CN114015672B

CN114015672B - 一种Pfu DNA聚合酶

Info

Publication number: CN114015672B
Application number: CN202111511759.2A
Authority: CN
Inventors: 朱升龙; 王振; 张靖伟; 叶贤龙; 陈永泉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114015672A

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种Pfu DNA聚合酶，其氨基酸序列如Seq ID No.1所示，经透析过的蛋白浓度为1.2mg/mL；编码该Pfu DNA聚合酶的基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示，将携带有该基因的表达载体转入宿主菌中构建获得表达菌株，经诱导表达获得所述Pfu DNA聚合酶。该Pfu DNA聚合酶可以无错配地扩增出6000bp以内的DNA片段，除了具有高保真性外还具有快速的延伸速度42bp/s和较高的变性温度100℃；37℃保存一周仍能保持较为完整的蛋白结构和优异的扩增效果，较野生型未修饰酶稳定性显著提高。因此，本发明Pfu DNA聚合酶在PCR反应中可以节省更多的时间，稳定性更强，增加了纯化后的回收效率。

Description

一种Pfu DNA聚合酶

技术领域

本发明涉及一种Pfu DNA聚合酶，属于生物工程技术领域。

背景技术

PCR操作是分子生物学中最基本和最常见的技术。PCR反应是由DNA聚合酶催化完成，根据实验目的选择合适的聚合酶是进行PCR实验前需要考虑的问题。许多DNA聚合酶的主要区别在于特异性、保真性、扩增速率和扩增片段长度等几个指标。

目前最常用的DNA聚合酶为Taq酶，它的扩增效率高，但没有纠正功能。Pfu酶具有出色的热稳定性，具有5’-3’DNA聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，3’-5’外切酶活性的主要功能是校正作用，当加入的核苷酸与模板核苷酸不互补时，则被3’-5’外切酶切除，以重新在这个位置上聚合对应的核苷酸，从而有效降低碱基错误掺入率，提高扩增结果的真实性，因而Pfu DNA聚合酶具有校正作用，但Pfu酶的一个缺点是扩增速率不如普通Taq酶。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种Pfu DNA聚合酶，解决了现有Pfu DNA聚合酶延伸速度慢和稳定性弱的问题，另外本发明新型Pfu DNA酶在C端增加了8个His标签，极大地方便了后续的纯化步骤。

本发明第一目的是提供一种Pfu DNA聚合酶，所述Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

本发明第二目的是提供编码所述Pfu DNA聚合酶的基因。

进一步地，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明第三目的是提供携带所述基因的表达载体。

本发明第四目的是提供携带所述表达载体的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌。

优选地，所述大肠杆菌为Ecoli BL21、Rosetta-gami、OrigamiB或Rosetta系列的感受态细胞。

本发明第五目的是提供一种反应缓冲液，其特征在于，适用于所述PfuDNA聚合酶进行DNA扩增反应，所述反应缓冲液由以下组分构成：20-50mM Tris-HCl、5-10mM(NH4)2SO4、2-4mM MgSO4、10-20mM KCl、5-10mg/mL BSA和0.5-1％TritonX-100。

优选地，所述反应缓冲液由以下组分构成：30-50mM Tris-HCl、5-10mM(NH4)2SO4、2-3mM MgSO4、10-15mM KCl、5-8mg/mL BSA和0.5-1％TritonX-100。

进一步地，所述Pfu DNA聚合酶的构建方法，包含以下步骤：

(1)将质粒载体进行EcoRI和NotI双酶切，在37℃金属浴3-4h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段。将目的片段编码Pfu DNA聚合酶的基因片段(序列如Seq ID NO.1所示)和载体片段进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒转入宿主菌体内，获得表达菌株；

(2)在1L液体摇瓶中装入200mL LB培养基，加入50-100μg/mL的卡那霉素，并接种过夜摇动的菌株10-20μL，37℃摇动菌液至OD₆₀₀＝0.4-0.6，加入摩尔浓度为0.1-0.25mM的IPTG，在16℃过夜诱导蛋白表达；

(3)12000g离心10min收集菌体，用20mL PBS重悬，添加质量百分比浓度为400-800μg/mL的溶菌酶，4℃裂解30min。用超声波细胞破碎仪破碎菌体，菌液至于冰上，破碎功率300W，破碎2s停2s，如此间隔操作，破碎3min，4℃12000g离心10min，收集上清。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

(1)本发明Pfu DNA聚合酶因C端带有8个His标签，在纯化中多His标签使得蛋白更加容易结合在Ni柱上，增加了纯化后的回收率；

(2)本发明Pfu DNA聚合酶可以无错配地扩增出6000bp以内的DNA片段，自身除了具有高保真性外还具有快速的延伸速度，野生型Pfu DNA聚合酶延伸速度为10bp/s，而本发明中的Pfu DNA聚合酶的延伸速度达到42bp/s，因此在PCR反应中可以节省较多的时间；

(3)本发明Pfu DNA聚合酶较野生型未修饰酶稳定性具有显著的提高，37℃保存一周还能保持较为完整的蛋白结构，依旧可以扩增出6000bp以内的DNA片段，扩增速度和保真度不变；

(4)本发明Pfu DNA聚合酶还具有更高的变性温度，普通野生型Pfu DNA聚合酶60℃以上基本失活，而本发明Pfu DNA聚合酶活性无明显变化，变性温度甚至可达到100℃，有效促进了模板双链DNA转变为单链DNA，进一步增强了PCR扩增效率；

(5)本发明经优化的反应缓冲液，为本发明Pfu DNA聚合酶提供了一个最适反应环境，使得酶促反应效率大大提升。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：

图1是本发明Pfu DNA聚合酶的蛋白电泳图。

图2是本发明Pfu DNA聚合酶的扩增产物核酸电泳图。

图3是本发明Pfu DNA聚合酶扩增产物的测序比对结果图。

图4是本发明Pfu DNA聚合酶的稳定分析图。

图5是本发明Pfu DNA聚合酶在37℃保存一周后的扩增产物核酸电泳图。

图6是本发明Pfu DNA聚合酶在37℃保存一周后的测序比对结果图。

说明书附图标记说明：Pfu DNA聚合酶稳定性的HPLC分析图中，1为本发明Pfu DNA聚合酶﹣80℃保存1周的峰图，2为本发明Pfu DNA聚合酶37℃保存1周后峰图，3为野生型未修饰Pfu DNA聚合酶37℃保存1周后峰图；凝胶电泳图中，泳道1为野生型未修饰Pfu DNA聚合酶37℃保存1周后蛋白降解情况，泳道2为本发明Pfu DNA聚合酶37℃保存1周后蛋白降解情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明采用的均为常规试验方法，材料和试剂均为市售产品。

将pET-30(a)+质粒进行EcoRI和NotI双酶切得到质粒大片段，在37℃金属浴3-4h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，最后使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，获得载体片段；

将编码Pfu DNA聚合酶的基因片段和载体片段进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒转入Ecoli BL21(DE3)中，获得表达菌株；

在1L液体摇瓶中装入200mL LB培养基，加入100μg/mL的卡那霉素，并接种过夜摇动的菌株10μL，37℃摇动菌液至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.25mM IPTG，在16℃过夜诱导蛋白表达；

12000g离心10min收集菌体，用20mL PBS重悬，加入溶菌酶使最终浓度为400μg/mL，4℃裂解30min。用超声波细胞破碎仪破碎菌体，菌液置于冰上，破碎功率300W，每间隔2s破碎2s，持续3min，4℃12000g离心10min，收集上清。

采用AKTA pure蛋白纯化***进行蛋白纯化：待上清样品全部进样后，用50倍柱体积的binding buffer(20mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，pH＝7.4)，冲洗柱子；后用50倍柱体积的wash buffer(binding buffer+20mM咪唑)，将没有结合在柱子上的蛋白冲洗掉；最后用Elution buffer(20mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，500mM咪唑)冲洗柱子，待仪器检测出峰后，收集流出组分15mL，透析至保存液(20mM Tris-HCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，0.1M KCl，0.1％吐温20，20％甘油)。蛋白电泳图如图1所示。

Pfu DNA聚合酶的浓度测定

Pfu DNA聚合酶浓度采用BCA法进行测定，以牛血清白蛋白(BSA)为对照组。

经数据分析可知，本发明Pfu DNA聚合酶经透析过的蛋白浓度为1.2mg/mL。

Pfu DNA聚合酶的扩增效果

以pLenti CRISPR v2载体为DNA模板，并用市售Pfu DNA聚合酶为对照组，进行PCR扩增。

扩增反应体系如表1所示，扩增反应条件如表2所示，扩增结果如图2和图3所示。

表1 PCR扩增反应体系

其中，10x Pfu酶缓冲液由以下组分构成：200mM Tris-HCl(pH＝8.8，25℃)、100mM(NH₄)₂SO₄、20mM MgSO₄、100mM KCl、5mg/mL BSA和1％TritonX-100。

表2 PCR反应条件

结果分析

由图1可以看出，本发明制备的Pfu DNA聚合酶因C端带有8个His标签，在纯化中多His标签使得蛋白更加容易结合在Ni柱上，增加了纯化后的回收率。

图2本发明Pfu DNA聚合酶的扩增产物核酸电泳图表明，本发明新型Pfu DNA聚合酶可扩增出0.4-6kb的DNA片段，且具有快速的延伸速度，野生型Pfu DNA聚合酶延伸速度为10bp/s，而本发明中的Pfu DNA聚合酶的延伸速度达到42bp/s，因此在PCR反应中可以节省较多的时间。

图3本发明Pfu DNA聚合酶扩增产物的测序比对结果显示，随机挑选DNA片段进行测序，经过与模板序列比对，本发明新型Pfu DNA聚合酶可以无错配地扩增出2000-6000bp的DNA片段。

图4本发明Pfu DNA聚合酶稳定性的HPLC分析图结果表明：本发明新型Pfu DNA聚合酶较野生型未修饰酶稳定性具有显著的提高，37℃保存一周还能保持较为完整的蛋白结构。

图5和图6结果表明，本发明制备的Pfu DNA聚合酶在37℃存放一周后，仍可以扩增出0.4-6kb的DNA片段，且扩增速度和保真度不变。

经测定发现本发明Pfu DNA聚合酶还具有更高的变性温度。普通野生型Pfu DNA聚合酶在60℃以上基本失活，而本发明Pfu DNA聚合酶活性无明显变化，且变性温度甚至可达到100℃，有效促进了模板双链DNA转为单链DNA，进一步增强了PCR扩增效率。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于，上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种Pfu DNA聚合酶

<130> 2021.12.06

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 773

<212> PRT

<213> （人工合成）

<400> 1

Met Ile Leu Asp Val Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Lys Phe Lys Ile Glu His Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile

35 40 45

Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Gly Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg

50 55 60

Ile Val Asp Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Lys Pro Ile

65 70 75 80

Thr Val Trp Lys Leu Tyr Leu Glu His Pro Gln Asp Gln Pro Thr Ile

85 90 95

Arg Glu Lys Val Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro

115 120 125

Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr

130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile

165 170 175

Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys

180 185 190

Arg Phe Leu Arg Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Val Thr

195 200 205

Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu

210 215 220

Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys

225 230 235 240

Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile

245 250 255

His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Thr Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

260 265 270

Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu

275 280 285

Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Ser Gly Glu Asn

290 295 300

Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ile Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

Ile Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu

340 345 350

Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Val Ala

355 360 365

Pro Asn Lys Pro Ser Glu Glu Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Glu Ser

370 375 380

Tyr Thr Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Asp Asp

385 390 395 400

Ile Val Tyr Leu Asp Phe Ile Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr

405 410 415

His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Leu Glu Gly Cys Lys Asn Tyr

420 425 430

Asp Ile Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Ile Pro Gly

435 440 445

Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile

450 455 460

Lys Thr Lys Met Lys Glu Thr Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Leu Leu

465 470 475 480

Asp Tyr Arg Gln Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly

485 490 495

Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu

500 505 510

Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Ile Glu Leu Val Trp Lys Glu

515 520 525

Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly

530 535 540

Leu His Ala Thr Ile Pro Gly Gly Glu Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys

545 550 555 560

Ala Leu Glu Phe Val Lys Tyr Ile Asn Ser Lys Leu Pro Gly Leu Leu

565 570 575

Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys

580 585 590

Lys Arg Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly

595 600 605

Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln

610 615 620

Ala Arg Val Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala

625 630 635 640

Val Arg Ile Val Lys Glu Val Ile Gln Lys Leu Ala Asn Tyr Glu Ile

645 650 655

Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His

660 665 670

Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Lys Leu Ala

675 680 685

Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val

690 695 700

Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu

705 710 715 720

Tyr Asp Pro Lys Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn

725 730 735

Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg

740 745 750

Lys Glu Gly Ser Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro His His His

755 760 765

His His His His His

770

<210> 2

<211> 2322

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 2

atgatactag acgtagatta tattacagaa gagggcaagc cggtcattcg cctgttcaaa 60

aaagagaacg gcaaattcaa aattgaacat gatcgtacct ttcgtccgta tatttacgcc 120

ctgttgcgtg acgacagcaa aattgaagag gtgaaaaaga tcactggtga acgtcatggt 180

aagatcgtgc gtatcgttga tgtggaaaag gttgagaaga agttcctggg taagccgatc 240

accgtttgga aactgtacct ggagcacccg caggatcagc cgactatccg tgagaaggtt 300

cgtgagcatc cggcagttgt tgatatcttt gaatacgaca ttccgtttgc gaaacgttat 360

ctgatcgaca aaggcctgat accgatggaa ggcgaagagg aacttaaaat actggcgttt 420

gcaattgcta ccctatacca cgaaggcgag gagttcggta agggtccgat catcatgatt 480

agctacgcgg atgagaacga agcaaaggtg atcacttgga aaaacattga cctgccgtat 540

gttgaagtcg tgagcagcga gcgtgaaatg attaagcgct ttctgcgtat tatccgtgag 600

aaggaccctg atatcattgt aacctataac ggtgactctt ttgattttcc gtatctggcg 660

aagcgagctg agaagctggg tattaagttg accattggcc gcgacggttc ggaaccgaaa 720

atgcagcgta ttggtgacat gaccgcggtt gaagttaaag gtcgcattca tttcgatctg 780

taccacgtga tcactcgcac catcaacctg ccaacgtaca ccctggaagc ggtgtacgaa 840

gcgatcttcg gtaagccgaa ggagaaggtg tatgcggatg aaatcgccaa ggcatgggaa 900

tctggtgaaa acctggagcg cgtggcgaag tacagcatgg aagatgcgaa agctacctat 960

gaattaggca aggaatttct cccgatggag atccaactga gccgtctgat tggccaaccg 1020

ctgtgggacg ttagcagaag ctccaccggt aatttggttg aatggtttct gctgcggaag 1080

gcgtatgaac gcaacgaagt agctccgaat aaaccgtccg aggaagagta ccagcgtcgt 1140

ctgagagaaa gctataccgg cggtttcgtg aaggagccgg aaaaagggct gtgggatgac 1200

attgtttact tagacttcat cgcgttatac ccgagcatta ttatcacgca taatgtttcc 1260

ccggataccc tgaatttgga gggctgcaag aactatgaca tcgctccgca agtgggtcac 1320

aaattctgca aagatattcc gggttttatc ccgagcctgc tgggccatct gttggaggag 1380

cgtcaaaaaa tcaagaccaa aatgaaagaa acccaggatc cgatcgagaa gattttgctg 1440

gattatcgtc aaaaagctat caagctcttg gcgaactctt tttatggcta ttacggctat 1500

gcaaaggcgc gttggtactg caaagaatgt gcagaatcag ttacggcttg gggtcgtaaa 1560

tacatcgagt tggtgtggaa agagctggag gagaagttcg gtttcaaagt tctgtacatc 1620

gacaccgatg gtctccacgc aaccattccg ggtggtgaat cggaagagat caagaagaag 1680

gcgttggagt tcgttaagta catcaactcc aaactgcctg gcctgctgga gcttgagtac 1740

gaaggcttct ataaacgtgg tttcttcgtg accaaaaagc gctacgcggt gatcgacgaa 1800

gaaggcaaag tgattacccg tggtttggag atagtgcgcc gtgattggtc tgagatcgct 1860

aaagaaacgc aagcgcgtgt tttggagacg atcctaaaac acggcgacgt cgaggaggcc 1920

gtgcgcatcg tcaaagaggt catccagaaa ctggccaatt atgagatccc accggaaaag 1980

ctcgcgatct acgagcagat tacgcgtccg ctgcacgagt acaaagcgat tggccctcat 2040

gtcgctgtgg ccaagaaact ggcggctaag ggtgttaaaa ttaaaccggg tatggttatc 2100

ggctatattg tgttgcgcgg tgacggccca atcagcaatc gtgcgatcct ggcagaggag 2160

tacgacccga aaaagcacaa atacgacgca gaatactaca ttgagaacca ggtactgccg 2220

gcagtgctgc gtattttgga gggattcggc taccgcaagg aaggctctag cctggaggtt 2280

ttatttcagg gtccgcatca ccatcaccac caccaccact aa 2322

Claims

1.一种Pfu DNA聚合酶，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶的氨基酸序列如Seq ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述Pfu DNA聚合酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如Seq ID No .2所示。

4.携带权利要求2或3所述基因的表达载体。

5.携带权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述大肠杆菌为Ecoli BL21、Rosetta-gami、OrigamiB或Rosetta系列的感受态细胞。