CN104379600A - 抗hla单克隆嵌合免疫球蛋白,使用这种单克隆嵌合免疫球蛋白的方法和试剂盒 - Google Patents
抗hla单克隆嵌合免疫球蛋白,使用这种单克隆嵌合免疫球蛋白的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及测定含有抗体的液体介质中抗HLA抗体的量的方法。
Description
本发明涉及测定含有抗体的液体介质中抗HLA抗体的量的方法。本发明也涉及用于实施这种方法的抗I类HLA或抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白。本发明特别涉及适于可以尤其作为用于检测和量化液体介质、尤其是生物学液体介质的抗HLA抗体的标准反应试剂的所述单克隆嵌合免疫球蛋白。本发明特别涉及具有一方面单克隆抗体的功能和另一方面嵌合结构的所述单克隆嵌合免疫球蛋白。本发明也涉及使用所述单克隆嵌合免疫球蛋白检测液体介质中的抗HLA抗体的标准化检测方法和量化液体介质中抗HLA抗体的定量方法。特别地，本发明涉及患者、尤其是接受了移植或等待移植的患者的血清中抗HLA抗体的定量方法。
此外，本发明涉及用于实施所述方法的诊断试剂盒。特别地，本发明涉及适合于能够定量液体介质、尤其是在患者上取样的生物学液体的抗HLA抗体的方法和试剂盒，其是精确的、可靠的和快速的。
在器官移植领域中，自1930年代以来已知在供者的组织组(例如由HLA抗原(人类白细胞抗原)所限定的)与受者的免疫***(尤其是抗体)之间的相容性对于器官移植的成功是必需的。
HLA抗原由是非常免疫原性的两类膜蛋白：I类HLA分子和II类HLA分子携带。因此，个体暴露于同种异体HLA抗原，即外人的并不同于其自身的抗原，可以引起针对这些抗原的免疫应答的发展。该免疫应答可以是细胞介导的(同种异体反应性T淋巴细胞)或体液介导的(抗HLA抗体的合成)。
I类HLA抗原由三个基因HLA-A、HLA-B和HLA-C编码，其多态性由分别为HLA-A、HLA-B和HLA-C的三个等位基因系列负责。II类HLA抗原由基因HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR编码。
在器官移植中，关键的是使向等待移植的患者提供表达该患者早已或已经被免疫的HLA抗原的移植物的危险最小化甚至抑制它。这是因为，在该情况下，干预超急性的，即在移植后少于24小时的延迟内的体液排斥的危险是重要的。此外，在移植监测的背景下，提早检出在接受移植物的患者中存在针对移植物的抗原的抗体使得能够尽可能提早地治疗所述接受了移植物的患者以便试图阻止能够引起移植物破坏的体液应答的发展。
因此，被移植的患者和等待移植的患者的同种异体免疫的监测对于确保移植物和被移植患者的存活是首要的。
在该背景下，必不可少的是，能够研究、鉴定和定量在等待移植的患者中和在被移植的患者中的抗HLA抗体。已经开发了许多研究这些抗HLA抗体的技术。
特别地，已知所谓的“补体依赖微量淋巴细胞毒性”技术。该技术包括将患者尤其是移植接受者的血清，在兔补体存在下，呈递给一系列已知其HLA类型的细胞。如果特异于由这些细胞携带的HLA抗原的抗体(Ac)存在于所测试的血清中，并且这些抗体能够激活补体(IgM类的和IgG-1和IgG-3亚类的抗体)，那么补体依赖的细胞裂解(CDC，补体依赖的细胞毒性)就揭示了抗体的存在。借助于一组表达不同HLA抗原的细胞，因此可以检出这些抗体，然后鉴定其特异性。该参考技术使得能够检测对于移植物最危险的溶细胞性抗HLA抗体。然而，相对于更近期的技术而言，该技术具有低灵敏性。该技术需要拥有各种各样的来自己知其HLA表型的供者的淋巴细胞，需要在体外培养大量的HLA类型的细胞系，因此其实施是复杂和繁重的。
也知道更灵敏的技术，例如固体支持物上的免疫酶法测定(ELISA，酶联免疫吸附测定)。此外，最近出现了在流式细胞术原理上设计的与流式检测联合的免疫荧光测定技术。流式免疫荧光测定的原理包括将纯化的I类HLA或II类HLA抗原固定在聚苯乙烯珠的表面。识别I类HLA或II类HLA抗原的抗HLA抗体与结合在珠表面的抗原相结合并在洗涤聚苯乙烯珠后，由偶联至荧光基团的抗IgG二抗进行揭示。二抗通过流式细胞术进行检测。此外其荧光强度也被定量。
对于检出试验，混合使用多个类型的珠，每一类型的珠在表面上携带多个HLA抗原，要么I类的，要么II类的。这样一种方法使得能够检测抗HLA抗体的存在，然而不能鉴定特异性。
相反，对于抗体特异性的鉴定和表征，混合使用多个类型的珠，每一类型的珠在表面上携带唯一的HLA抗原。
已知用于检测和鉴定抗HLA抗体的试剂盒。它们包含包被有I类HLA抗原或II类HLA抗原的聚苯乙烯珠和包被有人IgG的聚苯乙烯珠。偶联至藻红蛋白的抗人IgG二抗和作为阴性对照的没有抗HLA抗体的血清也已商业化。这种阴性对照适合于定量二抗在聚苯乙烯珠上的非特异固定。此类试剂盒不包含任何阳性对照，也不包含任何灵敏性对照，也不包含任何使得能够从所测得的荧光强度开始准确推断所分析的介质中抗HLA抗体的浓度(例如，以摩尔/升或克/升表示的)的标准物。
此外，没有校准和/或灵敏性对照的此类试剂盒不能测定分析方法的灵敏性阈值，即能够确认所观察到的信号显著高于测量背景噪音的最小信号值。
为了克服在抗HLA抗体的检出和/或定量方法中阳性对照的这一缺点，免疫学和组织相容性实验室使用针对多种HLA抗原免疫的多个个体的多个血清的混合物作为阳性对照。
在这种阳性对照中，被免疫个体的血清的每一种抗体的各自浓度是未知的。这种血清混合物不能将荧光测量强度与血清混合物的特异性抗体的浓度(摩尔/升或克/升)相关联。因此它不能定量被移植的或等待移植的患者的血清中存在的抗体。因此不得不再评估实际发生超急性体液应答的危险。
这种血清混合物的反应性从一种抗原到另一种是可变的并且其使用不能固定对所研究的每一种HLA抗原的检测阈值。此外，这种来自患者血清的多克隆抗体混合物以有限量可用并且很快就耗尽。因此，为了结果的标准化，需要用本身以可变的量也可用的在实验室之间不会变化的另一种混合物代替它。从一个批次到另一个的血清混合物的可变性需要这些批次的频繁验证，这些批次从一个批次到另一个既不是可比较的也不是可重现的。
通过使用这种血清混合物，发明者人证明了(图2、3和4)，与每一类型聚苯乙烯珠相关的荧光强度的值取决于由每一类型聚苯乙烯珠所携带的I类或II类HLA抗原的性质。此外，该与每一类型聚苯乙烯珠相关的该荧光强度值随时间，尤其是在五个月内显示大的变化。该值在1000和20000平均荧光单位之间变化(图4，阴影线直方图)。
结果表明，对于所有聚苯乙烯珠所测得的荧光强度的平均值具有大的离差(通过其均方根偏差所计算的)，其不能定量液体介质的抗HLA抗体。在作为现有技术标准举例说明给出的本专利申请图4(阴影线直方图)中展示了这种离差。
这种荧光强度测量值离差不能，特别是对于低的荧光强度值，区别低的但表示了低浓度抗HLA抗体的存在的荧光强度值与不能与测量背景噪音相区别的低的荧光强度值。
由于前面所陈述的相同原因，这种在现有技术中作为阳性对照使用的制备物不能精确地测定存在于液体介质中，尤其是在被移植的和等待移植的患者上取样的血清中的抗体浓度。
本发明旨在通过提供在抗I类HLA抗体或抗II类HLA抗体的血清学分析中，尤其是在器官移植的背景下，作为标准化试剂和阳性对照和灵敏性试剂的单克隆嵌合免疫球蛋白，来克服这些缺点。
本发明旨在通过提供适合于允许患者血清中抗HLA抗体的可靠定量的单克隆嵌合免疫球蛋白来克服前面所述的缺点。这样一种单克隆嵌合免疫球蛋白特别地适合于允许检测患者中针对移植物抗原的抗体的突然出现，甚至对于非常低浓度的这种抗体。
本发明旨在提供适合于抗HLA抗体检测方法的标准化的单克隆嵌合免疫球蛋白。特别地，提供使得能够精确地确定检测阈值，根据本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白允许生物学家验证抗体的研究方法。
本发明旨在提供这样的单克隆嵌合免疫球蛋白，其适合于允许尽可能提早地检测针对移植物的HLA抗原的抗HLA抗体的突然出现。这种提早检测特别地使得能够尽可能快地检测体液排斥并因此快速地开出治疗性地治疗所移植的器官的排斥的方案。
本发明旨在提供这样一种单克隆嵌合免疫球蛋白，其允许对生物学液体中抗HLA抗体的研究方法进行标准化和校准。
本发明还旨在提供这样一种单克隆嵌合免疫球蛋白，其能够允许按照合乎医学分析实验室认可的新的规定标准，认可抗HLA抗体的检出、定量和表征的标准化方法。在法国，医学分析实验室，尤其是免疫学实验室，应当满足COFRAC(法国认可委员会(Comité d’Accréditation))的15189标准。
本发明也旨在提供至少一种在检出抗HLA抗体，尤其是通过免疫荧光测定法的试验中，作为定量校准试剂的单克隆嵌合免疫球蛋白的组合物。
特别地，本发明旨在提供至少一种在通过技术检出抗HLA抗体的试验中作为定量标准物的单克隆嵌合免疫球蛋白的这样一种组合物。
本发明也旨在提供至少一种在通过流式细胞术、通过ELISA技术或补体依赖微量淋巴细胞毒性来检出抗HLA抗体的试验中作为定量标准的单克隆嵌合免疫球蛋白的这样一种组合物。
因此，本发明旨在提供这样一种单克隆嵌合免疫球蛋白和至少一种单克隆嵌合免疫球蛋白的这样一种组合物，所述单克隆嵌合免疫球蛋白用作定量标准代替来自一个或几个患者血清的混合物的复杂抗体混合物的。
本发明也旨在提供这样一种单克隆嵌合免疫球蛋白，其可以大量获得并且其生产就抗HLA抗体的浓度和组成而言是完全标准化的。
此外，本发明旨在提供这样一种单克隆嵌合免疫球蛋白的稳定水溶液，所述单克隆嵌合免疫球蛋白浓度对于检出和/或定量和/或表征液体介质中抗HLA抗体方法的标准化而言是已知的。
因此，本发明涉及测定包含抗体的液体介质中抗HLA抗体的量的方法，其中：
-制备单克隆嵌合免疫球蛋白的多种溶液(Sn)，尤其是水溶液，每一种溶液(Sn)具有所述单克隆嵌合抗体的确定浓度值(Cn)；然后
-使每一种溶液(Sn)与相同确定量的至少一种固定化的HLA抗原相接触；和
-建立校准曲线，其中每一个确定的浓度值(Cn)与参数的测量值(Vn)相关，所述测量值(Vn)表示与每一种固定化的HLA抗原的确定量有关的单克隆嵌合免疫球蛋白的量(Qn)；和
-从确定的浓度值(Cn)和测量值(Vn)对(Cn，Vn)形成作为单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液(Sn)的单克隆嵌合免疫球蛋白确定的浓度(Cn)的函数的测量值(Vn)的校准和变化曲线；和
-计算参数的值，所谓的阈值，在该阈值以外单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度显著高于0；
本发明还涉及这样的方法，其中单克隆嵌合免疫球蛋白由下述构成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链(H)包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
并且在于：
-每一条轻链(L)包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组。
在本文本中，表述“I类HLA抗原”和“II类HLA抗原”(HLA为人白细胞抗原)，是指其性质是人的抗原。
因此，本发明也在于提供体外定量抗HLA抗体的方法，其中从本发明的至少一种单克隆嵌合免疫球蛋白的溶液开始制作校准曲线，所述单克隆嵌合免疫球蛋白在所述溶液中具有已知的浓度。
这是因为，本发明人已看到在现有技术中不存在用于使得能够可靠地和可重现地定量评价液体介质中抗I类HLA抗体和抗II类HLA抗体的浓度的已知方法。
有利地和根据本发明，所述参数选自由荧光参数、发光参数和比色法参数组成的组。
有利地和根据本发明，单克隆嵌合免疫球蛋白的确定浓度(Cx)为至多等于10-4g/mL，尤其是在10-10g/mL和10-4g/mL之间。低于10-4g/mL的任何浓度可以通过稀释高浓度、特别是10-4g/mL级别的溶液而获得。
有利地，制备本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的逐渐增加的稀释物。使用已知浓度的本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的这些溶液将单克隆嵌合免疫球蛋白溶液(Sn)的每一个浓度(Cn)与参数的测量值(Vn)相关联，所述参数选自由荧光参数-尤其是是通过定量免疫荧光测定法(用包被有HLA抗原的珠的技术)或通过流式细胞术技术(用淋巴细胞进行的)测得的荧光参数-发光参数-尤其是化学发光参数-和比色法参数组成的组。
有利地和根据本发明，在本发明的方法中，选择由下述组成的组中的每一个特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和每一个特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体：脊椎动物的单克隆抗体，特别是哺乳动物、尤其是小鼠、大鼠、兔、仓鼠和人的单克隆抗体，和非哺乳动物的脊椎动物、尤其是两栖动物、鸟类特别是鸡形目的单克隆抗体。
有利地和根据本发明，所述参数选自由荧光参数、发光参数和比色法参数组成的组。
有利地和根据本发明，所述荧光参数为荧光强度。因此，荧光参数的每一个值(Vn)为荧光强度。
有利地和根据本发明，通过选自由下列组成的组的技术来测量参数的每一个测量值(Vn)：多重定量免疫荧光测定法、流式细胞术、通过固体支持物上的免疫酶法测定方法(ELISA)、竞争结合法和和通过补体依赖微量淋巴细胞毒性的方法。
有利地，在本发明方法的第一个变化形式中：
a)每一个固定化的HLA抗原为固定化在分割状态颗粒形成的固体支持物的颗粒表面上的HLA抗原；
b)在适合于在固体支持物的HLA抗原与单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液的单克隆嵌合免疫球蛋白之间形成稳定结合的条件下，使固定化的HLA抗原与针对固体支持物的HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液相接触，然后
c)通过洗涤除去未与固体支持物的HLA抗原结合的单克隆嵌合免疫球蛋白，然后
d)在适合于在单克隆嵌合免疫球蛋白和二抗之间形成稳定结合的条件下，使与固体支持物的HLA抗原结合的单克隆嵌合免疫球蛋白与二抗溶液相接触，所述二抗选自由下列组成的组：荧光二抗、发光二抗和光吸收的和针对单克隆嵌合免疫球蛋白的二抗，然后
e)通过洗涤除去未与单克隆嵌合免疫球蛋白结合的二抗，然后
f)测量与固体支持物的每一个颗粒结合的二抗的至少一个参数并给予该测量一个所述参数的测量值(Vn)，所述参数选自由下列组成的组：荧光参数-尤其是通过定量免疫荧光测定法(用包被有HLA抗原的珠的技术)或通过流式细胞术技术(用淋巴细胞进行的)测得的荧光参数-发光参数-尤其是化学发光参数-和比色参数，然后；
g)形成校准曲线；然后，
h)从该校准曲线推断表明待分析溶液中存在抗HLA抗体的荧光强度阈值。
有利地，在第二个变化形式中和根据本发明，每一个固定化的HLA抗原是存在于至少一个细胞尤其是在体外培养的细胞的表面上的HLA抗原。
有利地，在本发明的方法的该第二个变化形式中：
i)每一个固定化的HLA抗原是存在于至少一个细胞的表面上的HLA抗原；
j)在适合于在细胞的HLA抗原与单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液的单克隆嵌合免疫球蛋白之间形成稳定结合的条件下，使存在于至少一个细胞的表面上的HLA抗原与单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液相接触，然后；
k)通过洗涤除去未与细胞的HLA抗原结合的单克隆嵌合免疫球蛋白，然后
1)在适合于在单克隆嵌合免疫球蛋白与二抗之间形成稳定结合的条件下，使与细胞的HLA抗原结合的单克隆嵌合免疫球蛋白与针对单克隆嵌合免疫球蛋白的二抗的溶液相接触；然后
m)通过洗涤除去未与单克隆嵌合免疫球蛋白结合的二抗，然后；
n)测量与每一个细胞结合的二抗的至少一个参数并给予该测量一个所述参数的测量值(Vn)，所述参数选自由下列组成的组：荧光参数-尤其是通过定量免疫荧光测定法(用包被有HLA抗原的珠的技术)或通过流式细胞术技术(用淋巴细胞进行)测得的荧光参数，发光参数-尤其是化学发光参数-和比色参数，然后；
o)形成校准曲线；然后，
p)从该校准曲线推断表明待分析溶液中存在抗HLA抗体的荧光强度阈值。
有利地和根据本发明，分割状态的固体支持物是基本上球形颗粒形状和适合于允许其用流式荧光测定法分析的大小。
有利地和根据本发明，通过非线性回归从荧光强度的测量值确定校准曲线。
有利地和根据本发明，所述液体介质选自由生物学液体尤其是从个体上取样的血清组成的组。
有利地和根据本发明，所述个体为选自由等待移植的患者和接受了移植的患者组成的组的患者。
有利地和根据本发明，特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体W6/32。
有利地和根据本发明，特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体F3.3。
本发明还提供了单克隆嵌合免疫球蛋白在抗HLA抗体的检出方法-尤其是研究方法或鉴定方法-或定量方法中的用途，所述方法选自由多重定量免疫荧光测定法、流式细胞术方法、通过固体支持物上的免疫酶法测定方法(ELISA)和通过补体依赖微量淋巴细胞毒性方法组成的组。
特别地，本发明涉及单克隆嵌合免疫球蛋白在抗HLA抗体的检出或定量方法中作为标准化试剂和阳性和灵敏性对照的用途，所述方法选自由多重定量免疫荧光测定法、流式细胞术方法、通过固体支持物上的免疫酶法测定方法和通过补体依赖微量淋巴细胞毒性方法组成的组，其特征在于：所述单克隆嵌合免疫球蛋白由下列组成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链(H)包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
和在于：
-每一条轻链(L)包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组。
因此，在竞争性测定中，使用其中重链的恒定部分(CH)和轻链的恒定部分(CL)由人IgA的恒定部分组成的本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白。此类本发明的IgA类单克隆嵌合免疫球蛋白适合于至少部分地抑制患者血清中IgG(或IgM)类抗HLA多克隆抗体的结合。血清IgG的结合被本发明的IgA类单克隆嵌合免疫球蛋白的抑制使得能够证明IgG与通过下述方法的抗HLA抗体检出测定中所使用的免疫吸附支持物的结合特异性：具有在仪器上的流式读数的多重免疫荧光测定法、流式细胞术、ELISA技术和补体依赖微量淋巴细胞毒性。
特别地，IgA类单克隆嵌合免疫球蛋白使得能够区分对应于血清中抗HLA IgG的真正存在的特异信号与对应于IgG吸附在存在HLA抗原的支持物上的非特异性信号。用于抗HLA IgG的研究的本发明的IgA类单克隆嵌合免疫球蛋白的该竞争通过在上的定量免疫荧光测定法得到证实。
本发明的IgG类和IgM类单克隆嵌合免疫球蛋白可以用作通过合适的任何技术(补体依赖微量淋巴细胞毒性或在流式细胞术)就在器官移植前进行的器官受者与供者之间的直接相容性(交叉配血)检验的阳性对照和灵敏性对照和在检测免疫吸附支持物上的IgG或IgM类抗体的任何技术(ELISA或在聚苯乙烯珠上的定量免疫荧光测定法)中的阳性对照和灵敏性对照。
本发明也涉及特异于I类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列组成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链(H)包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
和在于：
-每一条轻链(L)包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组。
有利地，形成特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体，以便可以识别在所有I类HLA抗原上的共同表位。
有利地和根据本发明，特异于I类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白选自由下列组成的组：
-包含至少一条序列SEQ ID_NO 1所示轻链的单克隆嵌合免疫球蛋白，和
-包含至少一条选自由下列组成的组的重链的单克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQ ID_NO 2的重链、序列SEQ ID_NO 3的重链和序列SEQID_NO 4的重链。
本发明也涉及特异于II类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列组成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于，其选自由下列组成的组：
-包含至少一条序列SEQ ID_NO 5所示轻链的单克隆嵌合免疫球蛋白，和
-包含至少一条选自由下列组成的组的重链的单克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQ ID_NO 6的重链、序列SEQ ID_NO 7的重链和序列SEQID_NO 8的重链。
有利地，形成特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体，以便可以识别在基本上所有II类HLA抗原上的共同表位。
有利地，本发明的特异于I类或II类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白是指这样的免疫球蛋白，其中
ο重链和轻链在其恒定部分的性质是人的。特别地，重链恒定部分选自由IgA重链的恒定部分、IgG重链的恒定部分和IgM重链的恒定部分组成的组，并且轻链的恒定部分选自由κ链和λ链组成的组，和
ο轻链和重链的可变部分选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组。在这种单克隆嵌合免疫球蛋白中，人抗体重链恒定部分(CH)与人抗体轻链恒定部分(CL)一起占单克隆嵌合免疫球蛋白质量的60％这样的级别。此外，这种单克隆嵌合免疫球蛋白为单克隆抗体，即特异于唯一一个单态性表位。
有利地，每一个单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的脊椎动物生物-尤其是非人类脊椎动物生物-的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的脊椎动物生物-尤其是非人类脊椎动物生物-的单克隆抗体组成的组。
在整个文本中，“非人类脊椎动物生物”，理解为除了人以外的高等有机活生物体。这种脊椎动物生物特别地具有免疫***。这种脊椎动物生物特别地选自由非人类哺乳动物-尤其是小鼠、大鼠、兔和仓鼠-两栖动物和鸟类-尤其是鸡形目-组成的组。这种非人类脊椎动物生物特别地为实验室动物。然而，这种单克隆抗体可以选自由人单克隆抗体组成的组。
有利地和根据本发明，每一个特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和每一个特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体选自由下列组成的组：脊椎动物的单克隆抗体，特别地哺乳动物尤其是小鼠、大鼠、兔、仓鼠和人的单克隆抗体，和非哺乳脊椎动物尤其是两栖动物、鸟类特别是鸡形目的单克隆抗体。
有利地和根据本发明，特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体W6/32。
有利地和根据本发明，特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体F3.3。
此外，本发明涉及至少一种以水性组合物的本发明单克隆嵌合免疫球蛋白的稳定溶液。
本发明也涉及至少一种本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的这种水溶液，所述水溶液具有预先确定浓度的所述单克隆嵌合免疫球蛋白。
本发明也涉及单克隆嵌合免疫球蛋白，其适合于可以允许测定包含抗体的液体介质的抗HLA抗体的量。
另一方面，本发明扩大到体外定量液体介质的抗HLA抗体的试剂盒，所述试剂盒包含确定量的至少一种本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白和用于实施本发明方法的说明书。
因此，本发明涉及体外定量液体介质的抗HLA抗体的试剂盒，所述试剂盒包含预先确定量的至少一种单克隆嵌合免疫球蛋白，其包含：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
和在于：
-每一条轻链包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组；
所述试剂盒也包含用于施行本发明方法的说明书。
本发明还涉及测定包含抗体的液体介质的抗HLA抗体的量的方法、单克隆嵌合免疫球蛋白、其用途和用于该测定的试剂盒，其特征在于全部地或部分地组合上文或下文提及的特征。
本发明的其他目的、特征和优点将在下文说明书而出现，其参考了仅作为非限制性实施例给出的代表本发明优选实施方案的附图，其中：
-图1为按照阴性对照处理的17个类型珠的荧光强度的时间变化图示；
-图2为作为时间函数的现有技术阳性对照的12个类型的携带I类HLA抗原的珠的荧光强度变化图示；
-图3为作为时间函数的现有技术阳性对照的5个类型的II类HLA抗原珠的荧光强度变化图示；
-图4为本发明阳性对照和现有技术阳性对照的荧光强度的比较直方图：
ο图4A为在12个类型的用现有技术阳性对照(阴影线直方图)和用本发明阳性对照(实心直方图)处理的I类HLA珠上测得的荧光强度的直方图表示；
ο图4B为在5个类型的用现有技术阳性对照(阴影线直方图)和用本发明阳性对照(实心直方图)处理的II类HLA珠上测得的荧光强度的直方图表示；
-图5为本发明的I类和II类的嵌合单克隆免疫球蛋白在T淋巴细胞和B淋巴细胞上固定的流式细胞术分析；
-图6A为对应于12个类型的用本发明阳性对照处理的I类HLA珠的叠加的12条剂量/应答曲线的线图表示。本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度以μg/mL表示；
-图6B为对应于图6A的12个类型的用本发明阳性对照处理的I类HLA珠的平均剂量/应答曲线的线图表示。本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度以μg/mL表示；
-图7A为对应于5个类型的用本发明阳性对照处理的II类HLA珠的叠加的5条剂量/应答曲线的线图表示。本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度以μg/mL表示；
-图7B为对应于图7A的5个类型的用本发明阳性对照处理的II类HLA珠的平均剂量/应答曲线的线图表示。本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度以μg/mL表示；
-图8A为在盐水缓冲液(白色方块)中和在60g/L的人白蛋白溶液中(黑色菱形)保存的本发明的抗I类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白的剂量/应答曲线的比较线图表示；
-图8B为在盐水缓冲液(白色方块)中和在60g/L的人白蛋白溶液中(黑色菱形)保存的本发明的抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白的剂量/应答曲线的比较线图表示；
-图9为抗I类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgGl K[W6/32])轻链并且相应于序列SEQ ID_NO 1的肽序列；
-图10为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGl K[W6/32]重链并且相应于序列SEQ ID_NO 2的肽序列；
-图11为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[W6/32]重链并且相应于序列SEQ ID_NO 3的肽序列；
-图12为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgM K[W6/32]重链并且相应于序列SEQ ID_NO 4的肽序列；
-图13为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGl K[F3.3]轻链并且相应于序列SEQ ID_NO 5的肽序列；
-图14为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[F3.3]重链并且相应于序列SEQ ID_NO 6的肽序列；
-图15为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgGl K[F3.3]重链并且相应于序列SEQ ID_NO 7的肽序列；
-图16为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgM K[F3.3]重链并且相应于序列SEQ ID_NO 8的肽序列。
实施例1-本发明的IgG/抗I类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgG1K[W6/32])的获得
抗体W6/32在Barnstable等人在1978的出版物(Barnstable CJ，Bodmer WF，Brown G，Galfre G，Milstein C，Williams AF，Ziegler A.，1978，Celle，14(1)，9-20.Production of monoclonal antibodies to group Aerythrocytes，HLA and other human cell surface antigens-new tools forgenetic analysis)中首次描述。该抗体由来自小鼠骨髓瘤细胞系(不分泌小鼠免疫球蛋白的细胞系P3-NSI/1Ag4-1)与针对人细胞免疫的小鼠淋巴细胞的细胞融合的小鼠杂交瘤分泌。已显示该抗体与在I类HLA分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C)上的公共表位反应。被识别的表位是构象表位，其取决于I类的α重链与β2微球蛋白之间的结合。所述表位需要β2微球蛋白3位的精氨酸和α链121位的赖氨酸的存在(Ladasky JJ，Shum BP，CanavezF，HN，Parham P.，(1999)，Immunogenetics，49(4)，312-320.Residue3of beta2-microglobulin affects binding of class I MHC molécules by theW6/32antibody)。
第一步，克隆并测序编码抗体W6/32的重链和轻链的转录物。
借助于两个引物通过PCR扩增重链mRNA的DNA拷贝(cDNA)，两个引物一个特异于编码前导肽的区域，另一个靶向编码恒定部分的CH1结构域的5′部分。
为扩增轻链cDNA，使用靶向前导肽的外显子的引物和靶向κC结构域的5′部分的引物。将两条链的cDNA片段克隆在大肠杆菌(E coli.)中。对克隆的片段测序。序列比对使得能够建立具有98％相同性阈值的重链与轻链cDNA的一致性(consensus)。编码可变部分的区域通过与存在于(国际免疫遗传学信息***)的数据库中的序列的比较来决定。
根据情况，已在5′处添加了编码轻链或重链的前导肽的序列并且修饰了3′处的序列以便产生用于轻链DNA的BsiWI限制位点和用于重链的NheI限制位点。这些限制位点适合于允许这些核酸序列***克隆载体pFUSE-CLIg和pFUSE-CHIg(InvivoGen，Toulouse，France)中。已合成了如此限定的序列，然后将其克隆入包含编码人κ链恒定结构域的部分(Km01同种异型；Genbank登录号：J00241)或者编码人IgG1的恒定部分的表达载体中。表达载体的限制位点使得能够与编码免疫球蛋白链的恒定部分的区域符合读框地***可变部分的cDNA。
如此获得了两个表达载体，一个编码组合了抗体W6/32的轻链可变部分与人Cκ结构域的嵌合轻链([W6/32]VL链-人Cκ)，另一个组合了抗体W6/32的重链可变部分和人Cγ1结构域([W6/32]VL-人Cγ1)。
将这两个载体通过转染引入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。为此，首先将细胞通过编码轻链的载体然后通过编码重链的载体进行转染。表达载体包含细胞毒性药物的抗性因子，从而允许有效地选择双转染的细胞。在选择期之后，将双转染的细胞通过有限稀释进行克隆并通过夹心ELISA技术在克隆上清液中揭示人IgG1κ的存在。使经如此揭示的生产克隆通过有限稀释经历多轮克隆，以便选择下文命名为Hu-IgG1K[W6/32]最有效分泌嵌合IgG1κ的克隆。
分泌在转染CHO细胞的培养上清液中的Hu-IgG1K[W6/32]通过在结合至珠的葡萄球菌蛋白A上的捕获-洗脱进行纯化。IgG1κ在酸性pH下在pH2的甘氨酸缓冲液中洗脱。洗脱液已通过浓度为750mM的磷酸氢二钠水溶液即时缓冲。将Hu-IgG1K[W6/32]的溶液保存在4℃下或在-80℃下。
单克隆嵌合免疫球蛋白(IgG1-抗I类HLA)Hu-IgG1K[W6/32]轻链的肽序列表示在图9中并且相应于序列SEQ ID_NO 1。单克隆嵌合免疫球蛋白(IgG1-抗I类HLA)Hu-IgG1K[W6/32]重链的肽序列表示在图10中并且相应于序列SEQ ID_NO 2。
本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[W6/32]的结合特异性的验证在通过密度梯度从EDTA管中取样的人血液分离的T淋巴细胞或B淋巴细胞上进行。将细胞用抗-CD3、抗-CD19和抗-CD45抗体标记。在CD45+淋巴细胞群中确定T(CD3+)和B(CD 19+)淋巴细胞。
在外周血人单核细胞(T淋巴细胞或B淋巴细胞)存在下保温单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[W6/32]，然后连续三次洗涤所述人单核细胞，接着在磷酸盐缓冲液(PBS)中三次洗涤。通过羊抗人Fcγ抗体揭示固定在人单核细胞上的单克隆嵌合免疫球蛋白的固定。结果在图5中显示并且指示抗体Hu-IgG1 K[W6/32]固定在B淋巴细胞(图5A)上和T淋巴细胞(图5C)，而抗体Hu-IgG1 K[F3.3]固定在B淋巴细胞上(图5B)但不在T细胞细胞上(图5D)。
实施例2-单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[W6/32]的特异性
接着通过使用由One公司销售的商业试剂盒，通过多重定量荧光测定技术测定了单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[W6/32]的特异性。该测定建立在间接免疫荧光反应基础之上并且使用了包被有各种不同组的HLA抗原的胶乳珠。能够识别存在于胶乳珠上的HLA抗原的抗体通过与藻红蛋白偶联的抗人IgG抗体进行揭示。通过在仪器上的流式细胞术对每一个珠量化荧光。特异于每一个珠类型的荧光标记物使得能够利用多种多样的珠(可通过其荧光识别)，每一个珠包被有给定的HLA抗原的混合物。这使得能够证明所有I类珠以基本上相同的强度被识别(图4A，I类珠)。这使我们能够得出结论：单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1K[W6/32]识别存在于所有I类HLA分子上的公共表位。
竞争实验能够证明，由小鼠的杂交瘤分泌的小鼠单克隆抗体W6/32抑制单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1K[W6/32]的固定。
实施例3-本发明IgA2和IgM同种型的抗I类HLA嵌合单克隆抗体(Hu-IgA2 K[W6/32]和Hu-IgM K[W6/32])的获得
在另两个表达载体中克隆的W6/32重链可变部分(VH[W6/32])，首先使得能够产生嵌合μ链(W6/32的可变部分和人μ重链的恒定部分(Genbank登录号：AY510104.1)，另一方面产生嵌合α2链(W6/32的可变部分和人α2重链的恒定部分，同种异型A2m(1)(Genbank登录号：J00221)。使用这两个载体转染预先用允许嵌合轻链VL[W6/32]-人K表达的载体转染的CHO细胞系的细胞。我们如此分离了分泌大量单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2K[W6/32]的CHO细胞的克隆和分泌单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgM K[W6/32]的另一克隆。按照供应商建议，嵌合IgA在与M肽(InvivoGen，Toulouse，France)偶联的琼脂糖支持物上纯化，嵌合IgM在与蛋白L(InvivoGen，Toulouse，France)偶联的琼脂糖支持物上纯化。
单克隆嵌合免疫球蛋白(IgA2-抗I类HLA)Hu-IgA2 K[W6/32]重链的肽序列表示在图11中并且相应于序列SEQ ID_NO 3。
单克隆嵌合免疫球蛋白(IgM-抗I类HLA)重链的肽序列表示在图12中并且相应于序列SEQ ID_NO 4。
单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2 K[W6/32]和Hu-IgM K[W6/32]的反应性已通过技术用Labscreen试剂盒(One)以及作为荧光二抗的与藻红蛋白偶联的羊抗人IgA抗体或羊人抗IgM抗体进行了验证。
实施例4-本发明抗II类HLA单克隆抗体(Hu-IgG1 K[F3.3])的获得
按照其原理，获得抗II类HLA单克隆抗体的方法与获得抗I类HLA单克隆抗体(W6/32)的方法是可比较的。
抗体F3.3(Elsasser，D.，Valerius，T.，Repp，R.，Weiner，G.J.，Deo，Y.，Kalden，J.R.，van de Winkel，J.G.，Stevenson，G.T.，Glennie，M.J.和Gramatzki，M.，(1996)，Blood，87(9)，3803-3812.HLA class II as potentialtarget antigen on malignant B cells for therapy with bispecific antibodies incombination with granulocyte colony-stimulating factor)由小鼠杂交瘤的唯一克隆产生。抗体F3.3识别至少一个存在于所有表达II类HLA分子的人细胞表面上的公共表位。特别地，抗体F3.3识别所有DR抗原，所有DP抗原和所有DQ2抗原。编码抗体F3.3可变部分的完整序列在上可获得(登录号：对于轻链，AY058910[VL]，和对于重链，AY058911[VH])。
合成可变部分的序列，同时对于重链，克隆入克隆载体pFUSE-CHIg(InvivoGen，Toulouse，France)中，对于轻链，克隆入pFUSE-CLIg(InvivoGen，Toulouse，France)中。载体(pFUSE-CHIg)允许产生嵌合重链VH[F3.3]-人Cγ1，载体(pFUSE-CLIg)允许产生轻链VL[F3.3]-人Cκ。使用这两个表达载体转染实施例1中所述的CHO细胞系的细胞。
此外，已将可变部分VH[F3.3]克隆在允许产生嵌合重链VH[F3.3]-人Cμ和VH[F3.3]-人Cα2的表达载体中。
抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgG1 K[F3.3])轻链的肽序列表示在图13中并且相应于序列SEQ ID_NO 5。
抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgA2 K[F3.3])重链的肽序列表示在图14中并且相应于序列SEQ ID_NO 6。
抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgG1 K[F3.3])重链的肽序列表示在图15中并且相应于序列SEQ ID_NO 7。
抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgM K[F3.3])重链的肽序列表示在图16中并且相应于序列SEQ ID_NO 8。
针对II类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[F3.3]、Hu-IgA2 K[F3.3]和Hu-IgM K[F3.3]由被合适载体转染的CHO细胞产生。嵌合IgG1在蛋白A Sépharose上纯化。嵌合IgA在肽M-琼脂糖(InvivoGen，Toulouse，France)上纯化。嵌合IgM在蛋白L-琼脂糖(InvivoGen，Toulouse，France)上纯化。
通过在例如实施例1所述的人单核细胞上的流式细胞术通过间接免疫荧光技术验证了本发明单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[F3.3]的结合特异性。结果在图5中展示并且表明本发明的抗体Hu-IgG1 K[F3.3]对人细胞强烈地反应，尤其是B淋巴细胞(图5B)和T淋巴细胞(图5D)。
此外，通过在上的多重定量免疫荧光测定技术借助于Labscreen和Labscreen single试剂盒(One)研究了本发明的抗II类HLA单克隆嵌合免疫球蛋白的特异性。
将抗体Hu-IgG1 K[F3.3]固定在试剂盒Labscreen的携带II类HLA抗原的所有珠上和试剂盒Labscreen single antigen class的携带HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ2抗原的所有珠上。
通过竞争实验已证明，单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[F3.3]和Hu-IgA2 K[F3.3]识别相同的表位。单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2 K[F3.3]的反应性通过技术用Labscreen(One-)试剂盒进行了研究，使用了与藻红蛋白偶联的羊抗人IgA抗体作为单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2 K[F3.3]固定的揭示剂。揭示了单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgA2 K[F3.3]的反应性与单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[F3.3]的反应性是相同的。
实施例5-抗HLA抗体的体外定量方法
在通过本发明的免疫荧光法体外定量包含抗体的液体介质的抗HLA抗体的方法中，作为非限制性例子，使用了Labscreen实验室试剂盒(LSM12，OneInc.，USA)，其包含：
-与纯化的和以混合物的I类HLA抗原(HLA-A、HLA-B和HLA-C)共价连接的聚苯乙烯珠；
-与纯化的II类HLA抗原(HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)共价连接的聚苯乙烯珠；
-与IgG连接的聚苯乙烯珠，所谓的阳性对照珠；
-没有表面抗原的聚苯乙烯珠，所述的阴性对照珠。这个实验室试剂盒(Labscreen)包含检出抗I类HLA抗体和抗II类HLA抗体的聚苯乙烯珠水性悬浮液。该悬浮液的聚苯乙烯珠包含多种类型的聚苯乙烯珠，每一个类型的聚苯乙烯珠通过荧光标记物与其他类型的聚苯乙烯珠相区别并且包含携带不同的I类HLA抗原和II类HLA抗原的聚苯乙烯珠。实际上，每一个类型的聚苯乙烯珠在聚苯乙烯珠的表面上具有达六个HLA-A抗原(I类)，六个HLA-B抗原(I类)，六个HLA-C抗原(I类)或六个HLA-DQ抗原(II类)，六个HLA-DR抗原(II类)，六个HLA-DP抗原(II类)。
实验室试剂盒(Labscreen)包含12个类型的I类聚苯乙烯珠和5个类型的II类珠，其中17个类型的聚苯乙烯珠的每一个的荧光强度能够同时被测量。因此，计算与同一组HLA抗原连接的每一个类型的聚苯乙烯珠的荧光强度的平均值。在该聚苯乙烯珠混合物之中，某些没有I类HLA抗原和II类HLA抗原并且作为阴性对照。
此外，在抗HLA抗体的检出反应中，实验室试剂盒(Labscreen)的使用需要阴性对照血清(LabScreen Négative Control(LSNC)血清)。该血清特征为：好像没有抗I类HLA抗体和抗II类HLA抗体地来制备它。
将在与用阴性对照处理的12个类型的携带I类抗原的珠的每一个和与5个类型的携带II类抗原的珠的每一个相关的在五个月时间内所观察到的荧光强度的平均值在下表1中给出。
表1
表1中呈现的值是低的并且表示了通过IgG对聚苯乙烯珠的非特异结合和二抗对这些珠的非特异性结合所产生的荧光。
阳性对照
实验室试剂盒(Labscreen)包含作为阳性对照的在从其表面上接枝有纯化的人IgG的聚苯乙烯珠。这种阳性对照被限定于验证二抗功能性的用途中。这种阳性对照不允许将荧光强度值转化为液体介质中抗HLA抗体的浓度值。
多克隆阳性对照
试剂盒(Labscreen)的使用者，尤其是免疫学实验室，提倡在按照现有技术体外检出抗HLA抗体时，使用来自针对HLA抗原多次免疫的个体的血清混合物作为阳性对照。作为例子，将与该多克隆对照的每一个类型的I类和II类HLA珠相关的在5个月期间测得的荧光强度的平均值在下表2中给出。
表2
在用根据现有技术的定性对照处理的I类HLA珠上测得的平均荧光的计算值为5200荧光单位的级别并且标准偏差为4900荧光单位的级别。
在用根据现有技术的定性对照处理的II类HLA珠上测得的平均荧光的计算值为8600荧光单位的级别并且标准偏差为7500荧光单位的级别。
定性对照的每一个类型的聚苯乙烯珠的荧光强度在1000至20000之间变化。每一个类型的聚苯乙烯珠(HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DQ，HLA-DR和HLA-DP)的反应的这种可变性不允许将所测得的荧光强度转化为抗HLA抗体的参考浓度的唯一曲线。此外，不可以获得所测得的荧光强度的这种转化曲线，考虑到特异于每一个类型的HLA抗原的HLA抗体飞浓度不可以在现有技术的定性对照下测定。
作为现有技术的定性对照的例子，“Labscreen”试剂盒的每一个类型的聚苯乙烯珠的荧光分析显示与每一个类型的携带I类抗原的珠(图4A中的编号6、7、8、17、69、79、84、86、87、88、89和90的珠类型)相关的荧光在平均7000荧光单位和平均12000荧光单位的级别之间变化。在每一个类型的I类HLA珠上测得的荧光强度的平均值为9600荧光单位的级别。这些值的标准偏差值为3100荧光单位的级别。
此外，“Labscreen”试剂盒的每一个类型的聚苯乙烯珠的荧光的该分析显示与每一个类型的携带II类抗原的珠(图4B中的编号91、93、95、96和97珠类型)相关的荧光在平均1000荧光单位和平均19000荧光单位的级别之间变化。在每一个类型的II类HLA珠上测得的荧光强度的平均值为13000荧光单位的级别。这些值的标准偏差值为8300荧光单位的级别。
在不知道血清混合物中每一个抗体的浓度时，这种对照因此限于单纯定性分析的用途。
本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白
使用本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白作为实验室试剂盒(Labscreen)的定量对照。制备具有2μg/mL已知浓度的实施例1至4中所述的抗I类HLA(Hu-Ig1 K[W6/32])和/或抗II类HLA(Hu-Ig1 K[F3.3])的单克隆嵌合免疫球蛋白溶液。进行与携带I类或II类HLA抗原的每一个类型的聚苯乙烯珠相关的平均荧光强度的分析。所获得的结果展示在图4中(白色直方图)。
对于“Labscreen”试剂盒的每一个类型的聚苯乙烯珠，观察到平均22000荧光单位级别的荧光强度。
特别地，该分析显示：
-与携带I类抗原的每一个类型的珠(图4A中编号6、7、8、17、69、79、84、86、87、88、89和90的珠类型，实心直方图)相关的荧光是基本上恒定的并且在平均22000荧光单位的级别。在每一个类型的I类HLA珠上测得的荧光强度的平均值为21500荧光单位的级别。这些值的标准偏差值为450荧光单位的级别。
-与每一个类型的携带II类抗原的珠(图4B中编号91、93、95、96和97的珠类型)相关的荧光是基本上恒定的并且在平均22000荧光单位的级别。这些值的标准偏差值为700荧光单位的级别。
该荧光强度值是基本上恒定的，无论聚苯乙烯珠的类型是什么(无论由聚苯乙烯珠类型所携带的HLA抗原是什么)并且相应于2μg/mL的抗体浓度。此类本发明的嵌合单克隆抗体适合于定量校准作为本发明的嵌合单克隆抗体的浓度函数的荧光反应。
作为本发明(图4A和4B中的实心直方图)和现有技术(图4A和4B中的阴影线直方图)的比较，在图4中表示了在携带I类HLA抗原的珠上和在携带II类HLA抗原的珠上揭示的平均荧光值(和标准偏差)。实施例6-体外定量抗HLA抗体的方法-“剂量/反应”曲线
为了制作“剂量/反应”曲线，在微量过滤器多孔板的每一个孔中分散300μL洗涤缓冲液(PBS)。10分钟后，通过抽吸除去洗涤缓冲液并添加5μL均匀化的“Labscreen”珠悬浮液。通过系列连续稀释获得一系列具有递减的嵌合单克隆抗体浓度的本发明嵌合单克隆抗体的溶液。阴性对照和阳性对照以相同方式平行处理。分散20μL每一种这些系列稀释液，与事先放置在多孔板孔中的聚苯乙烯珠相接触。在环境温度下并在避光下保温聚苯乙烯珠与嵌合单克隆抗体的混合物30分钟。最后，用250μL洗涤缓冲液对每一个孔进行相继的五次洗涤。随后添加100μL稀释至1/100的二抗溶液。用于与聚苯乙烯珠连接的抗HLA抗体的荧光标记的二抗为例如与藻红蛋白偶联的羊抗IgA抗体(抗-IgA-PE，AbSerotec，USA)或与藻红蛋白偶联的羊抗IgG抗体(抗-IgG-PE，InGen，USA)。当然，可以使用任何其他的与能够识别和结合本发明单克隆嵌合免疫球蛋白的恒定链的抗体偶联的荧光基团。在荧光阅读器中分析之前，将多孔板在避光下和在环境温度下放置30分钟。
在图6(抗I类HLA)和7(抗II类HLA)中显示了通过本发明方法获得的“剂量/反应”类型的校准曲线。荧光强度值以μg/mL表示的本发明单克隆嵌合免疫球蛋白浓度的函数给出。
在下表3中汇总了在I类HLA(图6B)和II类HLA(图6B)珠的每一个类型上测得的荧光强度测量值的平均值和标准偏差。
表3
进行通过上面所述滴定曲线相关数据的波茨曼类型的S形非线性回归的统计学分析。确定观察到的最小荧光值(MIN)，即在当单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度倾向于0值时曲线的渐进线的值，测定观察到的最大荧光值(MAX)，即在当单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度倾向于无穷量时曲线的渐进线的值，并且单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度值相应于特异信号的50％(MAX-MIN)。这些值在下表4中给出。
表4
实施例7-本发明单克隆嵌合免疫球蛋白Hu-IgG1 K[W6/32]和Hu-IGg1 KIF3.3]在白蛋白缓冲液介质中的稳定性分析
制备在包含60g/L浓度的人白蛋白的水性缓冲液介质中保存了两个月时间的本发明的单克隆嵌合免疫球蛋白的系列稀释液。通过技术制备实施例6所述的“剂量/反应”曲线。用针对I类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgG1 K[W6/32])获得的结果示于图8A中和用针对II类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白(Hu-IgG1 K[F3.3])获得的结果示于图8B中。由白色方块(□)识别用保存在盐水缓冲液中的单克隆嵌合免疫球蛋白获得的结果和由黑色菱形(◆)识别用保存在白蛋白缓冲液中的单克隆嵌合免疫球蛋白获得的结果。在保存在盐水缓冲液中的单克隆嵌合免疫球蛋白和保存在白蛋白缓冲液中的单克隆嵌合免疫球蛋白之间没有观察到任何显著差异。
Claims (16)
1.测定包含抗体的液体介质的抗HLA抗体的量的方法，其中：
-制备单克隆嵌合免疫球蛋白的多种溶液(Sn)，每一种溶液(Sn)具有所述单克隆嵌合抗体的确定浓度值(Cn)；然后
-使每一种溶液(Sn)与相同确定量的至少一种固定化的HLA抗原相接触；和
-建立校准曲线，其中使每一个确定浓度值(Cn)与参数的一个测量值(Vn)相关联，所述测量值(Vn)表示与每一种固定化的HLA抗原的确定量有关的单克隆嵌合免疫球蛋白的量(Qn)；
-从确定浓度值(Cn)和测量值(Vn)对(Cn，Vn)形成作为单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液(Sn)的单克隆嵌合免疫球蛋白的确定浓度(Cn)函数的测量值(Vn)的校准和变化曲线；和
-计算参数的值，所谓的阈值，在该阈值以外单克隆嵌合免疫球蛋白的浓度显著高于0；
其中单克隆嵌合免疫球蛋白由下述构成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链(H)包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
和在于：
-每一条轻链(L)包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在由脊椎动物的单克隆抗体组成的组中选择每一个特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和每一个特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述参数选自由荧光参数、发光参数和比色法参数组成的组。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述荧光参数为荧光强度。
5.根据权利要求1至4之一的方法，其特征在于：
a)每一个固定化的HLA抗原为固定化在由颗粒形成的分割状态的固体支持物颗粒表面上的HLA抗原；
b)在适合于在固体支持物的HLA抗原与单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液的单克隆嵌合免疫球蛋白之间形成稳定结合的条件下，使固定化的HLA抗原与针对固体支持物的HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白的每一种溶液相接触，然后
c)通过洗涤除去未与固体支持物的HLA抗原结合的单克隆嵌合免疫球蛋白，然后
d)在适合于在单克隆嵌合免疫球蛋白和二抗之间形成稳定结合的条件下，使与固体支持物的HLA抗原结合的单克隆嵌合免疫球蛋白与二抗溶液相接触，所述二抗选自由下列组成的组：荧光二抗、发光二抗以及光吸收并针对所述单克隆嵌合免疫球蛋白的二抗，然后
e)通过洗涤除去未与单克隆嵌合免疫球蛋白结合的二抗，然后
f)测量与固体支持物的每一个颗粒结合的二抗的至少一个参数并给予该测量一个所述参数的测量值(Vn)，所述参数选自由下列组成的组：荧光参数、发光参数和比色参数，然后
g)形成校准曲线，然后
h)从该校准曲线推断指示待分析溶液中抗HLA抗体的存在的荧光强度阈值。
6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于，所述每一种固定化的HLA抗原为存在于至少一个细胞的表面上的HLA抗原。
7.根据权利要求1至6之一的方法，其特征在于，所述特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体W6/32。
8.根据权利要求1至7之一的方法，其特征在于，所述特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体F3.3。
9.单克隆嵌合免疫球蛋白在抗HLA抗体的检出或定量方法中作为标准化试剂以及阳性和灵敏性对照的用途，所述检出或定量方法选自由多重定量免疫荧光测定法、流式细胞术方法、固体支持物上免疫酶测定方法和通过补体依赖微量淋巴细胞毒性方法组成的组，其特征在于：所述单克隆嵌合免疫球蛋白由下列构成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链(H)包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
和在于：
-每一条轻链(L)包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的特异单克隆抗体和特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组。
10.特异于I类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列构成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于：
-每一条重链(H)包含：
ο单克隆抗体的重链可变区(VH)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的重链恒定区(CH)，所述人免疫球蛋白选自由IgA、IgG和IgM组成的组，
和在于：
-每一条轻链(L)包含：
ο单克隆抗体的轻链可变区(VL)，所述单克隆抗体选自由特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体组成的组，和
ο人免疫球蛋白的轻链恒定区(CL)，所述人免疫球蛋白轻链选自由κ链和λ链组成的组。
11.根据权利要求10的特异于I类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白，其特征在于，其选自由下列组成的组：
-包含至少一个序列SEQ ID_NO 1的轻链的单克隆嵌合免疫球蛋白，和
-包含至少一个选自由下列组成的组的重链的单克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQ ID_NO 2的重链、序列SEQ ID_NO 3的重链和序列SEQID_NO 4的重链。
12.特异于II类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白，其由下列构成：
-两条多肽链，分子量在40kDa和60kDa之间的所谓重链(H)，和
-两条多肽链，分子量在20kDa和30kDa之间的所谓轻链(L)；
其特征在于，其选自由下列组成的组：
-包含至少一个序列SEQ ID_NO 5的轻链的单克隆嵌合免疫球蛋白，和
-包含至少一个选自由下列组成的组的重链的单克隆嵌合免疫球蛋白：序列SEQ ID_NO 6的重链、序列SEQ ID_NO 7的重链和序列SEQID_NO 8的重链。
13.根据权利要求10或11之一的特异于I类HLA抗原的单克隆嵌合免疫球蛋白，其特征在于，每一个特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体选自由脊椎动物的单克隆抗体组成的组。
14.根据权利要求10、11或13之一的单克隆嵌合免疫球蛋白，其特征在于，所述特异于I类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体W6/32。
15.根据权利要求12的单克隆嵌合免疫球蛋白，其特征在于，所述特异于II类HLA抗原的单态性表位的单克隆抗体为抗体F3.3。
16.定量液定介质的抗HLA抗体的试剂盒，所述试剂盒包含确定量的至少一种根据权利要求10至15之一的单克隆嵌合免疫球蛋白和用于施行根据权利要求1至8之一的方法的说明书。
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