CN114031067A - 一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点及其制备方法，包括以下步骤：将碳材料和硝酸溶液进行混合，得到混合物溶液，其中，该混合物溶液的浓度为10‑20mg mL‑1，硝酸的浓度为15M、10M或5M；将混合物溶液在100‑200℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到澄清液体；将澄清溶液依次中和、除杂、浓缩、冻干，得到具有超氧化物歧化酶活性碳点；本发明提出的制备方法具有合成绿色、步骤简便、尺寸小、生物相容性好、分散性稳定等特点；在氧化损伤保护、抗老化、抗炎治疗等实际应用中具有广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米酶、模拟酶、无机催化纳米材料研究领域，具体涉及一种具有超氧化物歧化酶活性碳点及其制备方法。
背景技术
天然酶作为一类极为重要的生物催化剂，因其催化效率高、底物特异性强、反应条件温和、立体选择性好等特点被广泛应用于制药、化工、食品加工和农业等领域。然而，由于天然酶制备和纯化成本高、操作稳定性差、催化活性对环境条件敏感以及回收和再利用困难等缺点，极大地阻碍了其广泛应用。为了克服上述问题，科研工作者们长期致力于模拟酶的研究。自2007年首次报道Fe3O4纳米颗粒具有过氧化物酶模拟活性以来，多种具有模拟酶活性的纳米材料被广泛开发研究，如贵金属(金、银、钯、铂等)、属氧化物(氧化铁、氧化铜、氧化铈等)和碳纳米材料等。与天然酶相比，纳米酶具有成本低、稳定性高和耐用性强等优点，已被广泛应用于生物传感、抗菌、细胞保护、疾病诊断与治疗等生物医学应用中。
然而，目前所报道的贵金属和金属氧化物类纳米酶，由于其稳定性不足、合成复杂、批量生产困难，花费高等缺点，难以运用到实际应用中。与其相比，以碳结构为主体的碳基纳米酶具有良好的生物相容性，加之其明确的电子和几何结构而被广泛应用于模拟酶领域。其中，碳点作为近年来新兴的一种零维碳纳米材料，因其粒径小、比表面积大、导电性优异，可以作为电子供体和电子受体，是一类理想的可用于均相催化的碳催化剂，在生化分析、疾病诊断与治疗等生物医学应用方面具有广阔的应用前景。但是，目前的制备方法获得的碳点纳米酶，主要用于模拟天然的过氧化物酶(POD)活性，其应用受到极大限制，尤其是在细胞保护、抗老化、疾病诊疗等生物医学应用方面。所以，亟需开发新的制备方法、合成具有其他模拟酶活性的碳点纳米酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点及其制备方法，解决了现有技术中存在的上述不足。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，包括以下步骤：
将碳材料和硝酸溶液进行混合，得到混合物溶液，其中，该混合物溶液的浓度为10-20mg mL-1，硝酸的浓度为15M、10M或5M；
将混合物溶液在100-200℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到澄清液体；
将澄清溶液依次中和、除杂、浓缩、冻干，得到具有超氧化物歧化酶活性碳点。
优选地，所述碳材料包括碳纤维粉、焦炭、炭黑或石墨粉。
优选地，将澄清溶液进行中和的具体工艺是：
利用NaOH进行中和，直至澄清溶液的pH值呈中性。
优选地，进行除杂的具体工艺是：
将中和后的混合溶液依次进行透析、过滤、超滤，得到C-dots溶液。
优选地，透析的工艺是：利用分子截留量为3500Dalton的透析袋进行透析，收集得到的液体。
优选地，过滤的具体工艺是：
利用0.22μm滤膜进行过滤，得到过滤后的液体。
优选地，进行超滤的具体工艺是：
将所得到的滤液依次使用分子截留量为100kDa、50kDa、30kDa、10kDa和3kDa的超滤管进行超滤，得到分子截留量小于3kDa的C-dots溶液。
一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点，所述具有超氧化物歧化酶活性的碳点基于所述的方法制备所得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点及其制备方法，为解决背景技术中提到的技术问题，以大量、便宜、易获得的碳材料为原料制备了一批尺寸小、生物相容性好、分散性稳定的C-dots，该制备方法简便，绿色，可大批量成产；相比于已报道的制备方法获得的具有过氧化物酶活性(POD-like)的C-dots，此制备方法获得的C-dots展现出与以往不同的催化性能，其具有超氧化物歧化酶活性(SOD-like)和羟基自由基清除特性。
同时，该方法适用于将多种碳材料进行氧化，且均可获得具有SOD-like的C-dots，可进行量产；此外，该制备方法可进行批量筛选具有较高SOD-like活性的C-dots，为C-dot纳米酶在氧化损伤保护、抗老化、抗炎治疗等领域提供应用价值。
附图说明
图1为实施例2所得产品的超氧化物歧化酶活性；
图2为实施例3所得产品的超氧化物歧化酶活性；
图3为实施例4中不同产品的TEM及HRTEM图片；
图4为实施例4中不同产品的超氧化物歧化酶活性；
图5为实施例4中不同产品的羟基自由基清除特性；
图6为实施例4中不同产品的总的抗氧化能力。
图7为实施例4中不同产品的胞内ROS和O2 ·-清除能力。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进一步详细说明。
本发明的目的在于提出一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点及其制备方法，利用其具有的SOD-like活性，提高了纳米酶在氧化损伤保护、抗老化、抗炎治疗等领域中的应用价值。
本发明提供的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，包括以下步骤：
C-dots的制备：称取适量碳材料于三口烧瓶中，超声分散于硝酸(15M,10M,5M)溶液中，得到混合物溶液，其中，该混合液的浓度为10-20mg mL-1；经该混合液于100-200℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到棕色澄清液体，之后停止反应，自然冷却至室温，收集得到C-dots混合溶液；由于上述获得C-dots混合溶液处于酸性环境，为了后续进一步处理，用NaOH进行中和至pH值呈中性；之后为去除中和后混合溶液中的盐分，以及反应过程中生成的副产物，将上述混合溶液转移到分子截留量为3500Dalton的透析袋中透析一周；收集上述透析袋中液体，使用0.22μm滤膜进行过滤，去除杂质；为了进一步纯化，将所得到的滤液依次使用分子截留量为100kDa、50kDa、30kDa、10kDa、3kDa的超滤管超滤，分离之后，得到分子截留量小于3kDa的C-dots溶液；最后，收集上述得到的滤液，使用旋转蒸发仪进行浓缩、真空冷冻干燥机进行冻干，得到C-dots样品。
其中，所述碳材料为碳纤维粉、焦炭、炭黑或石墨粉。
C-dots的超氧化物歧化酶活性：采用超氧化物歧化酶检测试剂盒(碧云天，S0101M)和ESR检测C-dots的超氧化物歧化酶活性。
C-dots的羟基自由基清除特性：对苯二甲酸(TA)可以捕获·OH生成高荧光的2-羟基对苯二甲酸，激发波长为320nm，发射峰在425nm。通过425nm的特征峰的变化，验证C-dots的羟基自由基清除特性。此外也可借助ESR检测羟基自由基的清除。
C-dots的总抗氧化能力：采用总抗氧化能力检测试剂盒(碧云天，S0119)检测C-dots的总抗氧化能力水平。
C-dots的胞内ROS和O2 ·-清除能力：利用ROS和O2 ·-特异性的荧光探针，DCFH-DA和DHE，在细胞水平评估C-dots的ROS和O2 ·-特清除能力。
本发明的创新性及显著特点
(1)本发明提供的制备方法适用于多种碳材料的氧化，且均可获得的具有超氧化物歧化酶活性的C-dots，具有很强的普适性。
(2)本发明提供的制备方法，可用于批量筛选具有较高超氧化物歧化酶活性的C-dots的原材料，为纳米酶在氧化损伤保护、抗老化、抗炎治疗等领域提供应用价值。
(3)本发明提出的制备方法具有合成绿色、步骤简便、尺寸小、生物相容性好、分散性稳定等特点，有利于提高催化剂和底物的结合，达到少量即可得到较好的催化效果。
实施例1
C-dots的制备：称取适量焦炭于三口烧瓶中，超声分散于15M硝酸(15M,10M,5M)溶液中，得到混合物溶液，其中，该混合液的浓度为10mg mL-1；经该混合液于110℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到澄清液体，之后停止反应，自然冷却至室温，收集得到C-dots混合溶液；由于上述获得C-dots混合溶液处于酸性环境，为了后续进一步处理，用NaOH进行中和；之后为去除中和后混合溶液中的盐分，以及反应过程中生成的副产物，将上述混合溶液转移到分子截留量为3500Dalton的透析袋中透析一周；收集上述透析袋中液体，使用0.22μm滤膜进行过滤，去除杂质；为了进一步纯化，将所得到的滤液依次使用分子截留量为100kDa、50kDa、30kDa、10kDa、3kDa的超滤管超滤，分离之后，得到分子截留量小于3kDa的C-dots溶液；最后，收集上述得到的滤液，使用旋转蒸发仪进行浓缩、真空冷冻干燥机进行冻干，得到C-dots样品。
实施例2
C-dots的制备：称取适量碳材料(碳纤维粉、炭黑和石墨粉等)于三口烧瓶中，超声分散于15M硝酸溶液中，得到混合物溶液，其中，该混合液的浓度为16.7mg mL-1；经该混合液分别于100、110、130或200℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到澄清液体，之后停止反应，自然冷却至室温，收集得到C-dots混合溶液；由于上述获得C-dots混合溶液处于酸性环境，为了后续进一步处理，用NaOH进行中和；之后为去除中和后混合溶液中的盐分，以及反应过程中生成的副产物，将上述混合溶液转移到分子截留量为3500Dalton的透析袋中透析一周；收集上述透析袋中液体，使用0.22μm滤膜进行过滤，去除杂质；为了进一步纯化，将所得到的滤液依次使用分子截留量为100kDa、50kDa、30kDa、10kDa、3kDa的超滤管超滤，分离之后，得到分子截留量小于3kDa的C-dots溶液；最后，收集上述得到的滤液，使用旋转蒸发仪进行浓缩、真空冷冻干燥机进行冻干，得到C-dots样品。
图1.实施例2中的C-dots的SOD-like活性检测。结果表明，以各种碳材料(碳纤维粉、焦炭、炭黑和石墨粉等)作为碳源，采用15M硝酸蚀刻的方法，均可获得具有SOD-like活性的C-dots，且C-dots的SOD-like活性强弱依赖于其碳源的种类和氧化时间。所用超氧化物歧化酶检测试剂盒为碧云天S0101M；所用样品的终浓度为50ug mL-1。
实施例3
C-dots的制备：称取适量焦炭于三口烧瓶中，分别超声分散于15M、10M或5M硝酸溶液中，得到混合物溶液，其中，该混合液的浓度分别为16.7mg mL-1；经该混合液分别于110、160或200℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到澄清液体，之后停止反应，自然冷却至室温，收集得到C-dots混合溶液；由于上述获得C-dots混合溶液处于酸性环境，为了后续进一步处理，用NaOH进行中和；之后为去除中和后混合溶液中的盐分，以及反应过程中生成的副产物，将上述混合溶液转移到分子截留量为3500Dalton的透析袋中透析一周；收集上述透析袋中液体，使用0.22μm滤膜进行过滤，去除杂质；为了进一步纯化，将所得到的滤液依次使用分子截留量为100kDa、50kDa、30kDa、10kDa、3kDa的超滤管超滤，分离之后，得到分子截留量小于3kDa的C-dots溶液；最后，收集上述得到的滤液，使用旋转蒸发仪进行浓缩、真空冷冻干燥机进行冻干，得到C-dots样品。
图2.实施例3中的C-dots的SOD-like活性检测。结果表明，不同浓度硝酸蚀刻碳材料，对其SOD-like活性影响较小，且存在和上述一样的氧化时间依赖的SOD-like活性。所用超氧化物歧化酶检测试剂盒为碧云天S0101M；所用样品的终浓度为50ug mL-1。
图3.实施例3中的C-dots的TEM和HR-TEM。表明C-dots粒径大小约为1.3nm，并且通过测量其晶格大小，发现存在C-dots(100)，d＝0.21nm，和已报道的结果一致，表明C-dots的成功制备。
图4.实施例3中的C-dots的SOD-like活性检测。A图：表明C-dots存在浓度依赖的SOD-like活性，其酶活性达到4000-5000U/mg，是本发明提出的制备方法，以各种碳材料作为碳源，获得的具有最高酶活力的C-dots。所用超氧化物歧化酶检测试剂盒为DojindoS311-10；所用样品的终浓度为0-100ug mL-1。B图：利用ESR通过捕获DMPO/·OOH加合物的信号间接判断C-dots的SOD-like活性。详细地，L-met和核黄素在LED照射下反应生成超氧化物(O2 ·-)，DMPO可以捕获O2 ·-形成DMPO/·OOH加合物。所有的样品在含有13mM L-met、20μM核黄素和25mM DMPO的PBS缓冲溶液(25mM，pH 7.4)中，经历5分钟光照后进行的。ESR结果表明，C-dots对O2 ·-存在浓度依赖的清除效果，表明C-dots具有优秀的SOD-like活性。所用样品的终浓度为0-50ug mL-1
图5.实施例3中的C-dots的羟基自由基(·OH)清除特性检测。A图：利用ESR通过捕获DMPO/·OH加合物的信号间接判断C-dots的羟基自由基清除特性。·OH是利用芬顿反应体系产生。具体地，所有样品在1mM Fe2+和4mM H2O2在PBS缓冲溶液(25mM，pH7.4)中37℃孵育15分钟，之后利用DMPO捕获·OH形成DMPO/·OH加合物。ESR结果表明，C-dots对·OH存在浓度依赖的清除效果，表明C-dots具有浓度依赖的·OH清除特性。B图：TA是一种非荧光化合物可与·OH反应生成荧光芳香羟基化产物(2-羟基对苯二甲酸)，其激发和发射峰分别为320和425nm。详细地，所用样品在含有0.5mM TA和10mM H2O2的25mM PBS缓冲液(pH 7.4)经过紫外线照射15min，之后利用荧光光谱仪进行分析。结果表明具有浓度依赖的·OH清除特性。
图6.实施例3中的C-dots的总的抗氧化能力检测。总抗氧化能力检测试剂盒(碧云天，S0119)，是一种采用ABTS作为显色剂，对各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。通过添加不同浓度C-dots溶液，动态检测A734的吸收，并利用Trolox作为抗氧化剂制作标准曲线，计算得到C-dots的总抗氧化能力达到8-10mmol/g。
图7.实施例3中的C-dots的胞内ROS和O2 ·-清除检测。A图：DCFH是一种ROS特异性的荧光探针，当Rosup诱导后，出现很强的绿色荧光，而细胞预先用100μg/mL C-dots处理8h后，其绿色荧光明显降低，表明C-dots良好的ROS清除能力，而空白组和用C-dots处理组，未出现绿色荧光，表明C-dots具有良好的生物安全性。B图：DHE是一种O2 ·-特异性的荧光探针，当进行上述相同处理后，也表明良好的O2 ·-清除能力。
Claims (8)
1.一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将碳材料和硝酸溶液进行混合，得到混合物溶液，其中，该混合物溶液的浓度为10-20mg mL-1，硝酸的浓度为15M、10M或5M；
将混合物溶液在100-200℃下进行搅拌、煮沸回流至碳材料完全蚀刻，得到澄清液体；
将澄清溶液依次中和、除杂、浓缩、冻干，得到具有超氧化物歧化酶活性碳点。
2.根据权利要求1所述的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，所述碳材料包括碳纤维粉、焦炭、炭黑或石墨粉。
3.根据权利要求1所述的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，将澄清溶液进行中和的具体工艺是：
利用NaOH进行中和，直至澄清溶液的pH值呈中性。
4.根据权利要求1所述的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，进行除杂的具体工艺是：
将中和后的混合溶液依次进行透析、过滤、超滤，得到C-dots溶液。
5.根据权利要求4所述的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，透析的工艺是：利用分子截留量为3500Dalton的透析袋进行透析，收集得到的液体。
6.根据权利要求4所述的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，过滤的具体工艺是：
利用0.22μm滤膜进行过滤，得到过滤后的液体。
7.根据权利要求4所述的一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点的制备方法，其特征在于，进行超滤的具体工艺是：
将所得到的滤液依次使用分子截留量为100kDa、50kDa、30kDa、10kDa和3kDa的超滤管进行超滤，得到分子截留量小于3kDa的C-dots溶液。
8.一种具有超氧化物歧化酶活性的碳点，其特征在于，所述具有超氧化物歧化酶活性碳点基于权利要求1-7中任一项所述的方法制备所得。
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