CN114072428B - 一种靶向PD-L1和TGF-β的融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种靶向PD‑L1和TGF‑β的融合蛋白及其用途。该融合蛋白包括特异性结合人PD‑L1的抗体或抗原结合片段和人TGFβRII结合结构域的融合蛋白，还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的宿主细胞，以及所述融合蛋白制备抗肿瘤药物的用途。

Description

一种靶向PD-L1和TGF-β的融合蛋白及其用途
技术领域
本申请属于生物技术领域，更具体地，本申请公开了一种融合蛋白，其包括(a)结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少一个重链可变结构域和至少一个轻链可变结构域；(b)人TGFβ RII或其TGFβ结合片段。本申请还包括所述融合蛋白的制备方法及其应用(例如用于治疗癌症)。
背景技术
近年来肿瘤发病率呈上升趋势，恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高。目前临床上采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然能够缓解病痛，延长生存时间，但均存在局限。因此，通过免疫治疗激活免疫***、重整宿主的免疫应答以诱导肿瘤消退和稳定疾病的方法，已经逐渐成为肿瘤治疗领域的热点。
程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)是程序性死亡受体1(Programmed death 1，PD-1)的配体之一，主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞上，在活化后的细胞上表达上调。PD-L1与PD-1结合形成受体配体复合物后发出抑制性信号，包括诱导IL-10(炎症与免疫抑制因子)产生，下调抗凋亡基因bcl-2来促进抗原特异性T细胞的凋亡，抑制***中CD8+ T细胞的增殖等。PD-L1除了能与PD-1以较强的亲和力结合外，还能与CD80以较弱的亲和力结合，抑制T细胞活性。研究发现乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑色素瘤等多种人类肿瘤组织中PD-L1蛋白高表达，使得肿瘤细胞能够逃避免疫***的杀伤。同时，PD-L1的表达水平和受试者的临床及预后紧密相关。这表明PD-L1是肿瘤免疫治疗中非常有潜力的靶点。
转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)为多功能细胞因子，在细胞增殖及分化、迁移及黏附、胞外基质产生、血管生成及***生成和免疫功能等过程中发挥重要调节作用。TGF-β同时具有肿瘤抑制和肿瘤促进的作用，但随着肿瘤的发展，其通过上皮间质转化过程，促进肿瘤转移、免疫逃逸以及诱导肿瘤血管生成，最终导致疾病进展。TGF-β通过识别转化生长因子β受体II(TGF-β receptor，TGFβ RII)形成复合物，使TGFβRII磷酸化，随后TGFβ RI以二聚体形式加入，形成异源四聚体受体复合物进行信号传递。研究发现，利用TGFβ受体抑制TGF-β信号传导能减少肿瘤的转移，使其成为目前肿瘤药物开发的重要方向之一。
PD-L1以及其他免疫检查点蛋白质的抑制剂作用效率较低，仅对部分受试者长期发挥作用，且可能导致致命的自身免疫不良事件，如何提高其治疗效果和减少毒性仍然是免疫治疗领域研究的重点。然而新的研究发现，TGF-β是导致免疫检查点抑制剂失效的重要原因。总体而言，在抑制PD-L1/PD-1通路的基础上抑制TGF-β信号通路，能有效地提高抗肿瘤效果。
发明内容
本申请的目的至少在于提供一种靶向PD-L1和TGF-β的融合蛋白，所述融合蛋白可以：
a)特异性结合PD-L1和/或阻断PD-1/PD-L1结合以及其信号通路；和/或
b)结合TGF-β或抑制TGF-β的信号传递，减少其对肿瘤发展的促进作用。
另一方面，本申请提供一种能够结合TGF-β的TGFβ RII的部分或全部，以及结合至免疫检查点蛋白质(例如PD-L1)的抗体或抗原结合片段的蛋白分子，可作为有效的抗肿瘤和抗癌药物。
再一方面，本申请提供一种融合蛋白，其包括：
(a)结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体或其抗原结合片段(例如至少一个重链可变结构域和至少一个轻链可变结构域)；和/或
(b)人TGFβ结合结构域。
在某些实施方案中，所述人TGFβ结合结构域是人TGFβ RII或其TGFβ结合片段，例如是与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽或肽段，或任何文本所述的片段。
在某些实施方案中，所述的重链可变结构域的CDR1序列与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：15示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述重链可变结构域的CDR2序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述重链可变结构域的CDR3序列与SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：17示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；所述轻链可变结构域的CDR1序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：18示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述轻链可变结构域的CDR2序列与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：19示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述轻链可变结构域的CDR3序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：20示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在某些方案中，所述的重链可变结构域与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，所述的轻链可变结构域与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：22示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
所述融合蛋白还可包括将抗体或其抗原结合片段的C末端与TGFβ结合结构域的N末端相连接的连接肽。在某些实施方案中，所述的连接肽可以采用柔性连接肽或刚性连接肽，可选地，是由甘氨酸和丝氨酸组合而成。例如，(G4S)xG所示的连接肽，其中x可选地为3-6的整数，优选为4-5，最优选为4。也可以采用不含连接肽的连接方式。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包括抗体的至少一个轻链可变结构域与至少一个重链可变结构域，所述的轻链可变结构域与所述重链可变结构域组合时，形成与人PD-L1结合的抗原结合位点。
在某些实施方案中，所述的融合蛋白可包含免疫球蛋白的恒定区，或所述恒定区的片段、类似物、变体或衍生物。在一些实施方案中，所述恒定区来自人免疫球蛋白重链，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或其他类别免疫球蛋白的重链，优选为IgG1的重链。在一些实施方案中，所述恒定区可包含任何本文所述的修饰，例如氨基酸的***、缺失、取代或化学修饰。在一些实施方案中，所述恒定区包含改变效应功能的突变，例如，将抗体恒定区C末端的赖氨酸残基突变为疏水性氨基酸，如丙氨酸或亮氨酸，减少蛋白酶的水解切割，增加血清半衰期。在一些实施方案中，所述恒定区的任意氨基酸残基可用任意同种异型(allotype)的氨基酸残基取代，优选地，用G1m(3)和/或nG1m(1)的氨基酸残基取代。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段，和TGFβ结合结构域。所述抗体或其抗原结合片段可任选地包含经修饰的恒定区，例如任何本文所述的修饰，包含恒定区C末端的K突变为A，或同种异型(allotype)氨基酸取代。所述TGFβ结合结构域包含人TGFβRII或其能够结合TGFβ的片段或变体、或人TGFβ RII的胞外结构域。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含(a)与SEQ ID NO：7所示重链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和与SEQ ID NO：8所示轻链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或者与SEQ ID NO：21所示重链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和与SEQ ID NO：22所示轻链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，和(b)TGFβ结合结构域。在一些具体实施方式中，所述TGFβ结合结构域是人TGFβRII或其TGFβ结合片段或变体，或与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽或肽段：
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：(a)与SEQ ID NO：9所示重链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和与SEQ ID NO：10所示轻链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或者与SEQ IDNO：23所示重链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和与SEQ ID NO：24所示轻链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、9I％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，和(b)TGFβ结合结构域。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含：(a)与SEQ ID NO：29所示重链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和与SEQ ID NO：10所示轻链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，或者与SEQ ID NO：32所示重链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列和与SEQ ID NO：24所示轻链氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，和(b)TGFβ结合结构域。在一些具体实施方式中，所述TGFβ结合结构域是人TGFβRII或其TGFβ结合片段或变体，或与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽或肽段。
在一些实施方案中，所述的融合蛋白包括本领域中所述的任何特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白或其抗原结合片段，优选地，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链CDR1区；与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链CDR2区；与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链CDR3区；与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链CDR1区；与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链CDR2区；与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链CDR3区。
在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：15的重链CDR1区；选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：16的重链CDR2区；选自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：17的重链CDR3区；选自SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：18的轻链CDR1区；选自SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：19的轻链CDR2区；选自SEQID NO：6或SEQID NO：20的轻链CDR3区。
在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链可变结构域；与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：如SEQ ID NO：7所示的重链可变结构域；如SEQ ID NO：8所示的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：如SEQ ID NO：21所示的重链可变结构域；如SEQ ID NO：22所示的轻链可变结构域。
优选地，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：与SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链氨基酸序列，或与SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的重链氨基酸序列；与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的轻链氨基酸序列。
优选地，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：如SEQ IDNO：9所示的重链氨基酸序列；如SEQ ID NO：10所示的轻链氨基酸序列。
优选地，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：如SEQ IDNO：23所示的重链氨基酸序列；如SEQ ID NO：24所示的轻链氨基酸序列。
优选地，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：如SEQ IDNO：29所示的重链氨基酸序列；如SEQ ID NO：10所示的轻链氨基酸序列。
优选地，所述特异性结合PD-L1的抗原结合蛋白包含如下氨基酸序列：如SEQ IDNO：32所示的重链氨基酸序列；如SEQ ID NO：24所示的轻链氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述的融合蛋白包含：(1)两个完全相同的第一多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：25示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，或其氨基酸序列与SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性；和(2)两个完全相同的第二多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：27示出的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。其中所述第一多肽的氨基酸序列从N端到C端依次为：识别PD-L1抗原表位或抗原的抗体重链可变结构域、抗体恒定区、连接肽、人TGFβRII的TGFβ结合片段的序列。
在另一方面，本申请还提供了一种编码上述融合蛋白的多核苷酸序列，例如，其包含：编码SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO：12、编码SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO：26、编码SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO：31、或编码SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO：34，以及编码SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO：14、或编码SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO：28；优选地，所述多核苷酸序列包含以SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：28示出的核酸序列、或者以SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：14示出的核酸序列。本申请还提供了一种表达载体，其包含所述多核苷酸序列。或者，本申请还提供了包含所述多核苷酸序列或表达载体的细胞。
在一些方面，本申请还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含所述融合蛋白。
在又一方面，本申请还提供一种生产融合蛋白的方法。所述融合蛋白包括(a)结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体的至少一个重链可变结构域和至少一个轻链可变结构域；(b)人TGFβRII或其TGFβ结合片段或变体。所述方法包括采用基因重组技术制备重组DNA，将重组DNA导入细胞，并使所述细胞稳定表达所述蛋白质，所述细胞可选自细菌、酵母菌和哺乳动物细胞，优选哺乳动物细胞，例如CHO、NSO、COS、BHK细胞等。所述方法还包括收获所述细胞的培养液并纯化得到所述蛋白质。
本申请还提供融合蛋白或蛋白分子在制备治疗癌症、抑制肿瘤生长或增强抗肿瘤应答的药物中的用途。所述的治疗根据受试者对靶向PD-L1和TGFβ药物治疗的敏感性和临床经验以及受试者的PD-L1和TGFβ表达水平等因素来选择。本申请还涉及用于治疗癌症、抑制肿瘤生长或增强抗肿瘤应答的融合蛋白。
在一些方面，本申请所述的蛋白分子或融合蛋白可用于肿瘤部位TGFβ的局部消耗；和/或阻断细胞(例如肿瘤细胞或免疫细胞)TGFβ的信号通路。
在一些方面，本申请所述的蛋白分子或融合蛋白可用于阻断PD-L1通路；和/或促进免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。
在一些方面，本申请所述的蛋白分子或融合蛋白具有用于治疗癌症、抑制肿瘤生长或增强抗肿瘤应答的用途。所述癌症或肿瘤包括但不限于肺腺癌、粘液性腺瘤、脑低级神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、间皮瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肾癌、肝癌、急性骨髓性白血病、食管腺癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、晚期或复发非小细胞肺癌、化疗后难治性非小细胞肺癌、转移性非鳞非小细胞肺癌、晚期或复发的非鳞非小细胞肺癌、不可切除的晚期非小细胞肺癌、隐匿性非小细胞肺癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、晚期或复发性乳腺癌、局部复发性乳腺癌、炎性乳腺癌、胰腺导管癌、转移性胰腺癌、局部晚期不可切除胰腺癌、复发性胰腺癌、***癌、晚期或转移性***癌、局部晚期***癌、去势抵抗性***癌、去势后复发性***癌、局限性***癌、进展性***癌、结肠直肠癌、直肠腺癌、大肠癌、转移性结直肠癌、晚期或复发性结肠癌、晚期或复发性直肠癌、局部复发性直肠癌、局部复发性结肠癌、胃腺癌、胃癌、不可切除性胃癌、转移性胃癌、局部晚期或复发性胃癌、胃肠道间质瘤、胆道癌、胆管癌、胆囊癌、不可切除或转移性胆道癌、不可切除或转移性胆管癌、不可切除或转移性胆囊癌、***癌、***癌、***癌、子***、局部晚期***、复发性***、转移性***、转移性***癌、晚期或复发***鳞癌、晚期或复发***腺癌、子宫体子宫内膜样癌、膀胱癌、人***瘤病毒感染、头颈部癌、复发或转移性头颈部癌、下咽癌、喉癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、咽喉癌、鼻旁窦和鼻腔癌、唾液腺癌。所述的用途可以是将所述蛋白分子或融合蛋白，或包含所述蛋白分子或融合蛋白的药物组合物作为单一疗法来施用，或与放疗、化疗、外科手术、生物制品、化学制品等其他肿瘤治疗方法联合施用。
本申请还进一步提供一种治疗癌症、抑制肿瘤生长或增强抗肿瘤应答的方法。所述的方法包括单独施用所述的蛋白分子或融合蛋白，或包含所述蛋白分子或融合蛋白的药物组合物，或与放疗、化疗、外科手术、生物制品、化学制品等其他肿瘤治疗方法联合施用。所述的肿瘤或癌症包括但不限于肺腺癌、粘液性腺瘤、脑低级神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、间皮瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肾癌、肝癌、急性骨髓性白血病、食管腺癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、晚期或复发非小细胞肺癌、化疗后难治性非小细胞肺癌、转移性非鳞非小细胞肺癌、晚期或复发的非鳞非小细胞肺癌、不可切除的晚期非小细胞肺癌、隐匿性非小细胞肺癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、晚期或复发性乳腺癌、局部复发性乳腺癌、炎性乳腺癌、胰腺导管癌、转移性胰腺癌、局部晚期不可切除胰腺癌、复发性胰腺癌、***癌、晚期或转移性***癌、局部晚期***癌、去势抵抗性***癌、去势后复发性***癌、局限性***癌、进展性***癌、结肠直肠癌、直肠腺癌、大肠癌、转移性结直肠癌、晚期或复发性结肠癌、晚期或复发性直肠癌、局部复发性直肠癌、局部复发性结肠癌、胃腺癌、胃癌、不可切除性胃癌、转移性胃癌、局部晚期或复发性胃癌、胃肠道间质瘤、胆道癌、胆管癌、胆囊癌、不可切除或转移性胆道癌、不可切除或转移性胆管癌、不可切除或转移性胆囊癌、***癌、***癌、***癌、子***、局部晚期***、复发性***、转移性***、转移性***癌、晚期或复发***鳞癌、晚期或复发***腺癌、子宫体子宫内膜样癌、膀胱癌、人***瘤病毒感染、头颈部癌、复发或转移性头颈部癌、下咽癌、喉癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、咽喉癌、鼻旁窦和鼻腔癌、唾液腺癌。
术语解释
除非另行指明，本申请所用的技术和科学术语的含义等同于本领域普通技术人员的普遍理解。对于本申请一个术语存在多个定义的情况，除非另行指明，应采用本节所用定义。
“蛋白分子”在本文中有时称融合蛋白。
“TGFβ RII”或“TGFβ受体II”是指具有野生型人TGFβ受体2同种型B序列的多肽或蛋白，例如SEQ ID NO：35所示的多肽，或具有与SEQ ID NO：35所示氨基酸序列基本相同的序列的多肽。
TGFβ RII的“结合TGFβ的片段”或“TGFβ结合片段”是指TGFβRII中具有TGFβ结合活性的片段，约占TGFβ RII序列的至少0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、35％、50％、75％、90％、95％、99％、或100％。该片段通常是可溶片段，例如人TGFβ RII的胞外结构域或其变体。
如本文所用，术语“抗体”是指具有至少一个抗原结合结构域的结合蛋白。本申请的抗体和其片段可以是整个抗体或其任何片段。因此，本申请的抗体和片段包括单克隆抗体或其片段和抗体变体或其片段，以及免疫缀合物。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、Fv片段、Fd片段、Fd’片段、分离的CDR区、单链Fv分子(scFv)和本领域已知的其他抗体片段，以及经过任何本领域已知修饰的抗体(例如糖基化修饰、化学修饰等)。抗体和其片段还可以包括重组多肽、融合蛋白和双特异性抗体。本文公开的抗PD-L1抗体和其片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类。抗体和其片段可以是嵌合抗体、人源化抗体或完整的人抗体。
“嵌合抗体”是下述抗体：所述抗体具有衍生自一种物种的重链可变结构域的至少一部分和轻链可变结构域的至少一部分；以及衍生自另一物种的恒定区的至少一部分。例如，在一个实施方案中，嵌合抗体可以包含鼠类可变结构域和人恒定区。
“人源化抗体”是下述抗体：所述抗体含有衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)；和衍生自人抗体的框架区以及恒定区。例如，抗PD-L1抗体可以包含衍生自一种或多种鼠类抗体的CDR以及人框架区和恒定区。本文提供了示例性人源化抗体。包含本文提供的重链CDR和轻链CDR的另外的抗PD-L1抗体或其变体可以使用任何人框架序列产生，并且也包括在本申请中。在一个实施方案中，适用于在本申请中使用的框架序列包括在结构上与本文提供的框架序列类似的那些框架序列。可以在框架区中进行另外修饰以改进本文提供的抗体的特性。此类另外的框架修饰可以包括化学修饰；点突变以降低免疫原性或去除T细胞表位；或使突变回复为原始种系序列中的残基。在一些实施方案中，此类修饰包括对应于本文示例的突变的那些修饰，包括对种系序列的回复突变。例如，在一个实施方案中，本文提供的人源化抗体的VH和/或VL的人框架区中的一个或多个氨基酸被回复突变为亲本鼠类抗体中对应的氨基酸。
如本文所用，术语“衍生的”当用于指相对于参考抗体或其他结合蛋白的分子或多肽时，意指能够与参考抗体或其他结合蛋白特异性地结合相同表位的分子或多肽。
如本文所用，术语“EC50”是指有效浓度，抗体的50％最大应答。如本文所用，术语“IC50”是指抑制浓度，抗体的50％最大应答。EC50和IC50两者均可以通过ELISA或FACS分析或本领域已知的任何其他方法进行测量。
“抗原结合片段”是指保留全长抗体的抗原结合功能的片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、Fd、Fd’、分离的CDR区和单一结构域VHH片段和本领域已知的其他抗体片段，或将上述片段进行任何本领域已知修饰的片段。
“连接肽”是指将融合蛋白中抗体或其抗原结合片段的C末端与TGFβ结合结构域的N末端相连接的多肽或肽段，优选具有合成来源的氨基酸序列。本文所采用的连接肽可选自(G4S)xG，其中x可选地为3-6的整数，优选为4-5，最优选为4。
“同一性”是指两个参考序列之间的相似性，同一性百分比是指通过本领域技术人员熟知的序列比较算法，将序列或序列指定区域进行比较所得出的百分数。
“基本相同”是指序列之间具有至少约80％及以上(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的同一性。
“受试者”是指哺乳动物，包括人和非人动物，优选的受试者是人。
“治疗”包括治疗性治疗以及防范性治疗或预防性措施，通过给予受试者治疗剂来减少所述疾病、紊乱，或病症(例如，癌症或肿瘤)的至少一种症状或缓解症状的发展。
“癌症”是指以异常方式增殖的细胞的集合。
除非另外特别说明，否则单数术语涵盖复数术语，并且复数术语涵盖单数术语。除非另外特别说明，否则词语“一个”或“一种”意指“至少一个”或“至少一种”。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
除特别声明外，本申请的“约”是指是指在所给定的具体数值范围±5％范围内波动，优选在±2％范围内波动，更优选在±1％范围内波动。
如本文中所述，任何百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括在列举的范围内的任意整数的值，且适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指出。
在本文中，除非另有说明，否则术语“包含、包括和含有”或等同物为开放式表述，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它已确定的出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。而且，在任何国家，在本中对这些出版物的任何引用并不构成关于该出版物成为本领域的公知常识的一部分的认可。
附图说明
图1.抗PD-LI抗体-TGFβ RII融合蛋白结构示意图，通过(G4S)4G连接肽将抗PD-L1抗体重链的C端与TGFβ受体II胞外结构域的N末端相连。
图2A.报告基因法检测hu5G11-hIgG1-TGFβ RII的PD-L1端生物学活性；图2B.报告基因法检测M7824的PD-L1端生物学活性。
图3.ELISA法检测hu5G11-hIgG1-TGFβ RII与PD-L1的体外结合活性。
图4.ELISA法检测hu5G11-hIgG1-TGFβ RII与TGF-β1的体外结合活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请进行进一步的描述，然而，本申请中这些实施例仅用于阐明而不限制本申请的范围。同样，本申请不限于本文描述的任何具体优选的实施方案。本领域技术人员应该理解，对本申请技术特征所作的等同替换或相应的改进仍属于本申请的保护范围之内。除特别说明的以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。
实施例1融合蛋白瞬转表达质粒的构建和表达
构建抗PD-L1抗体-TGFβ RII融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII，如图1所示。该分子的轻链具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列；该分子的重链(SEQ ID NO：33)是融合蛋白，其包含抗人PD-L1抗体(SEQ ID NO：32)的重链、人TGFβ RII的胞外结构域氨基酸序列(SEQ IDNO：36)以及将前两者相连的(G4S)4G连接肽(SEQ ID NO：37)。
hu5G11-hIgG1-TGFβ RII轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：27)：
hu5G11-hIgG1-TGFβ RII重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)：
PD-L1抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)：
人TGFβ RII胞外结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)：
连接肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：37)：
采用全基因合成抗PD-L1抗体-TGFβ RII融合蛋白重链核酸序列(SEQ ID NO：34)和轻链核酸序列(SEQ ID NO：28)，连接到真核表达载体中，优选pcDNA3.1(+)表达载体，构建目的表达质粒，对质粒进行大抽制备目的质粒。采用ExpiFectamineTM CHO转染技术将重链和轻链的表达质粒导入ExpiCHO-STM细胞内，进行目的蛋白的瞬时表达，获得的细胞培养上清进行蛋白的纯化。
实施例2融合蛋白的分离纯化与鉴定
将实施例1得到的细胞培养上清样品加载到蛋白A亲和层析柱上，如GE公司的MabSelect，用含磷酸盐的平衡缓冲液(如10mM磷酸盐缓冲液，pH＝6.0)平衡层析柱后，再用含氯化钠的淋洗缓冲液(如含0.5M氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液，pH＝7.0～7.4)淋洗部分结合的杂质，最后用洗脱缓冲液洗脱结合在层析柱上的目的蛋白产物，得到抗PD-L1抗体-TGFβ RII融合蛋白(即，hu5G11-hIgG1-TGFβ RII)。所述的洗脱可以使用常规的方法：例如高盐缓冲液、改变PH等方法实现，如采用1M精氨酸盐酸盐(pH＝3～4)，或50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝3～4)进行洗脱。其中磷酸盐缓冲液采用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制而成，柠檬酸盐缓冲液采用柠檬酸和柠檬酸三钠配制而成。洗脱液采用紫外分析法进行定量。
实施例3融合蛋白的体外结合亲和力检测
采用Biacore T200分析融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII、M7824与PD-L1和TGFβ的亲和力。其中，M7824为CN106103488中的抗PD-L1/TGFβ阱，重链和轻链序列分别如本申请的SEQ ID NOs：42和43所示。编码重链和轻链的DNA序列合成后克隆到表达载体中，将轻链和重链表达载体共转染到ExpiCHO-STM中，细胞在8％CO2、37℃培养箱中孵育，然后使用proteinA填料根据实施例2所述纯化培养上清，得到M7824。
1)检测融合蛋白与PD-L1亲和力：将Anti-hIgG1(Fc)Antibody通过氨基偶联的方法连接到CM5芯片表面，偶联量约8000～9000RU。使用CM5芯片分别捕获融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII和M7824，然后使用运行缓冲液将PD-L1蛋白(Sinobiological，10084-H08H)稀释至20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM，测定不同浓度PD-L1蛋白及空白对照(运行缓冲液)与融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII和M7824相互作用的信号，从而获得结合和解离曲线。之后用3mol/L MgCl2缓冲液再生至基线平稳。
2)检测融合蛋白与TGFβ的亲和力：将Anti-hIgG1(Fc)Antibody通过氨基偶联的方法连接到CM5芯片表面，偶联量约8000～9000RU。使用CM5芯片分别捕获融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII和M7824，然后使用运行缓冲液将TGFβ蛋白(Sinobiological，10804-H08H)稀释至1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM，测定不同浓度TGFβ蛋白及空白对照(运行缓冲液)与融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII和M7824相互作用的信号，从而获得结合和解离曲线。之后用3mol/L MgCl2缓冲液再生至基线平稳。
BiaControl Software 2.0实时采集数据信号，BiaEvaluation Software 2.0进行数据分析，数据经扣减后(即每一个循环中样品信号扣减掉空白对照信号)用Langmuir 1∶1模型拟合，计算结合速率常数Ka、解离速率常数Kd、平衡常数KD值。
表1各测试样品与PD-L1和TGFβ的亲和力
由上表可以看出，与作为对照的M7824相比，本申请的融合蛋白表现出更小的KD和Kd值，即，本申请的融合蛋白与PD-L1和TGFβ均具有更高的亲和力。
实施例4报告基因法检测hu5G11-hIgG1-TGFβ RII的PD-L1端生物学活性
取CHO-PDL1-CD3L细胞(中国食品药品检定研究院)，用CHO-PDL1-CD3L完全培养基调整活细胞密度至4～5×105cells/mL，每孔100μL加入到96孔全白细胞板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育。孵育16～20h后，取对数生长期Jurkat-PD-1-NFAT细胞(中国食品药品检定研究院)，用分析培养基调整活细胞密度至1.25-2×106cells/mL。取出细胞板，吸弃上清，以每孔50μL将Jurkat-PD-1-NFAT细胞悬液加入到上述细胞板中。将hu5G11-hIgG1-TGFβRII预稀释至浓度为56nmol/L，2倍梯度稀释，共10个稀释梯度(即稀释至约56nmol/L、约28nmol/L、约14nmol/L、约7nmol/L、约3.5nmol/L、约1.75nmol/L、约0.875nmol/L、约0.4375nmol/L、约0.21875nmol/L、约0.109375nmol/L)；将PD-L1抗体预稀释至浓度为68nmol/L，2倍稀释，共10个稀释梯度；将M7824预稀释至浓度为56nmol/L，2倍稀释，共10个稀释梯度。按照每孔50μL分别加入梯度稀释的hu5G11-hIgG1-TGFβ RII、PD-L1抗体和M7824到上述细胞培养板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育6h。将Bio-Glo Luciferase试剂(Promega，G7940)以每孔100μL加入到上述细胞板中，室温避光孵育2～3min。用多功能酶标仪(Thermo，Varioskan Flash)读取相对光单位(RLU)值。本申请实施例的融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII的PD-L1端生物学活性结果如图2A和表2所示。表2的结果表明本申请的融合蛋白具有更高的PD-L1端生物学活性。
测试样品生物学活性(％)＝(参比样品EC50值/测试样品EC50值)×100％
表2报告基因法检测各测试样品的PD-L1端生物学活性
样品 生物学活性 EC50(nmol/L)
PD-L1抗体 100％ 4.603
hu5G11-hIgG1-TGFβ RII 75.4％ 6.106
样品 生物学活性 EC50(nmol/L)
PD-L1抗体 100％ 4.151
M7824 72.5％ 5.724
注：PD-L1抗体(参比样品)为CN107001463中的人源化5G11-IgG1抗体，重链和轻链序列分别如本申请的SEQ ID NOs：23和24所示；M7824为CN106103488中的抗PD-L1/TGFβ阱，重链和轻链序列分别如本申请的SEQ ID NOs：42和43所示，制备方法参见实施例3。
实施例5酶联免疫吸附方法(ELISA)检测融合蛋白与PD-L1和TGF-β的体外结合活性
融合蛋白与PD-L1的体外结合试验
1)包被：将PD-L1重组蛋白(Sinobiological，10084-H08H)用PBS稀释至2μg/mL，100 μl/孔包被在96孔板中，4℃孵育过夜；
2)PBS+0.05％Tween 20洗涤1次，加入250μl/孔封闭液(PBS+3％BSA的溶液)封闭1～2小时；
3)用稀释液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA的溶液)将hu5G11-hIgG1-TGFβ RII预稀释至约4000ng/ml，4倍梯度稀释，共7个稀释梯度(即稀释至约4000ng/ml、约1000ng/ml、约250ng/ml、约62.5ng/ml、约15.625ng/ml、约3.90625ng/ml和约0.9765625ng/ml)。PBS+0.05％Tween 20洗涤3次后，分别加入梯度稀释的融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII和空白对照品，100μL/孔，25℃孵育1～2小时；
4)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次，以每孔100μL加入1∶3500稀释的HRP标记的羊抗人二抗(PE，NEF802001EA)，25℃孵育1小时；
5)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次，以100μL/孔加入3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)，25℃避光孵育5分钟。最后加入1M H2SO4终止反应。
6)酶标仪(Thermo Scientific，Varioskan Flash)于450nm检测吸收值，以平均吸光度值为纵坐标，以hu5G11-hIgG1-TGFβ RII浓度的对数为横坐标，计算hu5G11-hIgG1-TGFβ RII的EC50值。
融合蛋白与TGF-β的体外结合试验
1)包被：将TGF-β1重组蛋白(Sinobiological，10804-H08H)用PBS稀释至2μg/mL，100μl/孔包被在96孔板中，4℃孵育过夜；其他步骤如上所示。
本申请实施例的融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII体外结合PD-L1的结果如图3和表3所示，体外结合TGF-β1的结果如图4和表3所示，ELISA结果显示其保留了与PD-L1和TGF-β的结合活性。
表3 hu5G11-hIgG1-TGFβ RII在ELISA试验中与PD-L1和TGFβ的结合的EC50值
PD-L1端 TGF-β端
样品 EC50(ng/ml) EC50(ng/ml)
PD-L1/TGFβ RII 34.31 67.03
实施例6药代动力学分析
1)单次给药药代动力学研究：本试验采用食蟹猴作为动物模型，将其随机分为3组，每组6只，雌雄各半，每组分别单次静脉输注1、10、60mg/kg的hu5G11-hIgG1-TGFβRII融合蛋白，于给药前0h，给药开始后1min、3h、8h、24h、48h、72h、120h、168h、216h、264h、336h、504h、672h通过静脉采集全血，分离并收集上清，ELISA法检测上清中血药浓度等指标，结果见表4。
2)重复给药药代动力学研究：本试验采用食蟹猴作为动物模型，分为3组，每组10只，雌雄各半，每周1次，连续4周(共5次)静脉滴注20、60、200mg/kg的融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII，于首次给药前0h及给药开始后1min、3h、8h、24h、48h、72h、120h、168h，第3次和第4次给药前0h及给药开始后1min，第5次给药前0h及给药开始后1min、3h、8h、24h、48h、72h、120h、168h、216h、264h、336h、504h、672h通过静脉采血，分离并收集上清，ELISA法检测上清中血药浓度等指标。结果见表5，表5结果表明血清中未见hu5G11-hIgG1-TGFβ RII明显蓄积。
ELISA操作步骤如下：
1)包被：将Human PD-L1/B7-H1/CD274 Protein，Fc ta(Sinobiological，LC11NO2402)用PBS稀释至1μg/nL，100μl/孔包被在96孔板中，4℃孵育过夜；
2)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次，以每孔300μL加入封闭液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA的溶液)，25℃封闭2～3小时；
3)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次后，以每孔100μL分别加入空白对照样本、标准曲线样本、待测样本，25℃孵育1～1.5小时；
4)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次，以每孔100μL加入用封闭液稀释至终浓度为0.05μg/mL的Human TGF-β RII BiotinylatedAntibody(R&D，XL0519051)，25℃孵育1～1.5小时；
5)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次，以每孔100μL加入用封闭液1∶200稀释的Streptavidin-HRP，25℃孵育30分钟；
6)PBS+0.05％Tween 20洗涤3次，以每孔100μL加入TMB底物显色液，25℃避光孵育5～10分钟。最后以每孔100μL加入0.5M H2SO4，终止反应。
7)酶标仪于450nm检测吸收值。
表4 hu5G11-hIgG1-TGFβ RII单次给药的药代力动学参数
表5 hu5G11-hIgG1-TGFβ RII重复给药的药代动力学参数
实施例7融合蛋白对小鼠MC38移植瘤的抑制作用
IgG1的DNA序列合成后克隆到的pcDNA3.1表达载体中。使用ExpiCHO转染试剂盒(Thermo Fisher，A29133)将轻链和重链表达载体共转染到ExpiCHO-STM中。将细胞在8％CO2、37℃培养箱中培养，使用proteinA填料根据实施例2所述纯化培养上清，得到IgG1。IgG1的重链和轻链氨基酸序列如本申请SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示。
IgG1-TGFβ RII的DNA序列合成后克隆到pcDNA3.1表达载体中。使用ExpiCHO转染试剂盒(Thermo Fisher，A29133)将轻链和重链表达载体共转染到ExpiCHO-STM中。将细胞在8％CO2、37℃培养箱中培养，使用proteinA填料根据实施例2所述纯化培养上清，得到IgG1-TGFβ RII。IgG1-TGFβ RII重链和轻链氨基酸序列如本申请SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示。
采用PD-L1人源化小鼠皮下接种3×105MC38/hPD-L1细胞/只，构建小鼠结肠癌模型，待肿瘤长到50～70mm3，根据肿瘤体积分组，10只/组，静脉注射(IV)hu5G11-hIgG1-TGFβRII、IgG1和IgG1-TGFβ RII，每2天1次，共6次，注射体积0.1mL/10g体重。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，通过下列公式计算所得的T/C％或抑瘤率TGI(％)考察药物对肿瘤生长的影响。实验结束、达到实验终点、或肿瘤体积达到1500mm3，CO2麻醉处死动物，随后解剖取瘤并拍照。肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长、宽；T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C为实验结束时的治疗组、同型对照组肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的治疗组、同型对照组肿瘤体积；抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。
结果如表6所示，hu5G11-hIgG1-TGFβ RII(3.7、12.3mg/kg)对MC38/hPD-L1皮下移植瘤生长有明显抑制作用，抑瘤率分别为56％和69％，呈现剂量依赖性；IgG1-TGFβ RII(2.3mg/kg)对MC38/hPD-L1皮下移植瘤的抑瘤率为4％，没有明显疗效；其中，IgG1-TGFβRII(2.3mg/kg)与hu5G11-hIgG1-TGFβ RII(3.7mg/kg)的给药剂量处于同一量级、不存在实质性差别，这证实了相对于具有其他组成的融合蛋白(即，包含IgG1和TGFβ RII的融合蛋白)，本发明的融合蛋白表现出显著更高的抑瘤率。荷瘤小鼠对以上药物均能够较好耐受，没有明显体重下降等症状发生。
表6各测试样品对结肠癌细胞MC38/hPD-L1皮下移植瘤的疗效
注：随机分组，第一次给药时间为D0；给药频率和次数为每2天1次，共6次，给药途径为静脉注射(IV)。P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001通过T检验与IgG1组(同型对照组)对比。
实施例8电化学发光方法检测融合蛋白hu5G11-hIgG1-TGFβ RII刺激细胞因子分泌
1)液相法：用RPMI1640完全培养基调整PBMC细胞浓度至约1～2×106细胞/nl，按100μl/孔加入到96孔细胞培养板中。用RPMI1640完全培养基稀释IgG1(SEQ ID NO：38和SEQID NO：39，制备方法见实施例7)、LPS(SIGMA，L4391-1MG)、hu5G11-hIgG1-TGFβRII，配制成1000μg/mL的IgG1；10μg/mL的LPS；100μg/mI、300μg/ml、1000μg/ml的hu5G11-hIgG1-TGFβRII。将RPMI1640完全培养基作为阴性对照。将上述配制好的溶液分别取100μl加入到96孔细胞培养板中，充分混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。24小时和48小时分别取96孔板中的细胞上清，采用V-PLEX Proinflammatory Panel 1(human)试剂盒(MSD，K15049D-2)检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ含量，结果如表7所示。
2)固相法：用PBS稀释IgG1(SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39，制备方法见实施例7)、LPS(SIGMA，L4391-1MG)、hu5G11-hIgG1-TGFβ RII，配制成500μg/mL的IgG1、5μg/mL的LPS；50μg/ml、150μg/ml、500μg/ml的hu5G11-hIgG1-TGFβ RII；PBS作为阴性对照。将上述配制好的溶液以200μl/孔分别加入至96孔高吸附板对应孔中，37℃包被2h，然后取出细胞培养板，吸弃溶液，用PBS溶液清洗细胞培养板3次。用RPMI1640完全培养基调整PBMC细胞浓度至约1～2×106cells/ml，按200μl/孔加入到96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。24小时和48小时分别取96孔板中的细胞上清，采用V-PLEX Proinflammatory Panel 1(human)试剂盒(MSD，K15049D-2)检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ含量，结果如表8所示。
表7液相法检测各测试样品刺激细胞因子分泌的结果
表8固相法检测各测试样品刺激细胞因子分泌的结果
由上表结果可以看出，本申请的融合蛋白表现出引起细胞因子风暴的低可能性，因此，当向受试者给予时基本上不会存在过度激活免疫***而引发全身性炎症的风险。
实施例9融合蛋白对食蟹猴的毒性试验
采用Temp-14热敏电阻温度计检测肛温；采用大动物无创生理信号遥测***检测呼吸频率及II导联心电图；采用无创血压计测量血压(收缩压、舒张压、平均动脉压)。定性分析心电图波形，并以ecgAUTO软件分析每个时间点处30秒时段内稳定连续的心电图，指标包括心率、R-R间期、P波时间、P-R间期、QRS波时间、Q-T间期、校正Q-T间期。
单次给药毒性：本试验共6只食蟹猴，每组3只，雌雄兼有，设2个组，分别单次静脉注射300、1000mg/kg hu5G11-hIgG1-TGFβ RII，观察14天。试验期间对一般观察和体重、摄食量、体温、II导联心电图及血压、血液学、血液生化、尿液等指标进行检测，试验结束时进行大体解剖观察。试验期间动物未出现死亡或濒死现象，各项指标未见异常。
重复给药毒性：本试验共使用40只食蟹猴，分为4组，每组10只，雌雄各半，分别为空白对照组和hu5G11-hIgG1-TGFβ RII 20、60、200mg/kg组。每周1次、连续给药4周(共5次)，停药恢复观察6周。重复静脉注射给药毒性试验毒代动力学参数参见实施例6的表5。
给药结束时，60、200mg/kg组可见轻度以RBC、HGB、HCT降低为主的贫血样改变以及RET、RET％升高，200mg/kg组还可见骨髓涂片轻度红细胞系、晚幼红细胞比例升高。组织病理学检查骨髓及脾脏未见相关改变。至恢复期结束，200mg/kg组1只雌猴HGB、HCT仍未见明显恢复，红细胞形态学见血红蛋白含量降低，其余食蟹猴的上述指标均可见不同程度恢复。
给药结束时，20、60、200mg/kg组甲状腺轻微单核细胞浸润，60、200mg/kg组肾脏轻微～轻度单核细胞浸润，20mg/kg及200mg/kg组脑膜轻微单核细胞浸润。恢复期结束，除200mg/kg组脑膜病变未见明显恢复外，其余食蟹猴的脏器病变均可见一定程度恢复。
此外，各组食蟹猴一般观察、体重、摄食量、体温、II导联心电图、呼吸频率及血压、血液生化、尿液、眼科检查、骨髓涂片、免疫球蛋白、补体、循环免疫复合物、淋巴细胞亚群及细胞因子均未见明显异常改变。
由此可见，本申请的融合蛋白表现出低的急性毒性和长期毒性，因此可以预期所述融合蛋白能够在临床上表现出良好的安全性。
根据本申请所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本申请的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本申请的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。
序列表
<110> 正大天晴药业集团南京顺欣制药有限公司
正大天晴药业集团股份有限公司
<120> 一种靶向PD-L1和TGF-β的融合蛋白及其用途
<130> 2019
<150> 201910815301.2
<151> 2019-08-30
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 1
Ser Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 2
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 3
Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 4
Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Phe Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 5
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 6
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 11
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Tyr Asp Ser Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met
465 470 475 480
Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys
485 490 495
Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met
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Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val
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agcggctttg catactgggg ccaggggacc ctggtgacag tctcgagcgc ctccactaag 360
ggcccatccg tgttccctct ggcaccctcc agcaagagca caagcggagg caccgccgca 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctacttccca gaacccgtga ccgtcagctg gaatagcggc 480
gctctgacca gcggagtcca cactttcccc gcagtgctgc agtccagcgg cctgtacagc 540
ctgagcagcg tggtcactgt gccaagcagc agcctgggca ctcagaccta catctgcaac 600
gtcaaccaca agcccagcaa cacaaaggtg gacaagaagg tcgagcccaa gtcctgcgat 660
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ctgtttcccc ccaagccaaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga agtgacctgc 780
gtcgtggtgg ccgtgagcca cgaagatccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840
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gtcgtgagcg tcctgaccgt gctgcaccaa gactggctga acggcaagga gtataagtgc 960
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gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaatc actacaccca gaagtccctg 1320
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atcgtgaccg acaataacgg cgctgtgaag ttccctcagc tgtgcaagtt ctgcgatgtg 1500
cggttctcca cctgcgacaa tcagaagagc tgcatgagca actgcagcat cacctccatc 1560
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ctggagaccg tgtgccacga ccccaagctg ccttatcacg atttcatcct ggaggacgcc 1680
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agctgtagca gcgatgagtg caacgataat atcatcttta gcgaggagta taacaccagc 1800
aatcccgat 1809
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<213> Synthetic sequence
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Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
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Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttta acagaggcga gtgc 654
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Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
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<400> 18
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<400> 19
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Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
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Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
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<213> Synthetic sequence
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr
85 90 95
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<213> Synthetic sequence
<400> 23
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<213> Synthetic sequence
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Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Asn Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met
465 470 475 480
Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys
485 490 495
Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met
500 505 510
Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys
515 520 525
Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val
530 535 540
Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala
545 550 555 560
Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr
565 570 575
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580 585 590
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tacgccatgg actattgggg ccaggggact ctggtgaccg tctcgagcgc ctccactaag 360
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gtcgtggtgg ccgtgagcca cgaagatccc gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 840
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gtcgtgagcg tcctgaccgt gctgcaccaa gactggctga acggcaagga gtataagtgc 960
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caacctaggg agccacaggt ctacactctg ccccctagca gggacgagct gaccaagaac 1080
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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485 490 495
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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420 425 430
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435 440 445
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515 520 525
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Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile
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20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn
180 185 190
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys
195 200 205
Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg
210 215 220
Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu
225 230 235 240
Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala
245 250 255
Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu
260 265 270
Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys
275 280 285
Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile
290 295 300
Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln
305 310 315 320
Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr
325 330 335
Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser
340 345 350
Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys
355 360 365
Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn
370 375 380
Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser
405 410 415
Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser
420 425 430
Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr
435 440 445
Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val
450 455 460
Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu
465 470 475 480
His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly
485 490 495
Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met
500 505 510
Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg
515 520 525
Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu
530 535 540
Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys
565
<210> 36
<211> 136
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 36
Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp
20 25 30
Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys
35 40 45
Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val
50 55 60
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp
65 70 75 80
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro
85 90 95
Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met
100 105 110
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu
115 120 125
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
130 135
<210> 37
<211> 21
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly
20
<210> 38
<211> 446
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 38
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Val
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Phe Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Gly Phe Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 39
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Thr Ser Gln Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Gly Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 603
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 40
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Val
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Phe Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Gly Phe Tyr Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met
465 470 475 480
Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys
485 490 495
Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met
500 505 510
Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys
515 520 525
Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val
530 535 540
Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala
545 550 555 560
Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr
565 570 575
Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile
580 585 590
Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
595 600
<210> 41
<211> 214
<212> PRT
<213> Synthetic sequence
<400> 41
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Thr Ser Gln Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Gly Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 42
<211> 607
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
465 470 475 480
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
485 490 495
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
500 505 510
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
515 520 525
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
530 535 540
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
545 550 555 560
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
565 570 575
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
580 585 590
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp
595 600 605
<210> 43
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 43
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215

Claims (18)

1.一种蛋白，其包括：(a)结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体或其抗原结合片段；(b)人TGFβRII或其TGFβ结合片段；
其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链CDR1序列如SEQ ID NO:15所示，重链CDR2序列如SEQ ID NO:16所示，重链CDR3序列如SEQ ID NO:17所示；所述抗体或其抗原结合片段的轻链CDR1序列如SEQ ID NO:18所示，轻链CDR2序列如SEQ ID NO:19所示，轻链CDR3序列如SEQ ID NO:20所示；
所述人TGFβRII或其TGFβ结合片段的序列如SEQ ID NO:36所示。
2.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变结构域与SEQ ID NO:21示出的氨基酸序列具有至少95％的同一性，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变结构域与SEQ ID NO:22示出的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
3.如权利要求2所述的蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变结构域包含SEQ ID NO:21示出的氨基酸序列，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变结构域包含SEQID NO:22示出的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：与SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链氨基酸序列；以及与SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的蛋白，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:23所示的重链氨基酸序列；以及SEQ ID NO:24所示的轻链氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述蛋白还包含将所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其TGFβ结合片段的N末端相连的连接肽。
7.如权利要求6所述的蛋白，其中，所述连接肽为(G4S)xG，x为3-6的整数。
8.如权利要求7所述的蛋白，其中，所述连接肽具有SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8任一项所述的蛋白，其中，所述蛋白包含：与SEQ ID NO:33或SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的第一多肽氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的第二多肽氨基酸序列。
10.一种编码权利要求1-9任一项所述的蛋白的多核苷酸序列。
11.如权利要求10所述的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列包含：以SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:26示出的核酸序列，以及以SEQ ID NO:28示出的核酸序列。
12.如权利要求10或11所述的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列包含：以SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:28示出的核酸序列。
13.一种表达载体，其包含权利要求10-12任一项所述的多核苷酸序列。
14.一种细胞，其包含权利要求10-12任一项所述的多核苷酸序列或权利要求13所述的表达载体。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-9任一项所述的蛋白。
16.如权利要求1-9任一项所述的蛋白在制备治疗癌症、抑制肿瘤生长或增强抗肿瘤应答的的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述蛋白作为单一疗法来施用或与放疗、化疗、外科手术、生物制品、化学制品联合施用。
18.如权利要求16或17所述的用途，其中所述癌症或肿瘤选自：肺腺癌、粘液性腺瘤、脑低级神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、间皮瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、肾癌、肝癌、急性骨髓性白血病、食管腺癌、淋巴瘤、非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、晚期或复发非小细胞肺癌、化疗后难治性非小细胞肺癌、转移性非鳞非小细胞肺癌、晚期或复发的非鳞非小细胞肺癌、不可切除的晚期非小细胞肺癌、隐匿性非小细胞肺癌、乳腺癌、转移性乳腺癌、三阴性乳腺癌、晚期或复发性乳腺癌、局部复发性乳腺癌、炎性乳腺癌、胰腺导管癌、转移性胰腺癌、局部晚期不可切除胰腺癌、复发性胰腺癌、***癌、晚期或转移性***癌、局部晚期***癌、去势抵抗性***癌、去势后复发性***癌、局限性***癌、进展性***癌、结肠直肠癌、直肠腺癌、大肠癌、转移性结直肠癌、晚期或复发性结肠癌、晚期或复发性直肠癌、局部复发性直肠癌、局部复发性结肠癌、胃腺癌、胃癌、不可切除性胃癌、转移性胃癌、局部晚期或复发性胃癌、胃肠道间质瘤、胆道癌、胆管癌、胆囊癌、不可切除或转移性胆道癌、不可切除或转移性胆管癌、不可切除或转移性胆囊癌、***癌、***癌、***癌、子***、局部晚期***、复发性***、转移性***、转移性***癌、晚期或复发***鳞癌、晚期或复发***腺癌、子宫体子宫内膜样癌、膀胱癌、人***瘤病毒感染、头颈部癌、复发或转移性头颈部癌、下咽癌、喉癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、咽喉癌、鼻旁窦和鼻腔癌、唾液腺癌。
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