CN114031499B - 一种从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法及应用。本发明通过优化复合酶解体系、改进提取手段，提高了甜菊糖苷的提取率，同时提高了滤渣中的异绿原酸的含量，且无需加入絮凝剂等物质，减少了污染的风险，方便了后期进一步提取其他活性物质。利用有机膜的组合方式提取异绿原酸，一次性得到了高纯度脱色的结晶异绿原酸产品，无需以往加工方法中的活性炭过滤/树脂层析/色谱/蒸馏等复杂工艺，减少了加工时间，操作方便，处理量大，非常适于工业加工生产。本发明的技术方案在不影响甜菊糖苷提取的情况下，优化了生产工艺以达到同时高效提取异绿原酸，且所用的有机溶剂少，操作简单，收率高，是一种实用的适用于甜叶菊深加工的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离提取方法，特别涉及一种从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法及应用。
背景技术
天然异绿原酸的来源十分广泛，可通过热回流提取法、大孔树脂吸附法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法等提取得到；而化学合成的异绿原酸副产物较多且分离纯化困难，其合成工艺成本高。其主要是从天然植物中提取异绿原酸，但目前针对异绿原酸的提取工艺研究仍处于初期阶段。
绿原酸类化合物主要来源于金银花、苦丁茶、甜叶菊、艾蒿、兔耳草、丁公藤等天然植物。现代研究表明甜叶菊干叶中绿原酸类物质高达52.69mg/g，其整株均含有绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C。在传统甜叶菊提取物生产工艺中，往往只获取了甜叶菊中的甜菊糖苷，而将甜叶菊中的绿原酸类物质视为杂质，利用物理或化学的方法将它们变为沉淀废渣除去，若不回收这些废渣中的绿原酸类物质，这无疑是一种资源浪费。
近年来，针对不同天然植物来源的绿原酸，研究学者们分别开发了如热回流提取法、大孔树脂吸法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解等提取方法。但相对于绿原酸来说，异绿原酸的提取工艺研究较少。其多是从金银花中有研究。其报道多是采用多级逆流萃取、分馏萃取和色谱洗脱等多种分离手段，其工艺复杂。操作繁琐，关键点不易控制，导致产品收率，含量，品质不稳定。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法。
本发明的另一目的在于提供上述从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，包括以下步骤：
S1.取甜叶菊干燥品粉碎，加水打浆得到甜叶菊水浆，调节pH值后加入酶和维生素C，搅拌均匀，酶解后过滤；将得到的滤液离心，离心得到的沉淀备用；将得到的滤渣压滤；离心和压滤得到的滤液为甜菊糖苷，压滤得到的滤渣备用；
S2.将步骤S1中离心得到的沉淀和压滤得到的滤渣合并后加入溶剂，搅拌后得到提取液；
S3.将步骤S2中得到的提取液进行抽滤，得到过滤液；
S4.将步骤S3中得到的抽滤液过有机膜纯化，得到脱色截留膜液。
S5.将步骤S4中得到的脱色截留膜液浓缩，再加入有机溶剂结晶，待结晶后抽滤，将得到的晶体洗涤、干燥，即得高纯度异绿原酸晶体。
步骤S1中所述的加水的量为甜叶菊干燥品质量的3～5倍。
步骤S1中所述的粉碎的程度优选为粉碎到粒径是100～200目。
步骤S1中所述的调节pH为使用1wt％的柠檬酸溶液调节甜叶菊水浆的pH值到4.0。
步骤S1中所述的酶为植物纤维素酶和植物复合破壁酶中的至少一种；优选为植物纤维素酶和植物复合破壁酶组合得到；更优选为植物纤维素酶和植物复合破壁酶按体积比1：1配比组合得到。
步骤S1中所述的酶的添加量优选按甜叶菊干燥品：酶＝1kg：4～6mL配比计算；更优选甜叶菊干燥品：酶＝1kg：5mL配比计算。
步骤S1中所述的维生素C的添加量为甜叶菊水浆质量的0.2～0.4‰。
步骤S1中所述的酶解的条件为33～37℃下水浴酶解1～1.5h；更优选为35℃下水浴酶解1～1.5h。
步骤S1中所述的过滤为使用200～300目的滤布过滤。
步骤S1中所述的离心为先经1470r/min蝶式低速离心30分钟后，再经14000r/min管式高速离心1.5小时。
步骤S1中所述的压滤的压力为1～3MPa。
步骤S2中所述的溶剂为乙酸、正己烷和正庚烷中的至少一种；优选为乙酸、正己烷和正庚烷中的两种以上组成的混合溶剂；更优选为乙酸、正己烷和正庚烷按体积比1～3:1～2:1～4组成的混合溶剂。
步骤S2中所述的溶剂的加入量为合并后滤渣质量的5～8倍。
步骤S2中所述的搅拌的条件为4～9℃下搅拌1～3h。
步骤S2中所述的搅拌的次数为至少一次；优选为至少两次。
步骤S3中所述的抽滤为垫滤纸抽滤，滤纸孔径为80～120微米。
步骤S3中所述的抽滤的次数为至少一次；优选为至少两次。
步骤S4中所述的有机膜为有机溶剂纳滤膜。
步骤S4中所述的纯化为过两级有机膜纯化，第一级有机膜的截留分子量为650～850，第二级有机膜的截留分子量为200～350，取第二次滤液为脱色截留膜液。
上述的纯化中第一次进膜压力为290～870psi，第二次进膜压力为500～850psi。
步骤S5中所述的浓缩为浓缩到15～20波美度。
步骤S5中所述的有机溶剂的加入量为脱色截留膜液体积的3～4倍。
步骤S5中所述的有机溶剂为石油醚、甲醇和乙醇中的至少一种；优选为石油醚、甲醇和乙醇混合得到的有机溶剂；更优选为石油醚、甲醇和乙醇按体积比1～2:1～3:1～2配比混合得到的有机溶剂。
步骤S5中所述的结晶的条件为-4～10℃结晶4h以上。
步骤S5中所述的抽滤为垫滤纸抽滤，滤纸孔径为80～120微米。
步骤S5中所述的洗涤为用4～8℃的纯水洗涤。
步骤S5中所述的高纯度异绿原酸晶体的异绿原酸含量为大于80％。
上述从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法在制备异绿原酸中的应用本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明通过优化复合生物酶酶解体系、改进提取手段，提高了甜菊糖苷的提取率，同时也提高了滤渣中的异绿原酸的含量，且无需加入絮凝剂等物质，减少了污染的风险，方便了后期进一步提取其他活性物质。
2、利用有机膜的组合方式提取异绿原酸，一次性得到了高纯度脱色的结晶异绿原酸产品，无需以往加工方法中的活性炭过滤/树脂层析/色谱/蒸馏等复杂工艺，减少了加工时间，操作方便，处理量大，非常适于工业加工生产。
3、本发明的技术方案在不影响甜菊糖苷提取的情况下，优化了生产工艺以达到同时高效提取异绿原酸，且所用的有机溶剂少，安全环保，操作简单，收率高，是一种实用的适用于甜叶菊深加工的新方法。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
(1)取甜叶菊干燥品200g(原料总含量4％)，粉碎到150目，加3倍量的纯水打浆得到甜叶菊水浆。用1wt％的柠檬酸溶液调节pH到4.0，先加入植物纤维素酶(诺维信生物科技有限公司，500U/mL)0.5ml和植物复合破壁酶(又叫植物提取专用酶，购自南宁东恒华道生物科技有限公司)0.5ml生物酶后，加入质量为甜叶菊水浆的0.2‰的维生素C，搅拌均匀，35℃水浴酶解1h(h＝小时)，酶解完后使用200目的滤布过滤，将得到的滤液利用台式离心机分级离心，先经1470r/min蝶式低速离心30分钟后，再经14000r/min管式高速离心1.5小时，离心得到的沉淀备用。将过滤得到的滤渣在1MPa的压力下压干滤液，离心和压滤得到的滤液为甜菊糖苷(总苷)，压滤得到的滤渣备用。
(2)将步骤(1)中离心得到的沉淀和压滤得到的滤渣合并加入5倍质量的乙酸，低温搅拌提取，温度为4℃，搅拌提取时间为1小时，提取两次合并得到提取液。
(3)将得到的提取液垫滤纸抽滤两次，滤纸孔径为80微米，合并收集两次过滤液，待用。
(4)将抽滤液过两级OSN(有机溶剂纳滤)有机膜纯化，先过截留分子量为650的有机膜(进膜压力290psi)，全过完后再过截留分子量为200的有机膜(进膜压力500psi)，取第二次滤液得脱色截留膜液。
(5)将脱色截留膜液浓缩到15波美度，加入3倍体积的有机溶剂(AR级别石油醚，甲醇和乙醇混合比例体积比为1:1:1)，在低温(-4℃)结晶4小时以上，待结晶后垫滤纸抽滤，滤纸孔径为80微米，得到晶体，用10倍量纯冰水(4℃)洗，干燥，得到高纯度异绿原酸产品，呈白色晶体状，HPLC测定异绿原酸含量为83.5％，以原料计总异绿原酸回收率为95.5％。
实施例2
(1)取甜叶菊干燥品200g(原料总含量4％)，粉碎到150目，加4倍量的纯水打浆得到甜叶菊水浆。用1wt％的柠檬酸溶液调节pH到4.0，先加入植物纤维素酶(诺维信生物科技有限公司，500U/mL)0.5ml和植物复合破壁酶(又叫植物提取专用酶，购自南宁东恒华道生物科技有限公司)0.5ml生物酶后，加入质量为甜叶菊水浆的0.2‰的维生素C，搅拌均匀，35℃水浴酶解1h(h＝小时)，酶解完后使用250目的滤布过滤，将得到的滤液利用台式离心机分级离心，先经1470r/min蝶式低速离心30分钟后，再经14000r/min管式高速离心1.5小时，离心得到的沉淀备用。将过滤得到的滤渣在2MPa的压力下压干滤液，离心和压滤得到的滤液为甜菊糖苷(总苷)，压滤得到的滤渣备用。
(2)将步骤(1)中离心得到的沉淀和压滤得到的滤渣合并加入6倍质量的混合有机溶剂(乙酸，正己烷和正庚烷，混合比例为按体积比1:1:1)，低温搅拌提取，温度为7℃，搅拌提取时间为2小时，提取两次合并得到提取液。
(3)将得到的提取液垫滤纸抽滤两次，滤纸孔径为100微米，合并收集两次过滤液，待用。
(4)将抽滤液过两级OSN(有机溶剂纳滤)有机膜纯化，先过截留分子量为750的有机膜(进膜压力590psi)，全过完后再过截留分子量为270的有机膜(进膜压力700psi)，取第二次滤液得脱色截留膜液。
(5)将脱色截留膜液浓缩到17波美度，加入3.5倍体积的有机溶剂(AR级别石油醚，甲醇和乙醇混合比例体积比为1:1:1)，在低温(5℃)结晶4小时以上，待结晶后垫滤纸抽滤，滤纸孔径为100微米，得到晶体，用10倍量纯冰水(6℃)洗，干燥，得到高纯度异绿原酸产品，呈白色晶体状，HPLC测定异绿原酸含量为81.5％，以原料计总异绿原酸回收率为96.1％。
实施例3
(1)取甜叶菊干燥品200g(原料总含量4％)，粉碎到150目，加5倍量的纯水打浆得到甜叶菊水浆。用1wt％的柠檬酸溶液调节pH到4.0，先加入植物纤维素酶(诺维信生物科技有限公司，500U/mL)0.5ml和植物复合破壁酶(又叫植物提取专用酶，购自南宁东恒华道生物科技有限公司)0.5ml生物酶后，加入质量为甜叶菊水浆的0.4‰的维生素C，搅拌均匀，35℃水浴酶解1.5h(h＝小时)，酶解完后使用300目的滤布过滤过滤，将得到的滤液利用台式离心机分级离心，先经1470r/min蝶式低速离心30分钟后，再经14000r/min管式高速离心1.5小时，离心得到的沉淀备用。将过滤得到的滤渣在3MPa的压力下压干滤液，离心和压滤得到的滤液为甜菊糖苷(总苷)，压滤得到的滤渣备用；
(2)将步骤(1)中离心得到的沉淀和压滤得到的滤渣合并加入8倍质量的混合有机溶剂(乙酸，正己烷和正庚烷，混合比例为按体积比3:2:4)，低温搅拌提取，温度为9℃，搅拌提取时间为3小时，提取两次合并得到提取液。
(3)将提取液垫滤纸抽滤两次，滤纸孔径为120微米，合并收集两次过滤液，待用。
(4)将抽滤液过两级OSN(有机溶剂纳滤)有机膜纯化，先过截留分子量为850的有机膜(进膜压力870psi)，全过完后再过截留分子量为350的有机膜(进膜压力850psi)，取第二次滤液得脱色截留膜液。
(5)将脱色截留膜液浓缩到20波美度，加入4倍体积的有机溶剂(AR级别石油醚，甲醇和乙醇混合比例体积比为2:3:2)，在低温(10℃)结晶4小时以上，待结晶后垫滤纸抽滤，滤纸孔径为120微米，得到晶体，用10倍量纯冰水(8℃)洗，干燥，得到高纯度异绿原酸产品，呈白色晶体状，HPLC测定异绿原酸含量为82.5％，以原料计总异绿原酸回收率为96.2％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取甜叶菊干燥品粉碎，加水打浆得到甜叶菊水浆，调节pH值后加入酶和维生素C，搅拌均匀，酶解后过滤；将得到的滤液离心，离心得到的沉淀备用；将得到的滤渣压滤；离心和压滤得到的滤液为甜菊糖苷，压滤得到的滤渣备用；
S2.在步骤S1中离心得到的沉淀和压滤得到的滤渣合并加入溶剂，搅拌提取后得到提取液；
S3.将步骤S2中得到的提取液进行抽滤，得到过滤液；
S4.将步骤S3中得到的抽滤液过有机膜纯化，得到脱色截留膜液；
S5.将步骤S4中得到的脱色截留膜液浓缩，再加入有机溶剂结晶，待结晶后抽滤，将得到的晶体洗涤、干燥，即得高纯度异绿原酸晶体；
步骤S1中所述的调节pH为使用1wt％的柠檬酸溶液调节甜叶菊水浆的pH值到4.0；
步骤S1中所述的酶为植物纤维素酶和植物复合破壁酶；
步骤S4中所述的有机膜为有机溶剂纳滤膜；
步骤S4中所述的纯化为过两级有机膜纯化，第一级有机膜截留分子量为650～850，第二级有机膜截留分子量为200～350，取第二次滤液为脱色截留膜液。
2.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的加水的量为甜叶菊干燥品质量的3～5倍；
步骤S1中所述的粉碎的程度为粉碎到粒径100～200目。
3.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的酶的添加量按甜叶菊干燥品：酶＝1kg：4～6mL配比计算；
步骤S1中所述的维生素C的添加量为甜叶菊水浆质量的0.2～0.4‰；
步骤S1中所述的酶解的条件为33～37℃下水浴酶解1～1.5h。
4.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的过滤为使用200～300目的滤布过滤；
步骤S1中所述的离心为先经1470r/min蝶式低速离心30分钟后，再经14000r/min管式高速离心1.5小时；
步骤S1中所述的压滤的压力为1～3MPa。
5.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S2中所述的溶剂为乙酸、正己烷和正庚烷中的至少一种；
步骤S2中所述的溶剂的加入量为合并后滤渣的质量的5～8倍；
步骤S2中所述的搅拌的条件为4～9℃下搅拌1～3h；
步骤S2中所述的搅拌的次数为至少一次。
6.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S3中所述的抽滤为垫滤纸抽滤，滤纸孔径为80～120微米；
步骤S3中所述的抽滤的次数为至少一次。
7.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
所述的纯化中第一次进膜压力为290～870psi，第二次进膜压力为500～850psi。
8.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S5中所述的浓缩为浓缩到15～20波美度；
步骤S5中所述的有机溶剂的加入量为脱色截留膜液体积的3～4倍；
步骤S5中所述的有机溶剂为石油醚、甲醇和乙醇中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法，其特征在于：
步骤S5中所述的结晶的条件为-4～10℃结晶4h以上；
步骤S5中所述的抽滤为垫滤纸抽滤，滤纸孔径为80～120微米；
步骤S5中所述的洗涤为用4～8℃的纯水洗涤；
步骤S5中所述的高纯度异绿原酸晶体的异绿原酸含量为大于80％。
10.权利要求1～9任一项所述从甜叶菊中获取高纯度异绿原酸的方法在制备异绿原酸中的应用。
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