通常位于新合成的蛋白质或多肽的N-末端的氨基酸序列，其将蛋白质或多肽引导至细胞表面。在一些实施方案中，信号肽将多肽引导至细胞表面，以便***(例如，通过跨膜结构域)细胞膜内。在一些实施方案中，合成具有信号肽的本文所述的多肽构建体，但随后翻译后加工以切割信号肽，使得成熟多肽构建体缺乏信号肽氨基酸序列。在其它实施方案中，信号肽序列不被切割，而是保留在成熟多肽构建体中。
如本文所使用，内含肽是一类具有自我剪接功能的多肽，它能将自身从前体蛋白中切除并催化器两侧的肽链之间形成肽键。在本发明的一些实施例中，内含肽是gp41-1，一种微型蛋白质内含子。
如本文所使用，术语“亲和标签”是指重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽。亲和标签可用于促进目的蛋白的可溶性和稳定性，便于目的蛋白被检测和纯化。在本发明的一些实施例中，亲和标签为GST亲和标签。
如本文所使用，启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。在上下文中，术语“启动子”亦用于描述重组型、合成或融合分子，或衍生物或片段，例如启动子的截序列，其赋予、活化或提高其所可操作地连接的核酸分子的表达，以及编码肽。可用于本发明的示例性启动子可包括在原核生物中具有活性的启动子，例如T7启动子、phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子***、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子***、以及杂合启动子如tac启动子。本发明的一些实施例中，启动子为T7启动子。
如本文所使用，操纵子是功能性多核苷酸单元，其包含在单个启动子的控制下的多个基因。基因一起转录成一条mRNA链，然后在细胞质中一起翻译，或者经历反式剪接以产生单独翻译的单顺反子mRNA，即，各自编码单个基因产物的多条mRNA链。其结果是操纵子中包含的基因要么一起表达，要么全都不表达。可用于本发明的示例性操纵子包括但不限于乳糖操纵子、***糖操纵子、色氨酸操纵子等。乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群，由乳糖***的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。在本发明的一些实施例中，操纵子为乳糖操纵子。
如本文所用，术语“表达载体”意指具有在细胞或无细胞***中赋予其所可操作地连接的核酸片段表达的能力的核酸。在本发明的上下文中，要了解的是，包含如本文所定义的启动子的表达载体可以为质体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组片段或基因组片段，或能够维持和/或复制其被引入细胞的可表达形式的异源DNA的其他核酸。根据本发明的表达载体还可包含编码标记蛋白的多核苷酸。适于本发明的标记蛋白包括具有抗生素抗性或对其他毒性化合物具有抗性的蛋白。具有抗生素抗性的标记蛋白的实例包括磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸转移酶，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予对例如博莱霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素抗性的蛋白。在一个实例中，蛋白质赋予对氯霉素的抗性。例如，该蛋白质是一个来自大肠杆菌的基因，命名为CmR，如Nilsen et al，J.Bacteriol，178：3188-3193，1996中所述。
本领域技术人员将会理解，对可用的载体类型并无限制，只要所述载体可以是适于增殖，能够获得充足的多核苷酸或基因构建体的克隆载体，或在不同异源生物中适于纯化融合蛋白质的表达载体。在一个实施方式中，根据本发明的合适载体包括原核生物中的表达载体，诸如原核表达载体，包括但不限于：pET14、pET21、pET22、pET28、pET42、pMAL-2c、pTYB2、pGEX-4T-2、pGEX-6T-1、pQE-9、pBAD-his、pBAD-Myc、pECB系列载体、pRB系列载体等，例如pUC18、pUC19、Bluescript及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pBR374、pMB9、CoIE1、pCR1、RP4、噬菌体和“穿梭”载体(例如pSA3和pAT28)。
在本发明的一些实施例中，本发明还考虑穿梭载体。如本文所使用，术语“穿梭载体”是一类可以在两种不同宿主细胞(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)中复制和扩增的载体，从而使得能够将同一表达载体转化入不同的宿主细胞。本发明涉及的穿梭载体可以包括并不限于pECBS1。
载体组分通常可包括但不限于如下的一种或更多种表达控制元件：启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位点以及转录终止序列等。
如本文所使用，宿主细胞，是指用于生产本发明表达盒之内所编码的蛋白的细胞。
如本文所使用，T7表达感受态细胞(T7 express)，大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(CompetentCells)。T7 Express菌株为大肠杆菌BL21增强型菌株，为Lon和OmpT蛋白酶缺陷型，主要适用于含有T7启动子的原核表达载体(如pET等)的蛋白表达，同样适用于需要大肠杆菌RNA聚合酶来转录RNA的非T7启动子的表达载体(如pGEX等)。该菌株区别于BL21(DE3)菌株的优势在于T7 RNA聚合酶基因整合在细菌染色体上的lac操纵子区域，基因组中无λ前噬菌体序列，并具有抗T1噬菌体感染等特点。T7表达感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率大于10的8次方cfu/μg DNA。产品特点:对氨苄青霉素，卡那霉素，壮观霉素，氯霉素，链霉素和四环素敏感。
如本文所使用，术语“转化”意为将DNA作为染色体外元件或者通过染色体整合引入原核宿主中，以使DNA可以复制。取决于所使用的宿主细胞，使用对于此类细胞合适的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙的钙处理用于含坚固的细胞壁屏障的细菌细胞。用于转化的另一方法使用聚乙二醇/DMSO。还使用的另一技术是电穿孔。
将用于产生本发明的外源多肽的原核宿主细胞培养于本领域已知的并且适合用于该宿主细胞培养的培养基中。合适的培养基的实例可包括添加了必需营养补充物的Luria-Bertani(LB)培养基。在一些实施方案中，培养基还含有选择剂，基于构建的表达载体进行选择，以选择性地允许含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素和/或卡那霉素加入到用于细胞生长的培养基中，所述细胞表达氨苄青霉素和/或卡那霉素抗性基因。还可以以合适的浓度包括除碳、氮和无机磷源之外的任何必需补充物，其可以单独地或者以与另一补充物或培养基如复合氮源的混合物的形式引入。
如本文所使用，限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。可用于本发明的限制性内切酶可包括但不限于：EcoRI、PstI、XbaI、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinfI、Sau3A、PovII、SmaI、HaeIII、AluI、SalI、Dra等。本发明一些实施例中，使用了NotI和/或SpeI限制性内切酶。
对于诱导，通常培养细胞直到达到确定的光密度，例如约80-100的A55tl，在此时开始诱导(例如，通过添加诱导物，通过耗竭阻遏物、抑制剂或培养基组分等)，以诱导编码异源多肽的基因的表达。
如本文所使用，PCR清洗试剂盒，适合从PCR、酶促反应、测序反应提取PCR扩增产物。
术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条状、糊状、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的蛋白酶变体可相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。在本发明一些实施例中，所述组合物以乳液、霜、软膏、凝胶或液体制剂的形式提供。在本发明的一些实施例中，所述辅料包括水、石油膏、凡士林油、矿物油、植物油、动物油、蜡和聚合物中的至少一种。在本发明的一些实施例中，辅料包括：水，苯氧乙醇，鲸蜡硬脂醇，鲸蜡硬脂20，液体石蜡和白色软石蜡。
本发明中的示例性序列示于下表。
Figure BDA0002637728980000151
Figure BDA0002637728980000161
附图说明
图1为本发明表达GST-gp41-1-EGF的DNA构建体的示意图。该图显示了表达GST-gp41-1-EGF***盒的质粒构建体载体(6.2kb)。显示的遗传成分的符号包括：ori＝大肠杆菌中的复制起点；KanR＝卡那霉素抗性基因；GST＝谷胱甘肽S-转移酶标签；gp41-1＝gp41-1内含子；EGF＝EGF基因。箭头指示基因表达的方向。
图2为可溶性EGF融合蛋白的蛋白质印迹分析图。分析了不同时间间隔收集的IPTG诱导后的pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF转化子。1L 0h，45L 0h，1L ON，45L ON泳道：分别从1L和45L培养物诱导0h和过夜的培养物中收集的样品，每条泳道上载样10μL细胞裂解物。泳道-ve：从pET42a(+)载体培养物中提取的细胞裂解液10μL诱导过夜。
图3为EGF柱上裂解的蛋白质印迹分析图。分析了融合蛋白在柱上裂解EGF的功效。泳道输入：从45L培养物中收集到的细胞裂解液样品为10μL；泳道4小时，24小时：分别在4小时和24小时后孵育缓冲液C后收集洗脱液；泳道-ve：从pET42a(+)载体培养物中提取的细胞裂解液10μL诱导过夜。
图4为EGF的有丝***作用。显示了由不同浓度的重组EGF样品
Figure BDA0002637728980000171
表现出的有丝***作用
图5为用水性乳膏(1)治疗褥疮的效果图。(A)一名83岁的妇女患有褥疮；(B)用水性乳膏(1)治疗3天后，伤口已完全愈合。
图6为用水性乳膏(2)治疗皮肤破裂的效果图。(A)2岁孩子的头部受伤，并立即用水性乳膏治疗(2)；(B)治疗后一个小时内形成的血凝块；(C)在受伤后12小时内形成结痂；(D)伤口完全愈合，没有形成疤痕。
图7为水性乳膏(3)治疗糖尿病足溃疡的效果图。(A)一位76岁的老人患有糖尿病足溃疡3个月；(B)4天后用水性乳膏(2)处理；(C)治疗8天后，伤口完全闭合。
具体实施方式
以下提供对可用于表达多种外源多肽、尤其是天然外源多肽的表达***和方法的描述。这些***和方法满足了本领域中存在的至少一项需求。本文中所用章节标题仅用于组织目的，不应理解为以任何方式限制所述主题。
除非另有明确定义，否则本文中所用术语应根据其在本领域中的通常含义来理解。除非文中另有规定或指示，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。可使用本领域技术人员公知的标准技术，将编码目标多肽的多核苷酸克隆入本发明的载体。例如，利用聚合酶链反应(PCR)产生编码目标多肽的多核苷酸。PCR操作方法是本领域已知的。标准技术和流程通常根据本领域的常规方法和多种一般参考文献来进行(通常可参见，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
实施例
本文中通过以下实施例对本发明进行描述，其仅旨在举例说明，对本发明的范围并无限制。
细菌菌株和化学品
大肠杆菌菌株DH5α和T7表达，以及限制性内切酶购自New England Biolabs(Ipswich,MA)；
合成的DNA片段和针对EGF的抗体购自Thermo Fisher Scientific(Ipswich，MA)；
除非另有说明，否则所有其他化学药品均购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。
实施例1：EGF表达载体的构建
用以下方法构建表达构建体pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF：
由Thermo Fisher Scientific合成编码NotI-终止密码子-EGF-gp41-1-凝血酶位点-SpeI的5'至3'端序列的合成DNA片段(SEQ ID NO:5)。使用正向引物5'-AAAAAGCGGCCGCTTAGCGCAGTTC-3'和反向引物5'-AAAAAACTAGTCTGGTGCCACGCGGTAGTT-3'，通过PCR延伸扩增该合成的DNA片段。扩增的PCR产物通过PCR清洗试剂盒(Axygen AxyPrepClean-Up Kit)纯化，并用NotI和SpeI消化。消化的片段用1％的琼脂糖纯化，并连接到用相同的限制酶消化的pET42a(+)中。
通过Sanger测序证实pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF的质粒序列。
实施例2：EGF融合蛋白的在摇瓶中表达
将质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF转化到T7表达(T7 Express)中。转化子的单个菌落在补充有40μg·mL-1卡那霉素的1L的LB培养基中于37℃下生长(以250rpm旋转)。当A600值达到0.5时，将生长温度降低至16℃，并添加0.1mM终浓度的IPTG。培养物生长过夜。收集1mL细胞团块并将其重悬于200μL补充有1x PMSF、抑肽酶、苯甲酰胺和亮肽素的重悬缓冲液(50mM Tris-Cl，200mM EDTA，pH 8.0)中，然后在冰上孵育5分钟。然后在37℃下，用120μL溶菌酶溶液(1mg·mL-1)处理混合物20分钟。然后加入80μL裂解缓冲液(10mM EDTA，10％Triton X-100和50mM Tris-Cl，pH 8.0)。将装有溶液的试管轻轻倒置，然后以14,800rpm离心5分钟。通过蛋白质印迹法分析细胞裂解物样品。
实施例3：EGF融合蛋白的在发酵罐中表达
T7表达pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF转化子，在添加40μg·mL-1卡那霉素的1L的LB培养基中于37℃下生长(以250rpm旋转)。当A600值达到1时，将全部培养物继代培养到50升的含有44升LB培养基的发酵罐中。使培养物在37℃下生长(以100rpm旋转，通气比1.5vvm)，直到A600值达到0.5，将生长温度降低至16℃，并添加0.1mM终浓度的IPTG。在用1M H2SO4和1MNaOH保持pH值为7.0的情况下，使培养物生长过夜。通过连续离心收集细胞团块，并用缓冲液A(1x PBS和1x PMSF，抑肽酶，苯甲酰胺和亮肽素)洗涤两次，后可长期保存。
实施例4：EGF的蛋白质纯化和诱导裂解
将获得的细胞团块重悬于400mL缓冲液A中。通过超声(10s声处理，间隔30s进行30x)对重悬液进行裂解处理，然后以10,000rpm离心30分钟。上清液澄清后，装入谷胱甘肽琼脂糖4B树脂柱上，然后用缓冲液A洗涤10倍床体积。将诱导缓冲液C(50mM Tris–Cl，1mMEDTA，300mM NaCl，2mM DTT，pH 8)添加到色谱柱上，并在室温下孵育24小时。通过添加3倍床体积的缓冲液C进行洗脱。保存洗脱液，用Western印迹分析，0.1x PBS透析后冻干备用。
实施例5：EGF的生物学测定
用MTT法分析重构的EGF对NIH/3T3成纤维细胞增殖的促有丝***作用(Wu KC,etal.(2019)Cost-Effective Expression of Human Bio-Identical Basic FibroblastGrowth Factor in Bacillus subtilis by Employing Asp DnaE Protein Intron.J MolGenet Med 13:438)。
复兴霜的制备和使用说明
将不同浓度的冻干EGF和bFGF(Kwong WY,et al.(2019)Enhanced expression ofhuman identical,exogenous FGF2 in Human Embryonic Kidney293T facilitated bythe protein intron.Transl BiomedVol.10:No.1:157；Wu KC,et al.(2019)Cost-Effective Expression of Human Bio-Identical Basic Fibroblast Growth Factor inBacillus subtilis by Employing Asp DnaE Protein Intron.J Mol Genet Med 13:438)，(1)0.005％EGF，(2)0.02％EGF和0.00015％bFGF，(3)0.04％EGF和0.0003％bFGF，分别与自制的水性乳膏(水，苯氧乙醇，鲸蜡硬脂醇，鲸蜡硬脂20，液体石蜡和白色软石蜡)混合10分钟得混合乳膏。
该混合乳膏施用于患有褥疮，伤口和糖尿病足溃疡的患者的患处。
结果与讨论
1、构建体pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF在摇瓶和发酵规模中都表现高水平表达
为了使融合蛋白的表达和溶解度最大化，选择具有T7启动子和N端GST标签的pET42a(+)载体作为表达EGF融合蛋白的质粒骨架。合成编码gp41-1内含子和EGF的***片段，并通过PCR延伸进一步扩增。在EGF的编码序列后立即***一个终止密码子，以防止嵌入载体主链中的下游C末端8x His的翻译。GST标签设计融合在gp41-1的N末端，为纯化表达后的整个融合蛋白，而EGF融合在经过充分研究的gp41-1微型内含子的C末端，其中可以通过添加低浓度的DTT来完成C末端裂解。选择较低的诱导温度和较低浓度的IPTG以进一步提高EGF融合蛋白的溶解度。结果表明，在较低温度和低浓度的IPTG下，构建体pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF(图1)在摇瓶和发酵规模中都表达高水平的可溶性融合蛋白，表达水平没有显着差异(图2)。
2、易纯化，过程简单
为了纯化EGF融合蛋白，首先将获得的细胞团块裂解，然后将细胞裂解物样品上样到谷胱甘肽琼脂糖4B上，具有GST标签的EGF融合蛋白可以被特异性捕获，而通过缓冲液A连续洗涤可以去除非特异性结合蛋白。结果表明，在低浓度的DTT诱导条件下，长时间孵育后，EGF C-外显子可以有效地从gp41-1微型内含子上裂解下来(图3)。所得的EGF用具有中性pH的低盐缓冲液透析，并冻干以延长其储存时间。
3、重组的EGF具有很好的生物学活性
由于EGF能够通过与细胞EGF受体结合而触发细胞增殖，因此检验EGF对NIH/3T3细胞的丝裂原活性如bFGF的相同方法是可行的。从MTT分析结果中，观察到重组的EGF在触发NIH/3T3细胞的细胞增殖中具有生物活性(图4)。
除了体外生物学测定，还进行了临床案例研究。如材料和方法所述，我们制备了自制的水性乳膏，并添加了本发明表达的各种浓度的EGF和bFGF，用于治疗患有各种皮肤破裂的患者。结果表明，本发明表达的EGF可以有效改善褥疮(图5)，表皮伤口(图6)以及糖尿病足溃疡(图7)患者的愈合过程。案例研究如下所示：
病例(A)：一名83岁的患有褥疮的妇女(图5A)，接受0.005％EGF水性乳膏(1)治疗。治疗三天后伤口已完全愈合(图5B)。
案例(B)：一个两岁孩子的头的表皮意外受伤，立即给其施用0.02％EGF和0.00015％bFGF水性乳膏(2)(图6A)进行治疗。在将水性乳膏(2)处理5分钟后，出血立即停止，一个小时后形成凝块(图6B)。在12小时后结痂形成(图6C)，并且在治疗两周后，伤口完全愈合，没有疤痕(图6D)。
病例(C)：一位76岁的老人患有糖尿病足溃疡三个月，给其施用0.04％EGF和0.0003％bFGF水性乳膏(3)进行治疗。治疗四天后，伤口大小明显减少(图7A)。继续治疗四天，伤口完全闭合(图7B)。
根据三个案例研究的结果，从本发明所述的融合蛋白中纯化的EGF被证明具有很高的活性。本发明证明，通过内含子方法获得的最终重组EGF在治疗不同程度的皮肤损伤患者中具有生物活性。该方法可能适用于各种重组蛋白的表达，而无需翻译后修饰。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 梦芊科技知识产权有限公司
<120> 表皮生长因子的核酸构建体、生产方法及其组合物
<130> 202007
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aaaaagcggc cgcttagcgc agttc 25
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<211> 159
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtgtgtgc 60
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cgatgtcagt accgagacct gaagtggtgg gaactgcgc 159
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
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aagcgcctgt actgcaaaaa cgggggcttc ttcctgcgca tccacccaga cggccgcgtt 120
gacggggtcc gcgagaagag cgaccctcac atcaagctac aacttcaagc agaagagcgc 180
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
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ataccttctt tcagaccacc gctaatattc atttcaccgg tctgggtcgg aaacaggtgt 360
tcttcgctac aaatgatttc tttgccatct tccagggtga ttttatagct tttttttttg 420
cttttcggaa acacattcag cacttcatta taaccggtat tgctcagaac cagatcaccc 480
acctgaatat ttgaaatttc tttcataccc tgcggtgtct gaacctgggt tttcagatcc 540
agacaactac cgcgtggcac cagactagt 569

Claims (16)

1.一种核酸构建体，包括***片段，其特征在于，所述***片段从5’端到3’端包括编码亲和标签，内含肽，表皮生长因子的多核苷酸序列，其中所述亲和标签为GST亲和标签，内含肽为gp41-1蛋白。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，所述***片段从5’端到3’端包括编码T7启动子，乳糖操纵子，GST亲和标签，gp41-1蛋白内含肽，表皮生长因子的多核苷酸序列。
3.一种表达载体，其包含权利要求1-2任一项所述的核酸构建体。
4.宿主细胞，其包含权利要求3所述的表达载体。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其为转化的大肠杆菌(Escherichia coli)。
6.EGF表达载体的构建方法，包括：
1)合成的DNA片段，该片段编码5'至3'端的NotI-终止密码子-EGF-gp41-1-凝血酶位点-SpeI；
2)使用正向引物5'-AAAAAGCGGCCGCTTAGCGCAGTTC-3'和反向引物5'-AAAAAACTAGTCTGGTGCCACGCGGTAGTT-3'通过PCR延伸扩增合成的DNA片段；
3)扩增的PCR产物通过PCR清洗试剂盒纯化，并用NotI和SpeI消化；
4)消化的片段从1％的琼脂糖中纯化并连接到用相同的限制酶消化的pET42a(+)中。
7.一种构建EGF表达载体的引物对为：
正向引物5'-AAAAAGCGGCCGCTTAGCGCAGTTC-3'；
反向引物5'-AAAAAACTAGTCTGGTGCCACGCGGTAGTT-3'。
8.一种利用权利要求1-2任一项核酸构建体或权利要求3所述的表达载体或权利要求4或5所述的宿主细胞生产EGF的方法。
9.根据权利要求8所述的生产EGF的方法，包括：
1)质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF的表达，包括：将质粒pET42a(+)-GST-gp41-1-EGF被转化到T7表达中；添加40μg·mL-1卡那霉素的LB培养基中，于37℃生长；当A600值达到0.5，将生长温度降低至16℃，并添加最终浓度0.1mM IPTG，培养；
2)将步骤1)得到的细胞沉淀进行裂解和纯化，包括：细胞沉淀进行裂解后，利用谷胱甘肽琼脂糖4B树脂纯化，先缓冲液A洗涤，再用缓冲液C进行孵育和洗脱；缓冲液A包括1x PBS、1x PMSF、抑肽酶、苯甲酰胺和亮肽素；缓冲液C包括50mM Tris–Cl、1mM EDTA、300mM NaCl、2mM DTT，pH 8。
10.一种利用权利要求8或9所述的生产EGF的方法生产的EGF。
11.一种组合物，其包含权利要求10所述的EGF及辅料。
12.根据权利要求11所述的组合物，还包括bFGF。
13.根据权利要求12所述的组合物，所述EGF的含量为0.005％至0.05％，所述bFGF的含量为0至0.0005％。
14.根据权利要求12所述的组合物，所述EGF的含量为0.005％至0.04％，所述bFGF的含量为0至0.0003％。
15.根据权利要求11所述的组合物，所述辅料包括水，苯氧乙醇，鲸蜡硬脂醇，鲸蜡硬脂20，液体石蜡和白色软石蜡。
16.根据权利要求11所述的组合物，所述组合物以乳液、霜、软膏、凝胶或液体制剂的形式提供。
CN202010830385.XA 2020-08-18 2020-08-18 表皮生长因子的核酸构建体、生产方法及其组合物 Pending CN114075571A (zh)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115093470A (zh) * 2022-06-30 2022-09-23 广州市乾相生物科技有限公司 内含肽Mtu RecA突变体及其在生产谷胱甘肽GSH中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102757974A (zh) * 2012-06-05 2012-10-31 陕西省微生物研究所 一种重组人表皮生长因子的新型制备方法
CN104053779A (zh) * 2011-09-28 2014-09-17 时代生物技术股份公司 断裂内含肽及其用途
CN106244610A (zh) * 2016-07-22 2016-12-21 华南理工大学 一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104053779A (zh) * 2011-09-28 2014-09-17 时代生物技术股份公司 断裂内含肽及其用途
CN102757974A (zh) * 2012-06-05 2012-10-31 陕西省微生物研究所 一种重组人表皮生长因子的新型制备方法
CN106244610A (zh) * 2016-07-22 2016-12-21 华南理工大学 一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115093470A (zh) * 2022-06-30 2022-09-23 广州市乾相生物科技有限公司 内含肽Mtu RecA突变体及其在生产谷胱甘肽GSH中的应用

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