CN114057874B - 抗cd44的单链抗体及其在制备***的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种抗CD44的单链抗体及其在制备***的药物中的用途，该抗CD44的单链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。本公开提供的表达抗CD44的单链抗体的T淋巴细胞能够特异性杀伤CD44阳性的肿瘤细胞，且特异性较高、杀伤能力较强。

Description

抗CD44的单链抗体及其在制备***的药物中的用途
技术领域
本公开涉及医药生物技术领域，具体地，涉及一种靶向CD44的嵌合抗原受体、其编码核酸、表达载体、细胞、药物组合物和它们的用途。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是人工合成的T细胞受体，由抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。抗原结合结构域位于T细胞膜外，包括单链抗体或配体，用于特异性地结合靶抗原。胞内信号传导结构域位于T细胞膜内，用于向T细胞内传导信号以刺激T细胞产生免疫反应。
CAR能够靶向识别肿瘤细胞表面的靶抗原，因此，表达CAR的T细胞能够用于靶向杀伤肿瘤细胞。然而，现有的表达嵌合抗原受体CAR的T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力仍然较弱。
发明内容
本公开的目的是克服现有的表达嵌合抗原受体CAR的T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力仍然较弱的问题，提供一种抗CD44的单链抗体。
为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种抗CD44的单链抗体，该抗CD44的单链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
第二方面，本公开还提供一种核酸，该核酸编码第一方面所述的抗CD44的单链抗体；优选地，所述核酸具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
第三方面，本公开还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有依次连接的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述抗原结合结构域的氨基酸序列包括第一方面所述的抗CD44的单链抗体的氨基酸序列；
优选地，所述抗原结合结构域包括抗CD44的单链抗体和/或抗CD133的单链抗体，所述胞内信号传导结构域包括抗TIM3的单链抗体和/或IL7Rα或者IL7Rα的截短体；
更优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或者SEQ ID NO.7中任一项所示的氨基酸序列；
特别优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
第四方面，本公开还提供一种融合核酸，所述融合核酸编码第三方面所述的融合蛋白；
优选地，所述融合核酸具有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13中任一项所示的核苷酸序列；
更优选地，所述融合核酸具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
第五方面，本公开提供一种表达载体，所述表达载体***有表达框，所述表达框包括编码抗原结合分子的第一核酸片段和编码胞内信号传导分子的第二核酸片段，所述抗原结合分子中含有第一方面所述的抗CD44的单链抗体，所述第一核酸片段与所述第二核酸片段之间***有IRES元件或2A肽编码序列；
优选地，所述表达框为第四方面所述的融合核酸。
第六方面，本公开提供一种表达嵌合抗原受体的细胞，该表达嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染第五方面所述的表达载体后得到，所述嵌合抗原受体中含有第一方面所述的抗CD44的单链抗体。
可选地，所述宿主细胞为T细胞。
第七方面，本公开提供第一方面所述的抗CD44的单链抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述的融合核酸、第五方面所述的表达载体、第六方面所述的表达嵌合抗原受体的细胞在制备***的药物中的用途。
可选地，所述肿瘤为脑胶质瘤。
第八方面，本公开提供一种药物组合物，该药物组合物的有效成分包括第六方面所述的表达抗CD44嵌合抗原受体的细胞。
通过上述技术方案，本公开提供的表达抗CD44的单链抗体的T淋巴细胞能够特异性杀伤CD44阳性的肿瘤细胞，且特异性较高、杀伤能力较强。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开实施例提供的CAR-T 1细胞的流式细胞仪检测结果图；
图2是本公开实施例提供的CAR-T 2细胞的流式细胞仪检测结果图；
图3是本公开实施例提供的CAR-T 3细胞的流式细胞仪检测结果图；
图4是本公开实施例提供的CAR-T 4细胞的流式细胞仪检测结果图；
图5是本公开实施例提供的CAR-T 5细胞的流式细胞仪检测结果图；
图6是本公开实施例提供的CAR-T 6细胞的流式细胞仪检测结果图；
图7是本公开实施例提供的CAR-T 7细胞的流式细胞仪检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种抗CD44的单链抗体，该抗CD44的单链抗体的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
CD44是肿瘤细胞表面的一种抗原，能够在多种肿瘤细胞，特别是肿瘤干细胞上表达，表达水平的高低与肿瘤侵袭能力直接相关。针对CD44设计抗CD44的单链抗体，并利用抗CD44的单链抗体构建嵌合抗原受体T细胞，能够特异性识别并杀伤CD44阳性的肿瘤细胞。
本公开的发明人发现，表达上述抗CD44的单链抗体的T淋巴细胞能够特异性杀伤CD44阳性的肿瘤细胞，且特异性较高、杀伤能力较强。
本公开的第二方面提供一种核酸，该核酸编码第一方面所述的抗CD44的单链抗体；优选地，所述核酸具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本公开的第三方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有依次连接的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述抗原结合结构域的氨基酸序列包括第一方面所述的抗CD44的单链抗体的氨基酸序列；优选地，所述抗原结合结构域包括抗CD44的单链抗体和/或抗CD133的单链抗体，所述胞内信号传导结构域包括抗TIM3的单链抗体和/或IL7Rα或者IL7Rα的截短体；更优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7中任一项所示的氨基酸序列；特别优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO.3所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28和CD3组成。SEQ IDNO.4所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、抗CD133的单链抗体、CD28和CD3组成。SEQ IDNO.5所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28、IL7Rα截短体和CD3组成。SEQ ID NO.6所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28、CD3、T2A和抗TIM3的单链抗体组成。SEQ ID NO.7所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28、IL7Rα截短体、CD3、T2A和抗TIM3的单链抗体组成。SEQ ID NO.8所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、抗CD133的单链抗体、CD28、IL7Rα截短体、CD3、T2A和抗TIM3的单链抗体组成。
当T淋巴细胞能够表达具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的融合蛋白时，该T淋巴细胞对CD44阳性的肿瘤细胞的特异性更高、杀伤能力更强。
本公开的第四方面提供一种融合核酸，所述融合核酸编码第三方面所述的融合蛋白；优选地，所述融合核酸具有SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13中任一项所示的核苷酸序列；更优选地，所述融合核酸具有SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列用于编码SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
本公开的第五方面提供一种表达载体，所述表达载体***有表达框，所述表达框包括编码抗原结合分子的第一核酸片段和编码胞内信号传导分子的第二核酸片段，所述抗原结合分子中含有第一方面所述的抗CD44的单链抗体，所述第一核酸片段与所述第二核酸片段之间***有IRES元件或2A肽编码序列；优选地，所述表达框为第四方面所述的融合核酸。
本公开的第六方面提供一种表达嵌合抗原受体的细胞，该表达嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染第五方面所述的表达载体后得到，所述嵌合抗原受体中含有第一方面所述的抗CD44的单链抗体。可选地，所述宿主细胞为T细胞。
本公开的第七方面提供第一方面所述的抗CD44的单链抗体、第二方面所述的核酸、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述的融合核酸、第五方面所述的表达载体、第六方面所述的表达嵌合抗原受体的细胞在制备***的药物中的用途。可选地，所述肿瘤为脑胶质瘤。
本公开的第八方面提供一种药物组合物，该药物组合物的有效成分包括第六方面所述的表达抗CD44嵌合抗原受体的细胞。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例1
本实施例用于说明表达载体的构建。
(1)采用全序列合成方法，分别合成如SEQ ID NO.9～14所示的核苷酸序列。SEQID NO.9～14所示的核苷酸序列分别依次用于编码SEQ ID NO.3～8所示的融合蛋白。其中，上述各融合蛋白的组成如下：
G1：SEQ ID NO.3所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28和CD3组成；
G2：SEQ ID NO.4所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、抗CD133的单链抗体、CD28和CD3组成；
G3：SEQ ID NO.5所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28、IL7Rα截短体和CD3组成；
G4：SEQ ID NO.6所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28、CD3、T2A和抗TIM3的单链抗体组成；
G5：SEQ ID NO.7所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、CD28、IL7Rα截短体、CD3、T2A和抗TIM3的单链抗体组成；
G6：SEQ ID NO.8所示的融合蛋白由抗CD44的单链抗体、抗CD133的单链抗体、CD28、IL7Rα截短体、CD3、T2A和抗TIM3的单链抗体组成。
(2)采用pLVX-IRES-ΔNGFR(购自Clontech公司，货号为631982)作为载体，采用常规方法分别***步骤(1)中合成的6种核苷酸序列，得到本实施例的6种慢病毒表达载体。
实施例2
本实施例用于说明表达抗CD44的单链抗体的T细胞的制备及检测。
(1)将实施例1构建的6种慢病毒表达载体和pLVX-IRES-ΔNGFR空载体分别进行慢病毒包装，然后按照下述方法分别进行T细胞的体外培养、转染和扩增。
(2)按照下述方法分离血液中的T细胞：将1mL无菌PBS与1mL血液混匀，然后缓慢加入到淋巴细胞分离液Ficoll的上层，并于4℃、400g条件下离心30min，加减速分别设置为0。离心结束后，去掉上层血浆，吸取中间白膜层细胞，加入PBS重悬洗涤，并于100g条件下离心10min，加减速正常。离心结束后，去掉上层洗涤液，加入1mL的1640+10％FBS+1％双抗+1×Glutamine培养基重悬细胞，然后利用抗人CD3/CD28磁珠(购自Thermo Fisher公司)刺激扩增，其中，重悬后细胞浓度为1×106细胞/mL，磁珠加入量为100μL，再加入100IU/mL rhIL-2(Peprotech)，刺激培养2天，得到T细胞。
(3)按照下述方法进行慢病毒转染：取7份上述分离得到的T细胞，分别加入步骤(1)包装好的慢病毒，然后加入终浓度为6μg/mL的polybrene，混匀，并于32℃、800g的条件下离心100min。离心结束后放入培养箱中继续培养24h。培养结束后将培养物于1500rpm的条件下离心15min，并将离心得到的细胞以1×106/mL的密度接种于培养板内，以rhIL2-100IU/mL刺激培养，以后每2-3天换液一次，直至2-4周，得到转染后的T淋巴细胞CAR-T 1、CAR-T 2、CAR-T 3、CAR-T 4、CAR-T 5、CAR-T 6和CAR-T 7。其中，CAR-T 1转染有SEQ IDNO.9所示的核苷酸序列，能够表达SEQ ID NO.3所示的融合蛋白；CAR-T 2转染有SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列，能够表达SEQ ID NO.4所示的融合蛋白；CAR-T 3转染有SEQ IDNO.11所示的核苷酸序列，能够表达SEQ ID NO.5所示的融合蛋白；CAR-T 4转染有SEQ IDNO.12所示的核苷酸序列，能够表达SEQ ID NO.6所示的融合蛋白；CAR-T 5转染有SEQ IDNO.13所示的核苷酸序列，能够表达SEQ ID NO.7所示的融合蛋白；CAR-T 6转染有SEQ IDNO.14所示的核苷酸序列，能够表达SEQ ID NO.8所示的融合蛋白；CAR-T7转染有空载体。
培养结束后，用PBS重悬细胞，并用流式细胞仪检测上述7种CAR-T细胞的比例及表面CAR蛋白的表达。检测方法为：分别离心收集转染后的待检测CAR-T细胞，PBS洗涤1次后弃上清，按抗体说明书加入相应检测量的单抗避光30min后，利用PBS洗涤、重悬，过膜后采用流式细胞仪进行夹心法检测，检测时使用的抗体为His-tag标记的CD44和PE标记的抗His-tag的抗体的混合物。结果如图1～7所示。
图1是本公开实施例提供的CAR-T 1细胞的流式细胞仪检测结果图；
图2是本公开实施例提供的CAR-T 2细胞的流式细胞仪检测结果图；
图3是本公开实施例提供的CAR-T 3细胞的流式细胞仪检测结果图；
图4是本公开实施例提供的CAR-T 4细胞的流式细胞仪检测结果图；
图5是本公开实施例提供的CAR-T 5细胞的流式细胞仪检测结果图；
图6是本公开实施例提供的CAR-T 6细胞的流式细胞仪检测结果图；
图7是本公开实施例提供的CAR-T 7细胞的流式细胞仪检测结果图。
由图1～6可以看出，CAR-T 1细胞、CAR-T 2细胞、CAR-T 3细胞、CAR-T 4细胞、CAR-T 5细胞和CAR-T 6细胞中均检测出区别于正常T淋巴细胞的其它细胞；由图7可以看出，CAR-T 7细胞并未检测出区别于正常T淋巴细胞的其它细胞。由此说明本实施例中转染有融合基因的CAR-T细胞均已成功表达目标融合蛋白。
实施例3
本实施例用于验证表达抗CD44单链抗体的T细胞对CD44阳性肿瘤细胞的杀伤能力。
本实施例中进行LDH释放实验检测的试剂盒购自同仁化学公司。
分别取实施例2中转染并培养得到的7种CAR-T细胞，分别与CD44阳性和CD133阳性的胶质瘤干细胞GSC20按照不同的效靶比(T细胞数量：胶质瘤干细胞数量)混合。将混合后的细胞置于96孔板中进行培养，其中，每孔中含有胶质瘤干细胞4×104个，每孔反应体系为200μL。培养条件包括：37℃，5％CO2，饱和湿度孵箱孵育4小时。
乳酸脱氢酶活性测定：离心结束后，每孔吸取上清液100μL置于96孔酶标板中，同时，每孔加入100μL LDH底物，室温避光反应30min。反应结束后，每孔加50μL终止液终止酶促反应。在酶标仪490nm测定光密度值(OD)。计算各组平均光密度值(OD)，按下式计算每种T细胞对胶质瘤干细胞的裂解率。结果如表1所示。
裂解率％＝(实验组OD-胶质瘤干细胞自发释放OD-效应细胞自然释放OD)/(胶质瘤干细胞最大释放OD-胶质瘤干细胞自发释放OD)
表1
Figure BDA0002613066320000051
由表1可以看出，本公开提供的表达抗CD44的单链抗体的T淋巴细胞能够特异性杀伤CD44阳性的肿瘤细胞，且特异性较高、杀伤能力较强。
对比例
采用靶向经典肿瘤靶点EGFR vIII的传统第二代CAR-T细胞(EGFR vIII-CD28-CD3)替换实施例3中的T细胞，然后按照实施例3的方法检测不同效靶比下该CAR-T对胶质瘤干细胞GSC20的杀伤率。检测结果见表2。
表2
Figure BDA0002613066320000052
由表2可以看出，靶向经典肿瘤干细胞靶点EGFR vIII的传统第二代CAR-T细胞对胶质瘤干细胞的杀伤力不如本公开提供的表达抗CD44的单链抗体的T细胞。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京市神经外科研究所
<120> 抗CD44的单链抗体及其在制备***的药物中的用途
<130> 17158BJNI-LGZ
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys
                245
<210> 2
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaattctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggagaagt 300
gactacaggg gctactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tcaggcagta ctagcggtgg tggctccggg ggcggttccg gtgggggcgg cagcagcgaa 420
attgtgttga cacagtctcc agccaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc 480
tcctgcaggg ccagtcagag tgttatcaac tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc 540
caggctccca ggctcctcat ctatgatgca tccaacaggg cctctggcat cccagccagg 600
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 660
gattttgcag tttattactg tcagcagcgt cgcaactggc cgctcacttt cggcggaggg 720
accaaggtgg agatcaaa 738
<210> 3
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
            260                 265                 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
        275                 280                 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
    290                 295                 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
                325                 330                 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
            340                 345                 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
        355                 360                 365
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
    370                 375                 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385                 390                 395                 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
                405                 410                 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
            420                 425                 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
        435                 440                 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
    450                 455                 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 4
<211> 727
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                245                 250                 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
            260                 265                 270
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
        275                 280                 285
Thr Phe Thr Asp Phe Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
    290                 295                 300
Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asp Pro Gly Thr Gly Asp Thr Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Asn Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser
                325                 330                 335
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr
            340                 345                 350
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Gly Ala Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
        355                 360                 365
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly
    370                 375                 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
385                 390                 395                 400
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
                405                 410                 415
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
            420                 425                 430
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly
        435                 440                 445
Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
    450                 455                 460
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
465                 470                 475                 480
Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe
                485                 490                 495
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
            500                 505                 510
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
        515                 520                 525
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
    530                 535                 540
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
545                 550                 555                 560
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser
                565                 570                 575
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
            580                 585                 590
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
        595                 600                 605
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
    610                 615                 620
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
625                 630                 635                 640
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
                645                 650                 655
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
            660                 665                 670
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
        675                 680                 685
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
    690                 695                 700
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
705                 710                 715                 720
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
                725
<210> 5
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
            260                 265                 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
        275                 280                 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
    290                 295                 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
                325                 330                 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
            340                 345                 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu
        355                 360                 365
Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys
    370                 375                 380
Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile
385                 390                 395                 400
His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu
                405                 410                 415
Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu
            420                 425                 430
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
        435                 440                 445
Gln Asn Gln Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
    450                 455                 460
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
465                 470                 475                 480
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
                485                 490                 495
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
            500                 505                 510
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
        515                 520                 525
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
    530                 535                 540
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
545                 550                 555                 560
Pro Pro Arg
<210> 6
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
            260                 265                 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
        275                 280                 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
    290                 295                 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
                325                 330                 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
            340                 345                 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
        355                 360                 365
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
    370                 375                 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385                 390                 395                 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
                405                 410                 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
            420                 425                 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
        435                 440                 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
    450                 455                 460
Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
465                 470                 475                 480
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala
                485                 490                 495
Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln
            500                 505                 510
Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser His Thr Leu Ser Leu Thr
        515                 520                 525
Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser
    530                 535                 540
Trp Thr Arg Gln His Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
545                 550                 555                 560
Ser Tyr Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu
                565                 570                 575
Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser
            580                 585                 590
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp
        595                 600                 605
Ser Trp Gly Ser Asn Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
    610                 615                 620
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
625                 630                 635                 640
Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
                645                 650                 655
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
            660                 665                 670
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
        675                 680                 685
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
    690                 695                 700
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
705                 710                 715                 720
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
                725                 730                 735
Glu Ile Lys
<210> 7
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
                245                 250                 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
            260                 265                 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
        275                 280                 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
    290                 295                 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser
305                 310                 315                 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
                325                 330                 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
            340                 345                 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu
        355                 360                 365
Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys
    370                 375                 380
Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile
385                 390                 395                 400
His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu
                405                 410                 415
Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu
            420                 425                 430
Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
        435                 440                 445
Gln Asn Gln Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
    450                 455                 460
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
465                 470                 475                 480
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
                485                 490                 495
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
            500                 505                 510
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
        515                 520                 525
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
    530                 535                 540
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
545                 550                 555                 560
Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
                565                 570                 575
Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu
            580                 585                 590
Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
        595                 600                 605
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser His Thr Leu Ser Leu Thr Cys
    610                 615                 620
Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp
625                 630                 635                 640
Thr Arg Gln His Pro Gly Met Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser
                645                 650                 655
Tyr Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr
            660                 665                 670
Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser
        675                 680                 685
Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Ser
    690                 695                 700
Trp Gly Ser Asn Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
705                 710                 715                 720
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
                725                 730                 735
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
            740                 745                 750
Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
        755                 760                 765
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly
    770                 775                 780
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
785                 790                 795                 800
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
                805                 810                 815
Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
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Ile Lys
<210> 8
<211> 1093
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Asp Tyr Arg Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
            180                 185                 190
Arg Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
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Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp Ile Asp Pro Gly Thr Gly Asp Thr Ala
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Tyr Asn Leu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser
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Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr
            340                 345                 350
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Leu Gly Ala Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly
        355                 360                 365
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly
    370                 375                 380
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser
385                 390                 395                 400
Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
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Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser
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    690                 695                 700
Ser Phe Tyr Gln Asn Gln Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
705                 710                 715                 720
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
                725                 730                 735
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
            740                 745                 750
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
        755                 760                 765
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
    770                 775                 780
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
785                 790                 795                 800
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
                805                 810                 815
Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly
            820                 825                 830
Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln
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Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser
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Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
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Lys Val Glu Ile Lys
    1090
<210> 9
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggagaagt 300
gactacaggg gctactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tcaggcagta ctagcggtgg tggctccggg ggcggttccg gtgggggcgg cagcagcgaa 420
attgtgttga cacagtctcc agccaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc 480
tcctgcaggg ccagtcagag tgttatcaac tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc 540
caggctccca ggctcctcat ctatgatgca tccaacaggg cctctggcat cccagccagg 600
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 660
gattttgcag tttattactg tcagcagcgt cgcaactggc cgctcacttt cggcggaggg 720
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 660
gattttgcag tttattactg tcagcagcgt cgcaactggc cgctcacttt cggcggaggg 720
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atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 840
gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 900
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<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
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gactacaggg gctactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
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tcctgcaggg ccagtcagag tgttatcaac tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc 540
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ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa 660
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accaaggtgg agatcaaaac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 780
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aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 1020
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<210> 13
<211> 2502
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ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagattaag 3279

Claims (16)

1.一种抗CD44的单链抗体，其特征在于，该抗CD44的单链抗体的氨基酸序列为SEQ IDNO. 1所示的序列。
2.一种核酸，其特征在于，该核酸编码权利要求1所述的抗CD44的单链抗体。
3.根据权利要求2所述的核酸，其中，所述核酸具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有依次连接的抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；所述抗原结合结构域的氨基酸序列包括权利要求1所述的抗CD44的单链抗体的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述抗原结合结构域包括抗CD44的单链抗体和/或抗CD133的单链抗体，所述胞内信号传导结构域包括抗TIM3的单链抗体和/或IL7Rα或者IL7Rα的截短体。
6.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 3、SEQ IDNO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6或者SEQ ID NO. 7中任一项所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 8所示的氨基酸序列。
8.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸编码权利要求4所述的融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的融合核酸，其中，所述融合核酸具有SEQ ID NO. 9、SEQ IDNO. 10、SEQ ID NO. 11、 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13中任一项所示的核苷酸序列。
10.根据权利要求8所述的融合核酸，其中，所述融合核酸具有SEQ ID NO. 14所示的核苷酸序列。
11.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体***有表达框，所述表达框包括编码抗原结合分子的第一核酸片段和编码胞内信号传导分子的第二核酸片段，所述抗原结合分子中含有权利要求1所述的抗CD44的单链抗体，所述第一核酸片段与所述第二核酸片段之间***有IRES元件或2A肽编码序列。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其中，所述表达框为权利要求8所述的融合核酸。
13.一种表达嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，该表达嵌合抗原受体的细胞由宿主细胞转染权利要求11所述的表达载体后得到，所述嵌合抗原受体中含有权利要求1所述的抗CD44的单链抗体。
14.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述宿主细胞为T细胞。
15.权利要求1所述的抗CD44的单链抗体、权利要求2所述的核酸、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求8所述的融合核酸、权利要求11所述的表达载体、权利要求13所述的表达嵌合抗原受体的细胞在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途。
16.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物的有效成分包括权利要求13所述的表达抗CD44嵌合抗原受体的细胞。
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