CN114058740A - 可鉴别基因i型与基因ii型非洲猪瘟病毒的荧光pcr扩增引物探针组及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针。本发明的引物探针组能够有效鉴别基因I型和II型两类非洲猪瘟病毒，其包括两对特异性最强、灵敏度最高的引物组合和两条探针。
Description
技术领域
本发明涉及非洲猪瘟病毒技术领域，尤其涉及一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟病毒是世界粮农组织和世界动物卫生组织高度关注的传染病之一，我国将其列为一类动物疫病病原。最初在我国暴发的非洲猪瘟病毒为基因II型，然而近期非洲猪瘟病毒I型开始在我国出现，发病更为隐蔽，危害巨大，进一步加大了我国非洲猪瘟疫情防控的难度。非洲猪瘟病毒在全世界流行已超过一百年，由于该病毒巨大，结构复杂，目前尚未研制成功有效的商品化疫苗进行免疫防控，快速、精准的诊断是防控该病的主要手段之一。目前，诊断非洲猪瘟的荧光PCR方法主要是针对该病毒p72、CD2v、MGF360等蛋白相关基因，这些方法无法区分基因I型与基因II型。
非洲猪瘟病毒基因组全长超过190bp，编码160-170个蛋白，基因组序列AT含量高达70％以上，且具有很多重复序列，造成引物和探针设计难度极大。虽然非洲猪瘟病毒分型主要依据p72蛋白基因C端序列，但该段序列无法作为不同基因型分型PCR方法的靶基因。通过分析大量非洲猪瘟病毒基因I型和基因II型毒株的全基因序列，发现E296R基因相对保守，如果能在此保守区域设计出鉴别基因I型与II型的手段，则会有效提高非洲猪瘟的疫情防控。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒，目的是有效鉴定非洲猪瘟病毒I型与II型，具有灵敏度高、特异性好的特性。
基于上述目的，本发明提供了一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的基因II型上游引物和如SEQ ID NO.5所示的基因II型下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的基因II型探针。
本发明还提供一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR 检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的可鉴别基因I型与基因II 型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组。
优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增液，所述PCR扩增液通过PCR反应液和所述引物探针组配置而成。本发明通过建立多组分微量组合工艺技术，将试剂盒原有多种化学试剂成分包括PCR反应液和引物探针，配成荧光PCR扩增液，直接加入模板即可进行PCR扩增。
优选的，所述PCR扩增液为8μl，且PCR扩增液中添加有15mmol的 Mg2+。
所述试剂盒使用的PCR反应体系为10μl，由PCR扩增液8μl和待测DNA 模板2μl组成。
本发明发现在PCR扩增液中加入Mg2+至15mmol，可有效提升高AT含量目标基因的扩增效率。为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct 值，优选的，PCR扩增液包括TaqDNA聚合酶、Tris-HCl、EDTA、DTT、甘油和Tween-20含量分别为0.25U/μl、10mM、0.05mM、0.05mM、30％V/V、 0.1％V/V、Mg2+15mmol、各上游引物、下游引物浓度为5μM、探针引物浓度为2.5μM、dNTPs 2.5mM和ddH2O。
优选的，所述试剂盒采用的扩增反应程序为95℃30sec；40个循环，每个循环为95℃5sec，62℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。
作为一种可选的实施方式，所述第一探针与第二探针的标记用荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5，且第一探针与第二探针采用的荧光素不同。本发明的探针用任意一种荧光素标记，且不同探针标记的必须是使用不同检测通道的荧光素。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。阳性对照为含有非洲猪瘟病毒基因I型E296R基因片段的重组质粒、以及含有非洲猪瘟病毒基因 II型E296R基因片段的重组质粒，所述阴性对照为蒸馏水。
采用试剂盒检测时，当Ct值≤38，且第一探针和/或第二探针对应的通道出现特异性扩增曲线，判定含有基因I型和/或基因II型非洲猪瘟病毒。
本发明中，引物和探针设计针对病毒E296R基因，其中针对基因I型和基因II型的上游引物存在3个核苷酸的差异(上游引物3个核苷酸位点在基因I型和基因II型间存在差异，其中，第二个差异在基因I型中不保守)；下游引物存在1个核苷酸差异；探针存在2个氨基酸差异；两条探针5’端分别用HEX和FAM荧光标记，3’端均标记MGB来增加PCR退火温度，据此建立的荧光PCR方法可同时检测到基因I型和II型两类非洲猪瘟病毒。
非洲猪瘟病毒基因I型与II型序列比对及引物、探针设计位置如下(下划线处显示基因I型与II型存在的核苷酸差异)：
本发明的有益效果：本发明的引物探针组能够有效鉴别基因I型和II 型两类非洲猪瘟病毒，其包括两对特异性最强、灵敏度最高的引物组合和两条探针。本发明的试剂盒灵敏、便捷、特异性强、敏感性高、可靠性好，只需一次检测便能判定样本是否含有不同基因型的非洲猪瘟病毒，可以同时进行大批量的样本分析，为非洲猪瘟疫情的监测、防控提供有力的技术支持，具有重要的临床实用价值和很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的A组引物对扩增效果验证示意图；
图2为本发明的B组引物对扩增效果验证示意图；
图3为本发明的C组引物对扩增效果验证示意图；
图4为本发明加入5mmol的Mg2+对扩增效率的影响示意图；
图5为本发明加入15mmol的Mg2+对扩增效率的影响示意图；
图6为本发明加入30mmol的Mg2+对扩增效率的影响示意图；
图7为本发明荧光PCR特异性验证示意图；
图8为本发明基因I型的灵敏度验证示意图；
图9为本发明基因II型的灵敏度验证示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
1.非洲猪瘟I型与II型病毒荧光PCR引物、探针组合的设计
1.1引物、探针设计
通过比对104株非洲猪瘟病毒基因I型与基因II型全基因组序列(附录1)，找到能够区分两个不同型病毒最保守的基因为E296R，可有效鉴别基因 I型与基因II型，如表1(SEQ ID NO.1-6)。
表1实时PCR引物/探针设计
其中：I代表基因I型，II代表基因II型；F代表上游引物；P代表探针； R代表下游引物。
1.2荧光PCR方法的反应体系优化
优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。
1.3荧光PCR方法的反应条件
1.4结果
对非洲猪瘟病毒阳性样品进行检测。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。当Ct值≤38，FAM通道且出现特异性扩增曲线，表明样品中含有基因II型非洲猪瘟病毒；当Ct 值≤38，HEX通道且出现特异性扩增曲线，表明样品中含有基因I型非洲猪瘟；当无Ct值并且无特异性扩增曲线，表明样品无非洲猪病病毒核酸。
2.荧光PCR引物对的筛选及对比验证
针对非洲猪瘟病毒E296R基因设计针对基因I型与基因II型各3组引物，并于基因I型II型的特异性探针进行组合(3组引物对应的基因I型与基因II型的探针相同)，其中，3组引物分别为A组、B组和C组，其中B 组采用如上表1中的引物组，A组和B组的引物组如下，结果如图1所示，发现A组引物敏感性不够，B组引物扩增效果较好，C组引物存在漏检情况 (图1-3)。
A组引物(SEQ ID NO.7-10所示)，具体如下：
I-F：TGAAGTACCTTGGATGTCAAT
I-R：TAGTTAATGGCTAGGCCTACTC
II-F：CGCTTAGCTGGACAAGGTCCATAC
II-R：TTACTTTAAGCGAATTAATGCAT
B组引物(SEQ ID NO.11-14所示)，具体如下：
I-F：AAATCTTACGTTTTACAAAT
I-R：TGATTACCCAAATTCTGAC
II-F：ATTCGTTTCCCATGGCCAT
II-R：GCGGTTTAAACTAACTTTG
3.荧光PCR反应体系优化
由于非洲猪瘟基因序列AT含量高达70％以上，普通的PCR反应体系扩增效率较低。因此，通过对PCR反应体系进行优化，在PCR反应体系调整不同浓度的Mg2+，如图2-4所示，发现加入终浓度15mmol的Mg2+可有效提升高AT含量目标基因的扩增效率，终浓度30mmol的Mg2 +不见提升扩增效率。
4.荧光PCR方法特异性验证
利用本专利中建立荧光PCR方法对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒2型(PCV2) 和猪细小病毒(PPV)进行扩增，结果均为阴性，无特异性扩增曲线(图5)。
5.荧光PCR方法敏感性验证
将已知浓度(1000000拷贝数)的质粒连续做10倍倍比稀释后作为模板，用荧光PCR进行扩增，验证敏感性如图6和图7所示。实时荧光PCR 对基因I型和基因II型的检测下限均为10个拷贝。
6.荧光PCR方法重复性验证
将已知浓度(1000000拷贝、10000拷贝、100拷贝)的质粒作为模板，分别让一名操作人员在同一天重复6次检测，验证方法的组内重复性；分别让两名操作人员在不同时间操作3次，计算组间的重复性。如下表2所示，结果显示该方法的组内和组间重复性好，变异系数分别在0.23％～1.93％和 0.08％～3.49％。
表2.荧光PCR方法重复性验证
7.荧光PCR对不同类型样品的检测
取不同类型阳性样品DNA进行检测，并与OIE推荐的荧光PCR方法进行比较，如下表3所示，结果显示OIE推荐的方法检测结果均为阳性，但不能区分基因I型和基因II型；而本发明中的方法也均为阳性，且基因分型均为基因II型。
表3.荧光PCR方法和OIE推荐方法对不同类型阳性DNA的验证与比对
附录1：104株非洲猪瘟病毒I型与II型全基因组序列用于本专利中PCR引物和探针的设计
其中，下划线部分为基因II型。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组及检测试剂盒
<130> 1
<141> 2021-12-18
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 10
ttactttaag cgaattaatg cat 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 11
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<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
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<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 13
attcgtttcc catggccat 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Synthetic)
<400> 14
gcggtttaaa ctaactttg 19
Claims (7)
1.一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.1所示的基因I型上游引物和如SEQ ID NO.2所示的基因I型下游引物，所述第一探针包括如SEQ ID NO.3所示的基因I型探针，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.4所示的基因II型上游引物和如SEQ ID NO.5所示的基因II型下游引物，所述第二探针包括如SEQ ID NO.6所示的基因II型探针。
2.一种可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR扩增引物探针组。
3.根据权利要求2所述可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增液，所述PCR扩增液通过PCR反应液和所述引物探针组配置而成。
4.根据权利要求3所述可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增液为8μl，且PCR扩增液中添加有15mmol的Mg2+。
5.根据权利要求2所述可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用的扩增反应程序为95℃30sec；40个循环，每个循环为95℃5sec，62℃30sec；每个循环的第二步收集荧光信号。
6.根据权利要求2所述可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述第一探针与第二探针的标记用荧光素选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5，且第一探针与第二探针采用的荧光素不同。
7.根据权利要求2所述可鉴别基因I型与基因II型非洲猪瘟病毒的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测时，当Ct值≤38，且第一探针和/或第二探针对应的通道出现特异性扩增曲线，判定含有基因I型和/或基因II型非洲猪瘟病毒。
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