CN114045321A - 谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 - Google Patents
谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114045321A CN114045321A CN202111601392.3A CN202111601392A CN114045321A CN 114045321 A CN114045321 A CN 114045321A CN 202111601392 A CN202111601392 A CN 202111601392A CN 114045321 A CN114045321 A CN 114045321A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- glutathione
- recombinant human
- human collagen
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 128
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 128
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 38
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 111
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 31
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 31
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 15
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 14
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229910018890 NaMoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052925 anhydrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052927 chalcanthite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。本发明通过在甲醇诱导表达阶段加入谷胱甘肽，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，促进重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。
背景技术
重组类人胶原蛋白能够通过基因工程菌实现大量表达。目前研究较为广泛的宿主菌株主要包括大肠杆菌和毕赤酵母菌。中国专利201110327865.5公开了一种表达重组人源胶原蛋白的巴氏毕赤酵母基因工程菌，保藏编号为CGMCC No.5021。虽然与传统工艺相比，胶原蛋白的基因工程菌发酵工艺具有生产原料易得、环保、产品质量稳定等优点，但也存在着发酵周期较长、生产效率较低等问题。为此，需要进一步提高该菌株的重组人源胶原蛋白表达量。
中国专利201810049618.5公开了一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺，通过添加L-精氨酸或者L-赖氨酸，作为蛋白酶的抑制性底物，保护目标产物重组胶原蛋白，不被蛋白酶水解。该方法虽然能够提高重组人源胶原蛋白稳定性，但重组人源胶原蛋白的产量并没有提升。中国专利2018100489088公开了一种毕赤酵母表达重组胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺，将甲醇诱导阶段时改成分阶段恒速流加，可以保证毕赤酵母在不同代谢时期对碳源的需求，该方法的胶原蛋白产量超过20g/L，产量提高5％以上，重组胶原蛋白的回收率达到75％以上。该方法重组胶原蛋白表达量虽有所提高，但提升幅度不大。综上所述，需要进一步地提高蛋白表达量，进而提高发酵水平，促进重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。本发明通过在发酵过程中加入谷胱甘肽，调节毕赤酵母菌的生长代谢速度，缩短发酵周期，提高重组人源胶原蛋白的表达量，提升重组人源胶原蛋白的生产水平。
本发明的技术方案如下：
谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用，具体应用方法如下：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入谷胱甘肽；所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，保藏编号为CGMCC No.5021。
本发明所述的应用中，谷胱甘肽的加入量为0.1g/L～10g/L，优选为0.1g/L～1g/L。
本发明所述的应用中，谷胱甘肽的加入方式为一次性加入或流加，更优选为流加。
本发明所述的应用中，发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.2～5.4，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
谷胱甘肽在毕赤酵母中被用在如DNA的合成和修复、蛋白质的生物合成和转运、氨基酸的活化等的相关的反应中。在发酵培养过程中，谷胱甘肽帮助毕赤酵母在甲醇中生长。在甲醇诱导阶段，毕赤酵母需要大量的氧气，如果溶氧不足，会产生有害物质，比如甲醛和过氧化氢，会对细胞有毒害作用。谷胱甘肽作为辅助因子，降低这些物质对毕赤酵母的毒害作用，从而促进毕赤酵母表达蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入谷胱甘肽，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，有利于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
具体实施方式
本发明采用的巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisCGMCC No.5021，已在中国专利201110327865.5中充分公开。
下述实施例中，采用的PTM1溶液参照Invitrogen公司的操作手册，具体配方为：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO30.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4 5.0mL/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。
下述实施例中，采用的发酵培养基的具体配方为：85％H3PO4 26.7mL/L；CaSO4·2H2O1.175g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L；PTM14.35mL/L。
下面结合实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为0.01g/L发酵培养基。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为23.5g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.210g/L·h，与对照组相比提高21.3％。
实施例2
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为10g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为24.6g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.220g/L·h，与对照组相比提高27.0％。
实施例3
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为216g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为25.7g/L，发酵周期113小时，发酵生产水平为0.227g/L·h。与对照组相比提高31.5％。
实施例4
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为210g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为17小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为25.3/L，发酵周期113小时，发酵生产水平为0.224g/L·h，与对照组相比提高29.4％。
实施例5
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为213g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加谷胱甘肽溶液至发酵结束，总加入量为0.1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵90h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为26.3g/L，发酵周期108小时，发酵生产水平为0.244g/L·h，与对照组相比提高40.8％。
实施例6
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加谷胱甘肽溶液至发酵结束，总加入量为1g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为26.8g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.239g/L·h，与对照组相比提高38.3％。
实施例7
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为212g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，同时连续流加谷胱甘肽溶液至发酵结束，总加入量为10g/L。调节转速、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵96h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为25.6g/L，发酵周期112小时，发酵生产水平为0.229g/L·h，与对照组相比提高32.1％。
对照组1
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为218g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为16小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵104h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为20.8g/L，发酵周期120小时，发酵生产水平为0.173g/L·h。
对照组2
将种子液按照10％的接种量加到含有500L发酵培养基的1000L发酵罐中，同时一次性加入谷胱甘肽，加入量为1g/L，初始搅拌转速200rpm、罐压0.05MPa，调节空气流量和转速使溶氧(DO)＞30％，发酵过程中控制pH5.2。当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加50％甘油，补充碳源，至菌体湿重为215g/L，停止补加甘油，此时发酵培养时间为18小时。甘油耗尽后开始流加甲醇，进入甲醇诱导培养阶段，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧(DO)＞20％，诱导发酵104h后，结束发酵，收集发酵液，离心获得发酵液上清，经HPLC检测，最终重组人源胶原蛋白浓度为20.6g/L，发酵周期122小时，发酵生产水平仅为0.169g/L·h。
Claims (6)
1.谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用，其特征在于，具体应用方法如下：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵培养14～18小时后，开始补加甲醇进行诱导表达，同时向发酵培养基中加入谷胱甘肽；所述的毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号为CGMCC No.5021。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，谷胱甘肽的加入量为0.1g/L～10g/L。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，谷胱甘肽的加入量为0.1g/L～1g/L。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，谷胱甘肽的加入方式为一次性加入或流加。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，发酵培养基的配方为：85％H3PO46.6～26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.3～1.175g/L，K2SO4 4.5～18.2g/L，MgSO4·7H2O 3.7～14.9g/L，KOH 1.0～4.13g/L，甘油10.0～40.0g/L，PTM1溶液0.435～4.35mL/L。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，氨水调节pH为5.2～5.4，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为90～120小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111601392.3A CN114045321A (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111601392.3A CN114045321A (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114045321A true CN114045321A (zh) | 2022-02-15 |
Family
ID=80213397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111601392.3A Pending CN114045321A (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114045321A (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119322A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-11-16 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN106191181A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 一种毕赤酵母表达重组蛋白的发酵工艺 |
| CN107988291A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-05-04 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺 |
| CN107988292A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-05-04 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺 |
| CN109680025A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-26 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺 |
| CN111733200A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-10-02 | 浙江诸暨聚源生物技术有限公司 | 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN113564062A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-10-29 | 汉肽生物医药集团有限公司 | 一种缩短培养时间和提高胶原蛋白含量的发酵工艺 |
| CN113789358A (zh) * | 2021-08-28 | 2021-12-14 | 西安德诺海思医疗科技有限公司 | 一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
-
2021
- 2021-12-24 CN CN202111601392.3A patent/CN114045321A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119322A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-11-16 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 一种提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN106191181A (zh) * | 2016-07-22 | 2016-12-07 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 一种毕赤酵母表达重组蛋白的发酵工艺 |
| CN107988291A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-05-04 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺 |
| CN107988292A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-05-04 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺 |
| CN109680025A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-26 | 江苏江山聚源生物技术有限公司 | 提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺 |
| CN111733200A (zh) * | 2020-06-30 | 2020-10-02 | 浙江诸暨聚源生物技术有限公司 | 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN113789358A (zh) * | 2021-08-28 | 2021-12-14 | 西安德诺海思医疗科技有限公司 | 一种提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 |
| CN113564062A (zh) * | 2021-09-10 | 2021-10-29 | 汉肽生物医药集团有限公司 | 一种缩短培养时间和提高胶原蛋白含量的发酵工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈思壖等著: "《酵母生物化学》", 济南：山东科学技术出版社, pages: 56 - 57 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102132132B1 (ko) | 재조합 인간 콜라겐 생산 수준을 향상시키는 발효 공법 | |
| CN110607268A (zh) | 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及发酵生产l-缬氨酸方法 | |
| CN112961875B (zh) | 一种生物法生产四氢嘧啶的工程菌株的构建方法 | |
| CN105368766B (zh) | 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法 | |
| US20100297715A1 (en) | Method for producing succinic acid | |
| CN111733200A (zh) | 调节ptm1添加方式提高重组胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
| CN106047913B (zh) | 一种生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法 | |
| CN108456652B (zh) | 一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN113186143A (zh) | 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法 | |
| CN108715827B (zh) | 酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用 | |
| CN105316273B (zh) | 一株无苹果酸副产的l-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN113549633A (zh) | 一种l-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l半胱氨酸中的应用 | |
| CN109680025B (zh) | 提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺 | |
| CN114045321A (zh) | 谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用 | |
| CN106929527B (zh) | 一种高间苯三酚合成能力的基因工程菌及构建方法和应用 | |
| CN107988293B (zh) | 调节压力提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
| JP3661191B2 (ja) | タンパク質の生産方法 | |
| CN108048511B (zh) | 调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺 | |
| CN113249364B (zh) | 一种含谷氨酸脱羧酶全细胞的工业化发酵生产方法 | |
| AU2021102566A4 (en) | Co-production process of pyruvic acid and Levodopa and use thereof | |
| CN104745545A (zh) | 一种高效生产l-谷氨酸氧化酶的方法 | |
| CN110713967B (zh) | 一种转化合成左旋多巴效率提高的大肠杆菌及其应用 | |
| CN113667709A (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法 | |
| EP3521305A1 (en) | Corynebacterium spp. strains having increased rates of growth and/or sugar uptake | |
| CN116334052B (zh) | 一种巴曲酶的发酵培养基及发酵方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |