CN114034793B - 一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法 - Google Patents

一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生湿面制品中ε‑聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，包括如下步骤：1)利用第一溶液对生湿面制品样品进行提取，调节上层清液的pH为2～3，得提取液；其中，第一溶液为焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为95：(5±0.5)的混合溶液，焦磷酸钠溶液的浓度为0.02±0.005mol/L；2)以CAPCELL PAK C18MG S‑5色谱柱分离提取液，并以第二溶液为流动相洗脱，DAD检测器190nm～195nm波长检测，外标法定量；其中，第二溶液为焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为85：(15±0.5)的混合溶液，焦磷酸钠溶液的浓度为0.02±0.005mol/L。上述测定方法，具有较高的灵敏度、准确度和重现性，可用于生湿面制品中的ε‑聚赖氨酸盐酸盐含量的测定，弥补了食品中ε‑聚赖氨酸盐酸盐检测的空白。

Description

一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法
技术领域
本发明涉及一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，属于生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定技术领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸盐酸盐是从淀粉酶产色链霉菌受控发酵培养液经离子交换树脂吸附、解吸、提纯而来。国家卫生和计划生育委员会于2014年发布公告，批准ε-聚赖氨酸盐酸盐作为食品添加剂新品种。GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定，ε-聚赖氨酸盐酸盐允许应用于小麦粉及其制品中，且有明确的限量要求。其中冷面等生湿面制品属于小麦粉及其制品，即冷面等生湿面制品中允许使用ε-聚赖氨酸盐酸盐，但有限量要求。
由于生湿面制品的水分含量高，产品pH值偏碱性，丙酸钙、单辛酸甘油酯等防腐剂虽为其常用的食品添加剂，但在小麦粉及生湿面制品中的抑菌防腐效果并不理想，而ε-聚赖氨酸盐酸盐因其良好的热稳定性，在中性或微酸性环境中有较强的抑菌性，与丙酸盐、单辛酸甘油酯复配使用，可以增强防腐效果，对食品的色、香、味和口感也无不良影响，这就诱使生产企业更加倾向使用ε-聚赖氨酸盐酸盐。但目前为止，除T/ZZB 1625-2020《食品添加剂ε-聚赖氨酸盐酸盐》中明确了液相色谱法检测其纯度外，没有食品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的检验检测手段，无法衡量ε-聚赖氨酸盐酸盐在上述产品中的使用情况。因此本文以冷面、米线为代表，建立一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的检验检测手段，以满足市场监管和研判的需求。
发明内容
本发明提供一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，准确性高，检出限可低至0.015g/kg，满足市场监管和研判的需求，同时填补了食品添加剂ε-聚赖氨酸盐酸盐测定的空白。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，包括如下步骤：
1)利用第一溶液对生湿面制品样品进行提取，调节上层清液的pH为2～3，得提取液；其中，第一溶液为焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为95：(5±0.5)的混合溶液，焦磷酸钠溶液的浓度为0.02±0.005mol/L；
2)以CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱分离提取液，并以第二溶液为流动相洗脱，DAD检测器190nm～195nm波长检测，外标法定量；其中，第二溶液为焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为85：(15±0.5)的混合溶液，焦磷酸钠溶液的浓度为0.02±0.005mol/L。
申请人在研发过程中发现，测试生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量时，生湿面制品会对ε-聚赖氨酸盐酸盐含量的测量造成非常大的干扰，用T/ZZB 1625-2020《食品添加剂ε-聚赖氨酸盐酸盐》标准中规定的方法来检测生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量，无法准确定量，因此，没有参考和使用价值；在测试生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量时，提取剂的选择非常重要，不仅要考虑ε-聚赖氨酸盐酸盐的提取率，同时还要消除生湿面制品中的干扰，当以焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为95：(5±0.5)的混合溶液作为提取剂，并将提取后的上层清液pH调节为2～3，可以有效确保生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐检测的准确性，若不调节pH或改变提取剂，将会导致准确性的显著下降，无法准确测定；色谱柱的选择也同样重要，若选择不当，会导致杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐色谱峰无法分离，进而无法测试ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量，CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱可以使得生湿面制品中的杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐色谱峰完全分离，进而确保检测的准确性；针对生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐测定，还对波长进行了选择，生湿面制品带入的杂质，会影响到生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐测定时的响应波长，针对生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐测定，经反复的优化验证，可在190nm～195nm波长检测，最佳为195nm；此外，流动相的选择也同样重要，有些流动相虽然可以得到良好的ε-聚赖氨酸盐酸盐标准溶液的色谱峰，但当用于生湿面制品样品时，会发生杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐的色谱峰不能分开现象，以焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为85：(15±0.5)的混合溶液为流动相，能使生湿面制品样品的杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐的色谱峰分开，进而确保测量的准确性。
发明人经研究发现，提取剂和流动相中焦磷酸钠溶液的加入，有效增强了提取效果和分离效果，提高了测量的准确性。
上述步骤1)为：将生湿面制品样品置于第一溶液中，涡旋0.5～1min，超声提取15～20min，然后以8000～9000r/min离心3～5min，取上层清液，并调节pH为2～3，得提取液，其中，第一溶液的用量为每克生湿面制品样品4～6ml。这样可使生湿面制品中的ε-聚赖氨酸盐酸盐得到有效的提取，进而更好地确保测量的准确性。
为了提高测量精度，步骤1)中，调节pH后，过0.22μm滤膜，得提取液。
上述步骤1)中，离心后，将上层清液用1mol/L磷酸溶液调pH值至2～3。
上述步骤1)中，第一溶液中的焦磷酸钠溶液的pH为2～3；步骤2)中，第二溶液中的焦磷酸钠溶液的pH为2～3。这样可以更好地确保测量的准确性。
为了提高测量准确率，步骤2)中，柱温为20～30℃；流动相流速0.8-1.0mL/min。
上述步骤2)中，当提取液中ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量为0.01～0.5mg/mL时，ε-聚赖氨酸盐酸盐含量与ε-聚赖氨酸盐酸盐峰面积呈线性关系。
上述步骤2)中，线性回归方程为：y＝48940.1259x-382.12681，相关系数R＝0.9998，其中，y为ε-聚赖氨酸盐酸盐峰面积，x为ε-聚赖氨酸盐酸盐含量。这样更加简化和方便了ε-聚赖氨酸盐酸盐的定量测定，也使得本申请的适用范围更加宽广。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，具有较高的灵敏度、准确度和重现性，可用于生湿面制品中的ε-聚赖氨酸盐酸盐含量的测定，弥补了食品中ε-聚赖氨酸盐酸盐检测的空白；线性关系良好，加标回收率在93.8％～103.4％之间，相对标准偏差在0.7％～4.0％的范围内，方法最低检出限0.015g/kg。
附图说明
图1为ε-聚赖氨酸盐酸盐含量的线性关系；
图2为ε-聚赖氨酸盐酸盐标准溶液色谱图(浓度0.1mg/mL)；
图3为空白冷面和冷面加标色谱图(样液加标浓度0.1mg/mL，图中，上图为空白色谱图，下图为加标色谱图)；
图4为空白米线和米线加标色谱图(样液加标浓度0.1mg/mL，图中，上图为空白色谱图，下图为加标色谱图)；
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
各例中所用设备和试剂如下：
Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD检测器，美国安捷伦公司)；
CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱(4.6mm×250mm，日本资生堂)；
Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0×150mm)；
涡旋混合器(美国talboys)；
KQ-500DE超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；
KH20R-Ⅱ高速冷冻离心机(湖南凯达)；
ε-聚赖氨酸盐酸盐标准物质(纯度95％，源叶生物)；
色谱纯甲醇(Fisher Scientific)；
0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)：称取8.92g焦磷酸钠(Na4P2O710H2O)，加水溶解并定容至1L，用磷酸调节pH至2.5；
缓冲盐溶液：称取1.7g磷酸氢二钾，1.42g硫酸钠，加水溶解并定容至1L，用磷酸调节pH至3.4；
1mol/L磷酸溶液；0.2μm滤膜(Pall Corporation)。
标准储备液配制(10mg/mL)：准确称取100mgε-聚赖氨酸盐酸盐，用0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(95+5)溶解并定容于10mL。95+5表示前后溶液的体积比为95:5，其它类似表达含义类似。
标准使用液配制(1mg/mL)：吸取标准储备液(10mg/mL)1.0mL于10mL容量瓶中，用0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(95+5)稀释并定容。
标准工作溶液系列配制：分别吸取1mg/mL标准使用液10μL、20μL、30μL、50μL、100μL、200μL、500μL于7个样品瓶中，分别用0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(95+5)定容至1.0mL，混匀。配制的标准工作溶液浓度分别为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL，以峰面积为值绘制成标准曲线，从而推算出待测试样中被测组分浓度(外标法定量)。ε-聚赖氨酸盐酸盐标准溶液色谱图见图2。
实施例1
称取均质试样2.00g于50mL离心管中，加入0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(95+5)10mL，涡旋1min，超声提取20min，以9000r/min离心5min(4℃)，取上层清液，用1mol/L磷酸溶液调pH值至2.5，过0.22μm滤膜，得提取液，用于液相分析。
以CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱分离提取液，柱温30℃，进样量20μL，并以0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(85+15)为流动相洗脱，流速0.8mL/min，DAD检测器195nm波长检测，外标法定量。
精密度和加标回收率：
选取市售冷面、米线样品，按四个浓度水平加入ε-聚赖氨酸盐酸盐标准使用溶液，制备成加标样品，按上述方法分别对冷面、米线及其加标样品进行测定，对每个添加水平重复测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差，数据见表1。结果表明，ε-聚赖氨酸盐酸盐的加标回收率在93.8％～103.4％之间，相对标准偏差在0.7％～4.0％的范围内，说明该方法准确、稳定、可靠。
表1精密度及回收率定结果(n＝6)
上表中，本底值指不加ε-聚赖氨酸盐酸盐的空白试验；加入量指样品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的加入量，平均检出量指6次重复试验的平均测量值。
实施例2
以冷面为样品，对提取液中ε-聚赖氨酸盐酸盐不同含量进行测定，ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量为0.01～0.5mg/mL时，呈线性关系，如图1所示，线性回归方程为：y＝48940.1259x-382.12681，相关系数R＝0.9998，其中，y为ε-聚赖氨酸盐酸盐峰面积，x为ε-聚赖氨酸盐酸盐含量。
实施例3
在空白冷面和空白米线中加入ε-聚赖氨酸盐酸盐标液，按实施例1中的方法进行提取和测定后，计算其信噪比，当空白冷面和空白米线加标量为0.015g/kg时，其信噪比均大于3(S/N＝3)，因此确定本方法最低检出限为0.015g/kg。
对比例1
将DAD检测器200nm波长检测，并以冷面为样品，其余参照实施例1，检测结果如表2所示。
表2精密度及回收率定结果(n＝6)
对比例2
分别以焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(95+5)、焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(92+8)、焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(90+10)、缓冲盐溶液(pH3.4)-甲醇溶液(95+5)和缓冲盐溶液(pH3.4)-甲醇溶液(92+8)为流动相，进样分析ε-聚赖氨酸盐酸盐加标量为1g/kg的冷面样品，具体方法参照实施例1。结果表明：前述流动相，样品中的杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐的色谱峰不能分开，而以焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(85+15)为流动相时，能将样品中的杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐的色谱峰分开。
对比例3
以0.02mol/L焦磷酸钠溶液(pH2.5)-甲醇溶液(85+15)为流动相，195nm波长下，分别考察Agilent Poroshell 120EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0×150mm)和CAPCELL PAK C18 MGS-5色谱柱(4.6mm×250mm)对加标样品中的杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐色谱峰的分离效果，其余参照实施例1，结果表明，使用CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱(4.6mm×250mm)，加标样品中的杂质峰与ε-聚赖氨酸盐酸盐色谱峰的分离度要高于使用Agilent Poroshell120EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0×150mm)。CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱(4.6mm×250mm)测试的空白冷面和冷面加标色谱图见图3，空白米线和米线加标色谱图见图4。
对比例4
冷面样品为碱性，若不调节提取液的pH，其余均参照实施例1，低浓度加标冷面(加标量0.05g/kg)回收率较低，中浓度加标冷面(0.1g/kg～0.5g/kg)回收率才达到70％左右。

Claims (8)

1.一种生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）将生湿面制品样品置于第一溶液中，涡旋0.5~1 min，超声提取15~20min，然后以8000~9000 r/min离心3~5 min，取上层清液，并调节pH为2~3，得提取液；其中，第一溶液为焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为95：（5±0.5）的混合溶液，焦磷酸钠溶液的浓度为0.02 ±0.005mol/L；
2）以CAPCELL PAK C18 MG S-5色谱柱分离提取液，并以第二溶液为流动相洗脱，DAD检测器190 nm～195 nm波长检测，外标法定量；其中，第二溶液为焦磷酸钠溶液与甲醇体积比为85：（15±0.5）的混合溶液，焦磷酸钠溶液的浓度为0.02 ±0.005mol/L；柱温为20~30℃；流动相流速0.8~1.0 mL/min。
2.如权利要求1所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤1）中，第一溶液的用量为每克生湿面制品样品4~6ml。
3.如权利要求2所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤1）中，离心后，将上层清液用1 mol/L磷酸溶液调pH值至2~3。
4.如权利要求1-3任意一项所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤1）中，调节pH后，过0.22 µm滤膜，得提取液。
5.如权利要求1-3任意一项所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤1）中，第一溶液中的焦磷酸钠溶液的pH为2~3。
6.如权利要求1-3任意一项所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤2）中，第二溶液中的焦磷酸钠溶液的pH为2~3。
7.如权利要求1-3任意一项所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤2）中，当提取液中ε-聚赖氨酸盐酸盐的含量为0.01～0.5 mg/mL时，ε-聚赖氨酸盐酸盐含量与ε-聚赖氨酸盐酸盐峰面积呈线性关系。
8.如权利要求7所述的生湿面制品中ε-聚赖氨酸盐酸盐的测定方法，其特征在于：步骤2）中，线性回归方程为：y=48940.1259x -382.12681，相关系数R=0.9998，其中，y为ε-聚赖氨酸盐酸盐峰面积，x为ε-聚赖氨酸盐酸盐含量。
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食品添加剂 ε-聚赖氨酸盐酸盐;浙江省品牌建设联合会;团体标准T/ZZB 1625-2020;第1-8页 *

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