CN107840885B - Gm-csf抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人GM‑CSF蛋白。本发明还公开了上述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗GM‑CSF相关性疾病的药物中的用途。本发明的GM‑CSF抗体，能高效特异地结合人GM‑CSF分子，能治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病等自身免疫性疾病，具有很好的应用前景。

Description

GM-CSF抗体及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程抗体技术领域，尤其涉及一种抗GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)抗体及其用途。
背景技术
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)是一种具有多效性的造血细胞生长因子，在粒细胞系与巨噬细胞的发育与成熟阶段起到调控作用。近年来，研究表明GM-CSF在炎症反应与自身免疫疾病中有重要作用。GM-CSF在脂多糖的刺激下，能使巨噬细胞向炎症性巨噬细胞分化，而炎症性巨噬细胞能分泌TNF-α、IL-6、IL-12p70和IL-23等一系列炎症因子；GM-CSF对滑膜组织中的单核细胞分化为炎症性树突细胞也具有关键作用，参与诱导并维持急性关节炎的产生和发展。在炎症反应过程中，活化的T细胞分泌大量的GM-CSF因子，由于T细胞本身缺乏GM-CSF受体，而巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞表面具有此类受体，因此T细胞来源的GM-CSF通过刺激抗原递呈细胞分泌IL-1和IL-23等介导炎症发生，IL-1和IL-23又促进T细胞进一步分泌GM-CSF，从而形成一个正反馈。在小鼠关节炎模型CIA中注射GM-CSF，能够导致关节炎恶化，而GM-CSF缺乏的小鼠病情相对野生型小鼠症状相对轻，提示GM-CSF在关节炎病症中起重要的作用。相反，在CIA小鼠模型中，使用GM-CSF单克隆抗体中和GM-CSF，疾病症状得到明显地改善，滑膜炎症水平和关节软骨损害减轻。对于类风湿性关节炎患者进行血清及滑膜检测，发现GM-CSF因子水平显著增高，并与疾病活动密切相关，主要反映在骨侵蚀恶化，滑膜衬里细胞及其下层浸润大量巨噬细胞。
近几年来，生物大分子抗体药物治疗成为治疗类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病的一种新趋势，其中各种炎症细胞因子更是成为靶向抗体药物治疗的首选靶点，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等，也是目前研究的热点。这类抗体药物可以和其他二线药物联合应用，其优势在于，不产生全身性免疫抑制和不良反应较少。目前，已经上市的这类新药有：IL-1抗体(Anakinra)、TNF-α抗体(Adalimumab)、TNF-α受体融合蛋白(Etanercept)等。然而这类已经上市的细胞因子抗体药物在治疗效果上具有局限性，有相当一部分类风湿性关节炎的病人对于此类抗体药物不敏感，不具有应答性。
目前，国外针对GM-CSF因子也有多家大型制药公司在开发治疗性单克隆抗体药物，分别是GSK/Morphosys联合开发的MOR-103，Takeda开发的Namilumab和Morphotek开发的MORAb022。这些公司的上述产品已经都进入到了临床试验阶段，其中MOR-103已经完成了在类风湿性关节炎和多发性硬化症两个适应症的临床Ib及II期试验。但是由于进口大分子药物对于病人来说需要花费高昂的的费用，因此，研发新的抗GM-CSF单克隆抗体，减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决目前临床上缺乏价格优惠、效果好的GM-CSF抗体的技术问题，提供一种新的GM-CSF抗体，该GM-CSF抗体能高效特异地结合人GM-CSF因子，并能用于炎症疾病和自身免疫性疾病的抗体药物治疗，同时还能减轻病人的治疗费用负担。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人GM-CSF蛋白，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；其中，重链可变区CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明中，所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd，或者双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A-0120694和EP.A-0125023中有所描述。
本发明所述单克隆抗体可以是单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。
抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
本发明所述单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3和连接序列外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区CDR1、CDR2和CDR3，这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合特性最优化。
在一个实施方式中，鼠源的单克隆抗体包含SEQ ID NO.7所示的重链可变区序列和SEQ ID NO.18所示的轻链可变区序列。较佳地，还对其进行人源化改造。
在另一个实施方式中，所述的单克隆抗体包含SEQ ID NO.8所示的重链可变区序列，或SEQ ID NO.19所示的轻链可变区序列。
本发明所述单克隆抗体在人源化过程中，为了保持抗体与GM-CSF的结合活性，对于框架区的关键氨基酸位点予以保留(即回复突变位点)，这些氨基酸对于人源化以后的抗体活性有着至关重要的作用。
优选的，所述重链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：98R、72S、68、70L、48I、26D、29L。
所述轻链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：1E、46A、60D、70D、43S、87F。
优选的，所述的重链可变区CDR1序列的氨基端，与DYTLT(SEQ ID NO.38)或GYTFT(SEQ ID NO.39)连接。
拥有这些取代位置中任一个取代位置的抗体和拥有所有取代位置的抗体同样具有结合GM-CSF的活性。氨基酸取代可同时存在于框架区和CDR区，或单独出现在框架区或CDR区。
优选的，本发明抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.17中任意一条所示的重链可变区序列和SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.22中任意一条所示的轻链可变区序列。
在本发明的一个具体实施方案中，抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.14所示序列至少有90％；更佳地95％的一致性和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.22所示序列至少有90％；更佳地95％的一致性。因此，目标抗体可能包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.14所示序列至少有约90％；更佳地95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQID NO.22所示序列至少有约90％；更佳地95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。优选的，抗体包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.14所示序列一致和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.22所示序列一致。
在本发明的另一个具体实施方案中，抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.17所示序列至少有90％；更佳地95％的一致性和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.19所示序列至少有90％；更佳地95％的一致性。因此，目标抗体可能包含a)一个重链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.17所示序列至少有约90％；更佳地95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性和b)一个轻链，其氨基酸序列与SEQ ID NO.19所示序列至少有约90％；更佳地95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。优选的，抗体包含a)一个重链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.17所示序列一致和b)一个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQ ID NO.19所示序列一致。
除了上面所描述的氨基酸取代，目标抗体可能在重链或轻链的两端有附加的氨基酸。例如，目标抗体在重链和/或轻链的C或N末端分别可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些实施例中，目标抗体可能比这里所描述的示范性氨基酸短，其主要区别为在重链和轻链的两端分别比示范性氨基酸少1、2、3、4、5或6个氨基酸。
在本发明的另一方面，还提供了一种免疫偶联物，所述的偶联物包括所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；以及与之连接的功能性分子；所述的功能性分子选自：第二抗体或其抗原结合部分，细胞因子或其他蛋白，可检测标记物，毒素(如抑制肿瘤的毒素)。较佳地，所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。
所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
双特异性抗体拥有两种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞和功能细胞(一般为T细胞)相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤作用。
在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，该组合物包含上述单克隆抗体或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体或稀释剂。“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；还例如淀粉，纤维素及其衍生物，多元醇，海藻酸，乳化剂，着色剂，调味剂，稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，等渗盐溶液，磷酸盐缓冲液等。本发明的组合物可根据需要制成各种剂型。
在本发明的另一方面，还提供了一种分离的核酸，其编码上述单克隆抗体或其抗原结合部分的重链或轻链可变区。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸的重组表达载体。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含重组表达载体的宿主细胞。
本发明的单克隆抗体可以采用杂交瘤方法制得，也可以采用基因工程抗体方法制得。编码本发明人源化抗体的DNA序列，可根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到人源化抗体的DNA序列，然后将该序列连入合适的表达载体中。
本发明的单克隆抗体也可用稳定细胞株方法制得，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成质粒转染细胞，筛选获得稳定表达抗体的细胞株。
一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白A对特异性抗原的亲和色谱和其它柱色谱)、离心、利用溶解度差异，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中，通过收集培养基并进行纯化得到抗体。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗GM-CSF相关性疾病的药物中的用途。
所述GM-CSF相关性疾病包括炎症疾病和肿瘤疾病。其中，炎症疾病包括：类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、特发性肺纤维化、炎症性肠病、局限性肠炎、葡萄膜炎、视网膜黄斑病变、结肠炎、牛皮癣、华勒氏变性(Wallerian Degeneration)、抗磷脂综合征、急性冠脉综合症、血管再狭窄、动脉硬化症、复发性多软骨炎、急性或慢性肝炎、血管球性肾炎、以及狼疮等自身免疫性疾病。肿瘤疾病包括各种癌症，如白血病、多发性骨髓瘤、胃癌、皮肤癌等。
本发明抗体还可以用于与GM-CSF相关的科学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研究、或肿瘤、全身性自身免疫性疾病等医学和药学的应用研究。
在本发明的另一方面，还提供了所述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备诊断GM-CSF相关性疾病的药物中的用途。
在本发明的另一方面，还提供了一种治疗GM-CSF相关性疾病的药盒，其中包含所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；或其中包含所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测芯片，包含上述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测GM-CSF因子的试剂盒，包含上述的单克隆抗体或其抗原结合部分；或其中包括所述的检测芯片。
在本发明的另一方面，还提供了一种预防、缓解或治疗GM-CSF因子GM-CSF相关性疾病的方法，所述方法包括：给予需要预防、缓解或治疗的对象有效量的所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；或所述的药物组合物。可由临床医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测GM-CSF因子的方法，所述方法包括：以所述的单克隆抗体或其抗原结合部分与可检测标记物偶联，对于待测样本进行检测，从而确定待测样本中GM-CSF因子是否存在或存在量。所述的方法可以是疾病诊断方法，或非诊断方法。
本发明的GM-CSF抗体，能高效特异地结合人GM-CSF因子，通过有效中和GM-CSF，既能治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等炎症疾病，又能***疾病，在GM-CSF相关性疾病的治疗及诊断检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的亚克隆间接ELISA筛选结果图；
图2是本发明实施例1的抑制GM-CSF诱导TF-1细胞增殖反应筛选结果图；
图3是本发明实施例2的23F4抗体与人GM-CSF抗原结合活性结果图；
图4是本发明实施例3的23F4抗体与猕猴GM-CSF抗原结合活性结果图；
图5是本发明实施例4的23F4抗体竞争人GM-CSF与受体GMCSFR-α结合结果图；
图6是本发明实施例5的23F4抗体阻断GM-CSF引起的细胞内信号通路反应结果图；
图7是本发明实施例6的23F4抗体抑制GM-CSF诱导的TF-1增殖反应结果图；
图8是本发明实施例7的23F4抗体亲和力检测结果图；
图9是本发明实施例9的人源化抗体的抗原结合活性实验结果图；图中的EC50值的单位：ng/ml。
图10是本发明实施例11的人源化抗体抑制GM-CSF诱导的TF-1增殖反应结果图；
图11是本发明实施例12的人源化抗体阻断GM-CSF引起的细胞内信号通路反应结果图；
图12是本发明实施例13的人源化抗体与猕猴GM-CSF抗原结合活性结果图。
具体实施方式
本发明利用单克隆抗体制备技术，筛选获得了一个能够高效结合人GM-CSF的小鼠抗人GM-CSF单克隆抗体，命名为23F4抗体。接着，通过人源化设计实验，将23F4抗体VL中的3个互补决定区(Complementarity determining region，CDR)CDR1，CDR2以及CDR3序列移植到最佳匹配的人免疫球蛋白种系基因L8/Jk4的骨架区序列(framework sequences)上。同时，将23F4抗体VH的CDR1，CDR2以及CDR3序列移植到最佳匹配的人免疫球蛋白种系基因VH1-f/JH6的骨架区序列上。然后，将该人源化的VH以及VL基因分别克隆到含有人重链IgG1和轻链kappa链恒定区的表达载体上进行重组表达，获得数十个人源化的GM-CSF抗体。经抗原结合活性检测、亲和力测定、抑制GM-CSF诱导的TF-1增殖反应、阻断GM-CSF引起的细胞内信号通路反应等一系列实验验证，本发明的人源化GM-CSF抗体，能高效特异地结合人GM-CSF分子，适用于治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等炎症疾病，也适用于治疗各种肿瘤疾病，具有非常好的市场应用前景。
实施例1 针对人GM-CSF的小鼠单克隆抗体的产生和筛选
抗原：重组人GM-CSF蛋白(Genscript)
免疫方法：6-8周C57/BL6小鼠在免疫4天之前眼眶采血，获得血清15-30ul，存放-20℃，作为免疫前血清样本。将20ug重组人GM-CSF蛋白经皮下注射免疫C57/BL6小鼠。在初次免疫14天后将5ug重组人GM-CSF蛋白经腹腔注射加强免疫。在初免后28天进一步用5ug重组人GM-CSF蛋白皮下注射加强免疫。初免后42天再用5ug重组人GM-CSF蛋白腹腔注射进行第三次加强免疫。第三次加强免疫一周后，眼眶采血15-30ul，存放于-20℃用于测试血清效价。选择效价较高的小鼠于初免后第60天，用25ug重组人GM-CSF蛋白腹腔注射小鼠，进行最终免疫。3天后与SP20细胞进行细胞融合，数量比在10：1到5：1之间，每孔所铺脾细胞数量不超过1×105细胞。融合7天以后更换培养基，以补充营养并降低检测背景。通过间接ELISA方法及抑制GM-CSF诱导TF-1细胞系增殖功能反应筛选阳性杂交瘤细胞，将选定的杂交瘤细胞扩大培养后进行3次亚克隆，每次亚克隆均进行ELISA及抑制功能筛选鉴定阳性单克隆，最终得到一个优选的小鼠抗人GM-CSF单克隆抗体23F4。
亚克隆间接ELISA筛选检测方法：
1.重组人GM-CSF蛋白包被ELISA酶标板，每孔包被量1ug/ml，4℃过夜。
2.用含有0.5‰tween-20的PBST洗涤3次，300ul/孔。
3.加入含有1％BSA的PBS封闭1小时。
4.用含有0.5‰tween-20的PBST洗涤3次，300ul/孔。
5.加入细胞培养上清，每孔100ul，37℃孵育1小时。
6.用含有0.5‰tween-20的PBST洗涤3次，300ul/孔。
7.加入羊抗鼠-HRP，稀释倍数为10000，37℃孵育1小时。
8.用含有0.5‰tween-20的PBST洗涤3次，300ul/孔。
9.每孔加入100ul TMB显色液，10min后用2％的H2SO4终止液终止。
10.酶标仪测定OD450值。
亚克隆ELISA筛选结果：如图1所示，23A12，23F4，26E2，28G2，31A10，32C4，32C6，33C3，34C11，34H6，35B5，35C12，35E10，36E6，38A4，39F7，40B7，43E6，43G6，43G11，44F9，45F12，46B3，49B3，50C5显示出了很强的结合活性。
抑制GM-CSF诱导TF-1细胞增殖反应筛选方法：
1.细胞培养:人红系白血病细胞株TF-1用RPMI1640+10％血清+1％双抗的培养基(标准培养基,CM)添加2ng/mL的GM-CSF，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。2～3天传代一次，取细胞状态良好，处于对数生长期的细胞进行接种。
2.细胞饥饿:在细胞接板前一天下午约3点左右对生长状态良好的细胞进行饥饿处理。细胞离心去除CM，用不含有血清和GM-CSF的RPMI1640+1％双抗的培养基(基础培养基,BCM)洗一遍，然后再用BCM重悬细胞，于37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。
3.细胞接种:细胞饥饿后第二天上午约10点左右，将饥饿的细胞离心，去除培养基，用CM重悬至1.67×105个细胞/mL，在96孔板上按90μL/孔，暨1.5万/孔的细胞数接种。或者用CM重悬至3×105个细胞/mL，在96孔板上按50μL/孔，暨1.5万/孔的细胞数接种。
4.GM-CSF配制:依据之前的结果,GM-CSF选用0.05ng/mL作为终浓度。GM-CSF配制浓度为0.2ng/mL(4×)，或配制浓度为1ng/mL(20×)，用CM为稀释液。
5.参比Ab的配制:依据之前的结果，参比Ab(R&D MAB215)终浓度选取IC80对应的浓度，暨0.2μg/mL。以含4×HCM的CM为稀释液，将阳性抗体母液(100μg/mL)配制成浓度为0.8μg/mL的工作液(4×)。或以100％HCM为稀释液，将阳性抗体母液(100μg/mL)配制成浓度为4μg/mL的工作液(20×)。
6.样品的配制:杂交瘤细胞培养上清终浓度为5％。
7.预孵:将步骤4)分别和步骤5)，6)，7)中配制的阳性抗体和hybridoma上清各按体积1:1混合，在37℃孵育30min。
8.加样:向步骤3)中准备的96孔板每孔中加入步骤8)中配制的混合液，将培养板放入培养箱中，继续培养72h。同时设定cell无GM-CSF对照组和cell加GM-CSF对照组。
9.细胞活力检测:按照
Figure BDA0001116520550000091
Luminescent Cell Viability Assay说明书配制检测液，然后100μL/孔加入，轻微震荡混匀，10分钟后酶标仪上检测。
结果如图2所示，23F4,32C4和50C5三个克隆能够显著抑制GM-CSF诱导TF-1细胞增殖反应，其中以23F4最为理想。
实施例2 23F4抗体与人GM-CSF抗原结合活性
包被1ug/ml的人GM-CSF蛋白于Elisa酶标板上4℃过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1％BSA封闭液，37℃孵育1小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的23F4抗体，1ug/ml起始，3倍稀释，共10个浓度，37℃孵育1小时。洗涤3次后，加入羊抗鼠-HRP，稀释倍数为10000，37℃孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色10min后用2％的H2SO4终止液终止。酶标仪预热15min后，OD450读数，并拟合数据。结果如图3所示，得到了能够高效结合人GM-CSF的抗体23F4，其结合抗原的活性为EC50＝18.11ng/ml。
实施例3 23F4抗体与猕猴GM-CSF抗原结合活性
包被1ug/ml的猕猴GM-CSF蛋白于Elisa酶标板上4℃过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1％BSA封闭液，37℃孵育1小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的23F4抗体，1ug/ml起始，3倍稀释，共10个浓度，37℃孵育1小时。洗涤3次后，加入羊抗鼠-HRP，稀释倍数为10000，37℃孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色10min后用2％的H2SO4终止液终止。酶标仪预热15min后，OD450读数，并拟合数据如下。结果如图4所示，得到了能够高效结合猕猴GM-CSF的抗体23F4，其结合抗原的活性为EC50＝10.17ng/ml。
实施例4 23F4抗体竞争人GM-CSF与受体GMCSFR-α的结合
包被2ug/ml的重组人GMCSFR-α(CD116)蛋白于Elisa酶标板上4℃过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1％BSA封闭液，37℃孵育1小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的23F4抗体，30ug/ml起始，3倍稀释，共11个浓度及生物素标记的GMCSFR-α蛋白(0.05ug/ml)37℃孵育1小时。洗涤3次后，加入Streptavidin-HRP二抗，稀释倍数为10000，37℃孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色10min后用2％的H2SO4终止液终止。酶标仪预热15min后，OD450读数，并拟合数据如下。结果如图5所示，23F4抗体能够有效拮抗人GM-CSF与受体GMCSFR-α的结合，其IC50达到1.1ug/ml。
实施例5 23F4抗体阻断GMCSF引起的细胞内信号通路反应
用人CD14磁珠从人外周血单核细胞中分离CD14阳性的单核细胞，用人GMCSF(0.2ng/ml)刺激，同时加入不同梯度稀释的23F4抗体，37℃孵育30分钟。将细胞收集后，用含有2％FBS的PBS洗一遍，然后依次用2％PFA及冰甲醇对细胞固定、破膜，后加入PE荧光标记的抗人磷酸化STAT5抗体(pY694,BD pharmingen)染色细胞内的磷酸化STAT5水平，并用流式细胞仪检测。％of inhibition＝[1-(待检测孔PE荧光MFI)/(对照无抗体组PE荧光MFI)]×100％。
结果如图6所示，23F4抗体在浓度0.1ug/ml及1ug/ml时抑制单核细胞内磷酸化STAT5水平达到80％。
实施例6 23F4抗体抑制GM-CSF诱导的TF-1增殖反应
人红系白血病细胞株TF-1用RPMI1640+10％血清+1％双抗的培养基(标准培养基,CM)添加2ng/mL的GM-CSF,于37℃，5％CO2的培养箱中培养。2～3天传代一次，取细胞状态良好，处于对数生长期的细胞进行接种。在细胞接板前一天下午约3点左右对生长状态良好的细胞进行饥饿处理。细胞离心去除CM，用不含有血清和GM-CSF的RPMI1640+1％双抗的培养基(基础培养基,BCM)洗一遍，然后再用BCM重悬细胞，于37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。细胞饥饿后第二天上午约10点左右，将饥饿的细胞离心，去除培养基，用CM重悬至1.67×105个细胞/mL，在96孔板上按90μL/孔，暨1.5万/孔的细胞数接种。或者用CM重悬至3×105个细胞/mL，在96孔板上按50μL/孔，暨1.5万/孔的细胞数接种。GM-CSF选用0.05ng/mL作为终浓度。GM-CSF配制浓度为0.2ng/mL(4×)，或配制浓度为1ng/mL(20×)，用CM为稀释液。依据之前的结果，参比Ab(R&D MAB215)终浓度选取IC80对应的浓度，暨0.2μg/mL。以含4×HCM的CM为稀释液，将阳性抗体母液(100μg/mL)配制成浓度为0.8μg/mL的工作液(4×)。或以100％HCM为稀释液，将阳性抗体母液(100μg/mL)配制成浓度为4μg/mL的工作液(20×)。将23F4抗体按照不同浓度梯度稀释，加入铺有TF-1细胞的96孔板中，将培养板放入培养箱中，继续培养72h，之后用
Figure BDA0001116520550000111
Luminescent Cell Viability Assay检测细胞增殖。结果如图7所示，23F4抗体能够显著抑制GM-CSF诱导的TF-1细胞增殖反应，其IC50达到10.9ng/ml。
实施例7 23F4抗体亲和力检测
使用已偶联了抗鼠Fc片段抗体的CM5芯片和HBS‐EP+作为实验缓冲液，每个进样循环测定三种浓度的抗原与被捕获抗体间的结合，每个循环包括捕获抗体、不同浓度抗原的进样及再生。以10μL/min的流速，将三种抗体分别捕获在2,3和4通道。以30μL/min的流速，将逐级稀释的抗原依次进行的样品进样结合3分钟及解离20分钟。对于较强的抗原抗体结合，使用SNL方法，只对最高浓度抗原的解离持续检测60分钟。然后以10μL/min的流速，用Glycine pH 1.5进行再生以去除被捕获的抗体及抗原。数据分析:使用Biacore T200分析软件(版本号1.0)对数据进行分析。软件分析所用模型为1:1binding。23F4抗体亲和力KD＝4.17x10-11M。
结果如图8和下表1所示，23F4抗体能够高效的结合人GM-CSF，其结合的亲和力(Affinity)达到4.17x10-11M。
表1 23F4抗体亲和力检测数据
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
23F4 8.723E+05 3.635E‐05 4.168E‐11
实施例8 23F4抗体人源化设计
经测定，鼠抗人GM-CSF单克隆抗体的重链和轻链可变区的信息如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.18所示(表5)。
获得了鼠抗人GM-CSF单克隆抗体23F4的重链可变区和轻链可变区序列后，对其进行人源化改造。首先将23F4抗体的VH以VL的氨基酸序列在人免疫球蛋白(human Ig)氨基酸序列数据库进行对比和检索，找到最佳匹配的人免疫球蛋白种系基因序列(human Iggermline gene sequences)。与23F4抗体的VL蛋白序列最为相似的人的免疫球蛋白种系基因为L8/Jk4。与23F4抗体的VH蛋白序列最为相近的人的免疫球蛋白种系基因为VH1-f/JH6。23F4抗体VH的人源化设计是将下表2的23F4抗体VH的CDR1，CDR2以及CDR3序列移植到VH1-f/JH6基因的骨架区序列上。23F4抗体VL的人源化设计是将下表3的23F4抗体VL中的3个互补决定区(Complementarity determining region，CDR)CDR1，CDR2以及CDR3序列移植到L8/Jk4基因的骨架区序列(framework sequences)上。
表2 23F4抗体VH的CDR1，CDR2以及CDR3序列
CDR1 SHYLH(SEQ ID NO.1)
CDR2 WIFPGDDKTKYNEKFKG(SEQ ID NO.2)
CDR3 GTKYLNWNFDV(SEQ ID NO.3)
表3 23F4抗体VL的CDR1，CDR2以及CDR3序列
CDR1 KANQNVGTTLA(SEQ ID NO.4)
CDR2 SASYRYS(SEQ ID NO.5)
CDR3 HQYTTYPLT(SEQ ID NO.6)
通过抗体3D建模发现：鼠抗23F4可变区序列中一些骨架区氨基酸与CDR区结合甚至参与了CDR区的形成。这些氨基酸对于维持人源化抗体的活性比较重要，因此在人源化过程中应对这些鼠源的氨基酸予以保留即回复突变(Back-mutation)。如表4所示，VH上这些氨基酸是98R(即98位的R，下同)、72S、68A、70L、48I、26D、29L；VL上这个氨基酸是1E(1位的E(Kabat命名***)，下同)以及46A、60D、70D、43S、87F。人源化设计的具体氨基酸序列如表5所示，其对应的核酸序列分别是：23F4 VH(SEQ ID NO.23)、23F4 VH.1(SEQ ID NO.24)、23F4 VH.1a(SEQ ID NO.25)、23F4 VH.1b(SEQ ID NO.26)、23F4 VH.1c(SEQ ID NO.27)、23F4 VH.1d(SEQ ID NO.28)、23F4 VH.2(SEQ ID NO.29)、23F4 VH.2a(SEQ ID NO.30)、23F4 VH.2b(SEQ ID NO.31)、23F4 VH.2c(SEQ ID NO.32)、23F4 VH.2d(SEQ ID NO.33)、23F4 VK(SEQ ID NO.34)、23F4 VK.1(SEQ ID NO.35)、23F4 VK.1a(SEQ ID NO.36)、23F4VK.1b(SEQ ID NO.37)、23F4 VK.1c(SEQ ID NO.38)。
人源化的VH以及VL基因被合成后分别被克隆到含有人重链IgG1和轻链kappa链恒定区的pcDNA3.1载体上，并在293T细胞上表达，通过protein A/Gc纯化得到人源化抗体。这些抗体的重链以及轻链分别组合成为了38个人源化的GM-CSF抗体(表6)。
注：23F4的VH和VL直接克隆到含有人重链IgG1和轻链kappa链恒定区的表达载体上的抗体为嵌合抗体(Chimera)。
表4 人源化设计
Figure BDA0001116520550000131
Figure BDA0001116520550000141
表5 人源化设计的具体氨基酸序列(其中CDR区以下划线标示)
Figure BDA0001116520550000142
Figure BDA0001116520550000151
表6 38个人源化抗体的合成方案与命名
Figure BDA0001116520550000152
实施例9 人源化抗体的抗原结合活性
包被1ug/ml的人GM-CSF蛋白于Elisa酶标板上4℃过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1％BSA封闭液，37℃孵育1小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的人源化抗体，1ug/ml起始，3倍稀释，共10个浓度，37℃孵育1小时。洗涤3次后，加入anti-human IgG-HRP，稀释倍数为10000，37℃孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色10min后用2％的H2SO4终止液终止。酶标仪预热15min后，OD450读数。结果如图9所示，所有的人源化抗体与嵌合抗体(23F4 Chimera)在ELISA结合活性上非常相似，说明这些人源化抗体都能够有效的结合GM-CSF抗原。
实施例10 人源化抗体亲和力测定
使用Biacore T200对人源化候选抗体进行亲和力测定，结果见下表7，其中Hu23F4-13，Hu23F4-27和Hu23F4-36这三个抗体的亲和力较高，与嵌合抗体最为接近。
表7 人源化抗体的抗原亲和力
Figure BDA0001116520550000161
实施例11 人源化抗体抑制GM-CSF诱导的TF-1增殖反应
人红系白血病细胞株TF-1用RPMI1640+10％血清+1％双抗的培养基(标准培养基,CM)添加2ng/mL的GM-CSF,于37℃，5％CO2的培养箱中培养。2～3天传代一次，取细胞状态良好，处于对数生长期的细胞进行接种。在细胞接板前一天下午约3点左右对生长状态良好的细胞进行饥饿处理。细胞离心去除CM，用不含有血清和GM-CSF的RPMI1640+1％双抗的培养基(基础培养基,BCM)洗一遍，然后再用BCM重悬细胞，于37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。细胞饥饿后第二天上午约10点左右，将饥饿的细胞离心，去除培养基，用CM重悬至1.67×105个细胞/mL，在96孔板上按90μL/孔，暨1.5万/孔的细胞数接种。或者用CM重悬至3×105个细胞/mL，在96孔板上按50μL/孔，暨1.5万/孔的细胞数接种。GM-CSF选用0.05ng/mL作为终浓度。GM-CSF配制浓度为0.2ng/mL(4×)，或配制浓度为1ng/mL(20×)，用CM为稀释液。依据之前的结果，参比Ab(R&D MAB215)终浓度选取IC80对应的浓度，暨0.2μg/mL。以含4×HCM的CM为稀释液，将阳性抗体母液(100μg/mL)配制成浓度为0.8μg/mL的工作液(4×)。或以100％HCM为稀释液，将阳性抗体母液(100μg/mL)配制成浓度为4μg/mL的工作液(20×)。将人源化抗体按照不同浓度梯度稀释，加入铺有TF-1细胞的96孔板中，将培养板放入培养箱中，继续培养72h，之后用
Figure BDA0001116520550000171
Luminescent Cell Viability Assay检测细胞增殖。
结果如图10和下表8所示，所测人源化抗体都能有效抑制GM-CSF诱导的TF-1细胞增殖反应，其中Hu23F4-13,Hu23F4-27及Hu23F4-36这三个抗体抑制效果最强，分别达到IC50＝4.95ng/ml,IC50＝3.95ng/ml及IC50＝3.30ng/ml。
表8 人源化候选抗体抑制GM-CSF诱导的TF-1增殖反应的数据
抗体编号 抑制TF-1细胞增殖活性(IC50)
Hu23F4-chimera 8.55ng/ml
Hu23F4-5 15.58ng/ml
Hu23F4-6 7.87ng/ml
Hu23F4-13 4.95ng/ml
Hu23F4-20 8.77ng/ml
Hu23F4-23 9.08ng/ml
Hu23F4-25 12.22ng/ml
Hu23F4-27 3.95ng/ml
Hu23F4-29 27.44ng/ml
Hu23F4-36 3.30ng/ml
实施例12 人源化抗体阻断GM-CSF引起的细胞内信号通路反应
用人CD14磁珠从人外周血单核细胞中分离CD14阳性的单核细胞，用人GM-CSF(0.2ng/ml)刺激，同时加入不同梯度稀释的人源化抗体，37℃孵育30分钟。将细胞收集后，用含有2％FBS的PBS洗一遍，然后依次用2％PFA及冰甲醇对细胞固定、破膜，后加入PE荧光标记的抗人磷酸化STAT5抗体(pY694,BD pharmingen)染色细胞内的磷酸化STAT5水平，并用流式细胞仪检测。％of inhibition＝[1-(待检测孔PE荧光MFI)/(对照无抗体组PE荧光MFI)]×100％。
结果如图11所示，Hu23F4-13,Hu23F4-27及Hu23F4-36这三个抗体均能显著抑制GM-CSF引起的单核细胞内磷酸化STAT5水平，在0.1ug/ml及1ug/ml浓度下都能抑制80％左右。
实施例13 人源化抗体与猕猴GM-CSF抗原结合活性
包被1ug/ml的猕猴GMCSF蛋白于Elisa酶标板上4℃过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1％BSA封闭液，37℃孵育1小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的人源化抗体，1ug/ml起始，3倍稀释，共10个浓度，37℃孵育1小时。洗涤3次后，加入羊抗鼠-HRP，稀释倍数为10000，37℃孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色10min后用2％的H2SO4终止液终止。酶标仪预热15min后，OD450读数。
结果如图12和下表9所示，Hu23F4-13,Hu23F4-27及Hu23F4-36抗体能够有效结合猕猴GM-CSF蛋白，结合活性分别达到EC50＝7.44ng/ml，EC50＝6.25ng/ml及EC50＝7.75ng/ml。
表9 人源化抗体与猕猴GM-CSF抗原结合活性数据
抗体编号 结合猕猴GMCSF活性(EC50)
Hu23F4-13 7.44ng/ml
Hu23F4-27 6.25ng/ml
Hu23F4-36 7.75ng/ml
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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Claims (19)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人GM-CSF蛋白，该抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR1、CDR2和CDR3及轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；其中，重链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；轻链可变区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.7所示的重链可变区序列和SEQ ID NO.18所示的轻链可变区序列。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.8所示的重链可变区序列，或包含SEQ ID NO.19所示的轻链可变区序列。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：98R、72S、68A、70L、48I、26D、29L；或
所述轻链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：1E、46A、60D、70D、43S、87F。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述的重链可变区CDR1序列的氨基端，与DYTLT或GYTFT连接。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，该抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.17中任意一条所示的重链可变区序列和SEQ IDNO.20～SEQ ID NO.22中任意一条所示的轻链可变区序列。
7.一种免疫偶联物，其特征在于，所述的偶联物包括：
权利要求1-6任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；以及
与之连接的功能性分子；所述的功能性分子选自：第二抗体或其抗原结合部分，细胞因子，可检测标记物，毒素。
8.如权利要求7所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-6任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体或稀释剂。
10.一种分离的核酸，其编码权利要求1-6任一所述单克隆抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区。
11.一种重组表达载体，其包含权利要求10所述的核酸。
12.一种宿主细胞，其包含权利要求11所述的重组表达载体。
13.权利要求1-6任一所述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗 GM-CSF相关性疾病的药物中的用途；所述GM-CSF相关性疾病包括炎症疾病和肿瘤疾病；所述炎症疾病选自：类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、炎症性肠病、结肠炎、牛皮癣；或所述肿瘤疾病为白血病。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述炎症性肠病为局限性肠炎。
15.一种治疗 GM-CSF相关性疾病的药盒，其特征在于，其中包含权利要求1-6任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；或其中包含权利要求9所述的药物组合物；所述GM-CSF相关性疾病包括炎症疾病和肿瘤疾病，所述炎症疾病选自：类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化症、炎症性肠病、结肠炎、牛皮癣；或所述肿瘤疾病为白血病。
16.如权利要求15所述的药盒，其特征在于，所述炎症性肠病为局限性肠炎。
17.一种检测芯片，其特征在于，包含权利要求1-6任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
18.一种检测GM-CSF因子的试剂盒，其特征在于，其中包含权利要求1-6任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分；或其中包括权利要求17所述的检测芯片。
19.一种检测GM-CSF因子的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1-6任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分与可检测标记物偶联，对于待测样本进行检测，从而确定待测样本中GM-CSF因子是否存在或存在量；所述方法为非诊断方法。
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