CN114011376B - 一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用 - Google Patents

一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用，该纳米材料为Fe3O4@mSiO2@TiO2，通过溶胶‑凝胶法在磁性四氧化三铁纳米粒表面引入合适孔径的介孔二氧化硅层，再将二氧化钛层包覆在磁性介孔纳米材料表面，实现了在同一体系中蛋白质的酶解和磷酸化肽的富集全过程，并结合质谱，建立了非标记磷酸化蛋白质组定量分析方法，能够用于复杂样品中磷酸化蛋白的定量。本发明的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料具有大表面积、低检测限和高特异性捕获磷酸化肽特点，可与非标记定量法相结合，对磷酸化蛋白质进行定量研究，显示了其在磷酸蛋白质组研究中具有巨大潜力。

Description

一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料及制备方法与应用
技术领域
本发明属于磷酸化肽分离富集定量方法，尤其涉及一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料与制法以及结合质谱的磷酸化蛋白质组定量的方法。
背景技术
蛋白质磷酸化涉及多个生物学过程，包括了信号传导、细胞分化及基因表达的调控等。磷酸化蛋白质组学通过生物质谱技术实现了对磷酸化蛋白质的定性和定量研究，故在对磷酸化蛋白进行可靠鉴定的同时还要对其进行量化。但磷酸化蛋白质的低化学计量比、低电离效率使直接采用质谱研究磷酸化蛋白质组面临巨大挑战。基于质谱的定量蛋白质组学技术包括基于标记的方法和非标记的方法。其中，非标记定量因无需昂贵的标记试剂、可适用的样本类型多、可应用的样本量大而具有良好的应用前景。但在磷酸化蛋白质组的研究中，受磷酸化肽段富集步骤多等因素影响，易引入操作误差。
因此，需要开发一种能整合蛋白质酶解和磷酸化肽富集的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料，并在此基础上建立具有应用价值的磷酸化蛋白质组非标记定量分析方法。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种同时实现蛋白质酶解和磷酸化肽富集的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料；本发明的第二目的在于提供上述的纳米材料的制备方法；本发明的第三目的在于提供上述纳米材料在磷酸化蛋白质组非标记定量分析中的应用。
技术方案：本发明的一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料，该纳米材料为Fe3O4@mSiO2@TiO2，具有球形结构；其中，球形结构的核心为用于提供磁性的四氧化三铁，四氧化三铁的外层包裹用于蛋白质酶解的介孔二氧化硅层，介孔二氧化硅层外部包覆用于磷酸化肽富集的二氧化钛层。
本发明还保护一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）、将三氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠充分溶解于乙二醇中100~170℃下搅拌，将形成的黑色反应液转移至高压反应釜，并将反应釜置于置于100~200℃烘箱反应8~16小时，冷却至室温，磁滞分离收集产物，用无水乙醇、去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；
步骤（2）、将步骤（1）所得的产物超声均匀分散于无水乙醇中，加入去离子水、氨水，超声混匀得分散液，再加入正硅酸四乙酯，搅拌5~20小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇、去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；
步骤（3）、将步骤（2）所得的产物、十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺超声均匀分散在去离子水中，50~100℃搅拌1~5小时，加入正硅酸四乙酯和异丙醇的环己烷混合液，搅拌5~20小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，然后50~100℃下在硝酸乙醇溶液中回流，再次磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；
步骤（4）、将步骤（3）所得的产物在溶剂中，超声分散均匀，加入二氧化钛前驱体，20~80℃搅拌反应 5~10小时，磁滞分离收集产物，用去离子水和乙醇洗涤然后真空干燥；即得纳米材料。
进一步的，所述步骤（1）中，三氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠的质量比为：(2~4)：(3~10)：(1~1.5)。
进一步的，所述步骤（2）中，步骤（1）所得产物和无水乙醇的质量体积比为1：1000；正硅酸乙酯与分散液的体积比为1：(300-400)。
进一步的，所述步骤（3）中，步骤（2）所得的产物、十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺的质量比为1：30：(1~2)；环己烷混合液中包含5wt% 的正硅酸四乙酯和2.5wt%的异丙醇；产物在硝酸乙醇溶液中回流次数为3~5次。
进一步的，所述步骤（4）中，步骤（3）所得的产物与二氧化钛前驱体的质量比为(10~20)：1；其中，二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯、硫酸钛或四氯化钛中的一种或几种的混合；在加入二氧化钛前驱体前，还加入氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。
本发明还保护所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料在非标记磷酸化蛋白质组定量分析中的应用，定量分析的具体步骤为：
步骤一、将金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料置于溶剂中配制成分散液；
步骤二、在分散液中加入蛋白质溶液，混合，再加入胰蛋白酶，37℃孵育；最后加入三氟乙酸和乙腈，室温振荡孵育；
步骤三、将步骤二所得溶液通过外加磁场分离出纳米材料，用缓冲液洗涤，除去非磷酸化肽段，再加入氨水37℃下振荡洗脱，取洗脱液点靶，自然干燥进行质谱分析。
进一步的，所述步骤一中，分散液的浓度10~30 mg/mL；溶剂采用25 mM的碳酸氢钠溶液。
进一步的，所述步骤二中，胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1：50~1：200；37℃孵育时间为1~16小时；室温振荡孵育时间为10~30分钟。
进一步的，步骤三中，缓冲液包含15 mM的碳酸氢铵，20-50wt%的乙腈和0.5-5wt%的三氟乙酸。
本发明合成的一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料，以磁性微球为基质，以钛氧键和有序介孔为主要官能团。该纳米颗粒具有高效的亲和力、适当的多孔结构和优异的磁性能力。表面的介孔结构不仅提供了高比表面积，还充当了临时酶反应器，有效加速了胰蛋白酶的消化。二氧化钛因其两性特性和良好的物理化学稳定性可以用于磷酸化肽的富集。整体材料表现出对磷酸化肽富集的高选择性、优异的灵敏度和良好的可重复使用率。
本发明的制备原理：将磁性四氧化三铁纳米粒表面，通过溶胶-凝胶法引入合适孔径的介孔二氧化硅层，再将二氧化钛层包覆在磁性介孔纳米材料表面，实现了在同一体系中蛋白质的酶解和磷酸化肽的富集全过程，并结合质谱，建立了非标记磷酸化蛋白质组定量分析方法，能够用于复杂样品中磷酸化蛋白的定量。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：本发明制备的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料具有大表面积、低检测限和高特异性捕获磷酸化肽特点；本发明制备的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料所具有的合适介孔结构，能够将酶解消化时间降低到1小时；本发明的磷酸化蛋白质组定量的方法，能够在同一体系里进行胰蛋白酶消化和磷酸肽富集过程，消除了由于磷酸化蛋白质组前处理多步骤引入的操作误差，可与非标记定量法相结合，对磷酸化蛋白质进行定量研究，显示了其在磷酸蛋白质组研究中具有巨大潜力。
附图说明
图1为实施例1所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料透射电镜和扫描电镜照片；
图2为实施例1所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料红外光谱图；
图3为实施例1所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料磁滞回曲线；
图4为实施例1所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的氮气-吸附脱吸附曲线；
图5为实施例4所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料对牛血清白蛋白酶解速度的影响；
图6为实施例5的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料对标准β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽分离富集的质谱图；
图7为实施例5的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料对标准磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解液和牛血清白蛋白蛋白酪蛋白混合液的分离富集质谱图；
图8为实施例6的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料富集β-酪蛋白混合酶解产物中磷酸化肽重复性的质谱图；
图9为实施例7的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料对一系列β-酪蛋白浓度和牛血清白蛋白的混合物中β-酪蛋白浓度与β-酪蛋白的磷酸肽 (m/z 2061.77)的线性回归曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备
（1）取4.05g FeCl3·6H2O，11.56g NH4Ac，1.12g Na3C6H5O7·2H2O溶解于210 mL乙二醇，170℃油浴磁力搅拌1小时，将加热形成的黑色反应液转移至100 mL高压反应釜，并将反应釜置于 200℃烘箱反应16小时，反应完成后自然冷却至室温，取出反应釜，磁滞分离收集产物，并用无水乙醇和去离子水交替洗涤，60℃真空干燥，得到Fe3O4。
（2）将步骤（1）所得的Fe3O4 0.10 g，100 mL无水乙醇超声 30 分钟混匀，加入25mL去离子水，氨水3.125 mL，超声15分钟，加入400 μL正硅酸四乙酯，搅拌12小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇与去离子水洗涤，60℃真空干燥。
（3）将步骤（2）所得的产物0.10g、3.0g十六烷基三甲基氯化铵，0.10g 三乙醇胺超声1小时以均匀分散在60 mL去离子水中，60℃，200 rpm搅拌1小时，加入20 mL含有 5wt%正硅酸四乙酯和 2.5wt%异丙醇的环己烷混合液，搅拌12小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，85℃，在硝酸/乙醇溶液中回流4次，再次磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，60℃真空干燥12小时。
（4）将步骤（3）所得的产物0.15 g，200 mL无水乙醇，超声30小时，加入 0.75 mL氨水溶液，超声15分钟，加入1.50 g 钛酸四丁酯，45℃搅拌6小时，磁滞分离收集产物，用去离子水和乙醇洗涤，60℃真空干燥12小时，得到Fe3O4@mSiO2@TiO2。
参见图1，（a）为本实施例制备材料的扫描电镜照片；（b）为本实施例制备材料的透射电镜照片，由图可知，整体形貌呈球形，粒径约在500 nm左右，且显示出清晰额有序介孔硅壳层和最外层的TiO2包覆层，说明了本实施例制备材料具有介孔结构和核壳结构。
参见图2，红外测试结果说明，本实施例制备的材料中，800 cm-1处Si-O-Si对称伸缩振动减弱，500-700 cm-1处出现Ti-O特征吸收峰，与未改性的四氧化三铁相比，说明通过溶胶-凝胶法方式可以制备含有TiO2官能团的材料。
参见图3，由图可知， Fe3O4@nSiO2@mSiO2@TiO2的磁饱和强度为20 emu/g，说明本实施例制备材料具备超顺磁性；
参见图4，由图可知，氮气吸脱附曲线中的吸附支进行计算，得到材料BET比表面积为264 m²/g，孔径为6.38 nm，具有大的比表面积和介孔结构。
实施例2
（1）取2.67g FeCl3·6H2O，6.94g NH4Ac，1.12g Na3C6H5O7·2H2O溶解于210 mL乙二醇，100℃油浴磁力搅拌1小时，将加热形成的黑色反应液转移至100 mL高压反应釜，并将反应釜置于 100℃烘箱反应12小时，反应完成后自然冷却至室温，取出反应釜，磁滞分离收集产物，并用无水乙醇和去离子水交替洗涤，100℃真空干燥，得到Fe3O4。
（2）将步骤（1）所得的Fe3O4 0.10 g，100 mL无水乙醇超声 30 分钟混匀，加入25mL去离子水，氨水3.125 mL，超声15分钟，加入320 μL正硅酸四乙酯，搅拌12小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇与去离子水洗涤，100℃真空干燥。
（3）将步骤（2）所得的产物0.10g、3.0g十六烷基三甲基氯化铵，0.20g三乙醇胺超声1小时以均匀分散在60 mL去离子水中，100℃，200 rpm搅拌5小时，加入20 mL含有 5wt%正硅酸四乙酯和 2.5wt%异丙醇的环己烷混合液，搅拌12小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，60℃，在硝酸/乙醇溶液中回流3次，再次磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，80℃真空干燥12小时。
（4）将步骤（3）所得的产物0.15 g，200 mL无水乙醇，超声30小时，加入 0.75 mL的0.1wt%氢氧化钠溶液，超声15分钟，加入0.30g钛酸四异丙酯，45℃搅拌6小时，磁滞分离收集产物，用去离子水和乙醇洗涤，60℃真空干燥12小时，得到Fe3O4@mSiO2@TiO2。
实施例3
（1）取5.34g FeCl3·6H2O，23.12g NH4Ac，1.68g Na3C6H5O7·2H2O溶解于210 mL乙二醇，150℃油浴磁力搅拌1小时，将加热形成的黑色反应液转移至100 mL高压反应釜，并将反应釜置于 150℃烘箱反应12小时，反应完成后自然冷却至室温，取出反应釜，磁滞分离收集产物，并用无水乙醇和去离子水交替洗涤，100℃真空干燥，得到Fe3O4。
（2）将步骤（1）所得的Fe3O4 0.10 g，100 mL无水乙醇超声 30 分钟混匀，加入25mL去离子水，氨水3.125 mL，超声15分钟，加入427 μL正硅酸四乙酯，搅拌12小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇与去离子水洗涤，80℃真空干燥。
（3）将步骤（2）所得的产物0.10 g、3.0 g十六烷基三甲基氯化铵，0.10g三乙醇胺超声1小时以均匀分散在60 mL去离子水中，80℃，200 rpm搅拌5小时，加入20 mL含有 5wt%正硅酸四乙酯和 2.5wt%异丙醇的环己烷混合液，搅拌12小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，80℃，在硝酸/乙醇溶液中回流5次，再次磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，100℃真空干燥12小时。
（4）将步骤（3）所得的产物0.15 g，200 mL无水乙醇，超声30小时，加入 0.75 mL的0.3 mol/L碳酸钠溶液，超声15分钟，加入2.0g硫酸钛，45℃搅拌6小时，磁滞分离收集产物，用去离子水和乙醇洗涤，60℃真空干燥12小时，得到Fe3O4@mSiO2@TiO2。
实施例4
将实施例1所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料用于牛血清白蛋白酶解。
（1）试样制备：称取 1 mg标准蛋白于 EP管中，加入适量体积的 25 mM 碳酸氢钠溶液使蛋白浓度为 1 mg/mL，100℃煮沸10分钟，冷却至室温后加入 1 mol/L的二硫苏糖醇使终浓度为 10 mM，56℃下震荡孵育30分钟。取出 EP管冷却至室温，加入 500 mM的碘乙酰胺，使碘乙酰胺终浓度为 30 mM，室温避光孵育 50 分钟。
（2）牛血清白蛋白标准蛋白溶液（1.5×10-7 M）为酶解对象，酶与蛋白质量比1:2000，蛋白与材料质量比1:50，酶解体系200 μL，37 ℃孵育不同的时间，分别为10分钟，1小时，2小时和16小时。
（3）取1μL步骤（2）中溶液点靶，自然干燥进行质谱分析。统计检测到的牛血清白蛋白中的酶解肽段数目，如图5所示，由图可知，所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的介孔尺寸为6.38 nm时，牛血清白蛋白在10分钟、1小时、2小时和16小时时，检测到的酶解肽段分别为6、8、10和14，与无孔径及孔径为12.51和1.82 nm的材料相比检测到更多的肽段数，说明本实施例制备材料的介孔结构能够加速酶解的速度。
实施例5
将实施例1所得金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料用于磷酸化蛋白β-酪蛋白酶解产物、牛血清白蛋白和β-酪蛋白酶解产物的混合物中磷酸化肽的分离富。
（1）试样的制备：称取 1 mg β-酪蛋白、牛血清白蛋白和β-酪蛋白混合物于 EP管中，加入适量体积的 25 mM 碳酸氢钠溶液使蛋白浓度为 1 mg/mL，100℃煮沸 10分钟，冷却至室温后加入 1 M的二硫苏糖醇使终浓度为 10 mM，56℃下震荡孵育30分钟。取出 EP管冷却至室温，加入 500 mM的碘乙酰胺使碘乙酰胺终浓度为 30 mM，室温避光孵育 50 分钟。吸取β-酪蛋白蛋白、牛血清白蛋白和β-酪蛋白混合物，加入胰蛋白酶液。37℃进行酶解16小时，三氟醋酸终止酶解。
（2）加入上样缓冲液，缓冲液包含15mM的碳酸氢铵，20~50wt%的乙腈和0.5~5wt%的三氟乙酸，震荡孵育 30分钟。磁滞分离。加入 200 μL清洗缓冲液清洗3次，除去非磷酸化肽段。加入 10 μL 10% NH3·H2O洗脱液，震荡孵育 15分钟，收集洗脱产物。
（3）取1μL步骤（2）中洗脱溶液点靶，自然干燥进行质谱分析。
质谱如图6所示，其中（a）表示未经富集的β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的质谱图，（b）是实施例1制备材料富集的β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的质谱图。由图6可以看出，在用金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料进行富集前，检测到为非磷酸化肽。而在金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料富集后，磷酸化肽段被识别。
参见图7，其中（a）为未经富集的β-酪蛋白酶解液和牛血清白蛋白质量比为1:2000的质谱图，（b）为β-酪蛋白酶解液和牛血清白蛋白质量比为1:2000富集后的质谱图，图7显示了当β-酪蛋白酶解液和牛血清白蛋白质量比为1:2000时，富集前仅检测到非磷酸化肽，富集后可以明显检测到β-酪蛋白中的磷酸化肽。
实施例6
将实施例1所得的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料重复使用5次富集β-酪蛋白混合酶解产物中磷酸化肽。
（1）试样的制备：称取 1 mg β-酪蛋白、牛血清白蛋白和β-酪蛋白混合物于 EP管中，加入适量体积的 25 mM 碳酸氢钠溶液使蛋白浓度为 1 mg/mL，100℃煮沸 10分钟，冷却至室温后加入 1 M的二硫苏糖醇使终浓度为 10 mM，56 ℃下震荡孵育30分钟。取出 EP管冷却至室温，加入 500 mM的碘乙酰胺使 碘乙酰胺终浓度为 30 mM，室温避光孵育 50分钟。吸取β-酪蛋白、牛血清白蛋白和β-酪蛋白混合物，加入胰蛋白酶液。37℃进行酶解16小时，三氟醋酸终止酶解。
（2）加入上样缓冲液，震荡孵育 30分钟。磁滞分离。加入 200 μL清洗缓冲液清洗3次，除去非磷酸化肽段。加入 10 μL 10% 氨水洗脱液，震荡孵育 15分钟，收集洗脱产物。
（3）取1μL步骤（2）中洗脱溶液点靶，自然干燥进行质谱分析，质谱如图8所示。
（4）用洗脱缓冲液、上样缓冲液清洗富集材料3次，再生的富集材料重复步骤（2）和（3），共5次。
（5）取1μL步骤（3）和（4）中洗脱溶液点靶，自然干燥进行质谱分析。
质谱如图8所示，其中（a）为第一次富集后磷酸化肽的质谱图，（b）为第五次富集后磷酸化肽的质谱图，由图8看出，对比金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料富集第1次和第5次富集到的β-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽谱图，在富集材料重复使用5次后，仍能对β-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽进行有效富集。
实施例7
将实施例1所得的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料对一系列β-酪蛋白浓度和牛血清白蛋白的混合物中，根据磷酸化肽 (m/z 2061.77)的强度进行β-酪蛋白的相对定量。
（1）试样的制备：吸取适量标准蛋白β-酪蛋白储备液与终浓度为10 mmol/L 牛血清白蛋白，用25 mM 碳酸氢钠溶液稀释成不同浓度（10 fmol/μL、50 fmol/μL、100 fmol/μL、250 fmol/μl、500 fmol/μl、1000 fmol/μl）溶液，涡旋混合均匀。分别取 200 μL不同浓度 β-酪蛋白溶液，按材料与蛋白质量比 50:1分别同时加入材料储备液。加入胰蛋白酶液。37℃进行酶解，三氟醋酸终止酶解，加入乙腈，震荡孵育30分钟。磁滞分离。加入 200 μL清洗缓冲液清洗 3次，除去非磷酸化肽段。加入 10μL10% NH3·H2O洗脱液，震荡孵育15分钟，收集洗脱产物。每组样品重复运行 3次。
（2）取1μL步骤（1）中洗脱溶液点靶，自然干燥进行质谱分析。
（3）记录特征磷酸肽峰强度，以峰强度为纵坐标（Y），β-酪蛋白浓度为横坐标（X），进行线性回归分析。
由图9看出，β-酪蛋白的特征肽段峰强度（Y）与β-酪蛋白浓度（X）成线性相关性，回归方程：Y=5.77X+168.87，线性相关性系数：R=0.9987，RSD值均小于15.94%，说明可以根据磷酸化肽的强度进行β-酪蛋白的相对定量。

Claims (9)

1.一种金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）、将三氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠充分溶解于乙二醇中100~170℃下搅拌，将形成的黑色反应液转移至高压反应釜，并将反应釜置于100~200℃烘箱反应8~16小时，冷却至室温，磁滞分离收集产物，用无水乙醇、去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；
步骤（2）、将步骤（1）所得的产物超声均匀分散于无水乙醇中，加入去离子水、氨水，超声混匀得分散液，再加入正硅酸四乙酯，搅拌5~20小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇、去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；
步骤（3）、将步骤（2）所得的产物、十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺超声均匀分散在去离子水中，50~100℃搅拌1~5小时，加入正硅酸四乙酯和异丙醇的环己烷混合液，搅拌5~20小时，磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，然后50~100℃下在硝酸乙醇溶液中回流，再次磁滞分离收集产物，用无水乙醇和去离子水洗涤，然后在50~100℃下真空干燥；
步骤（4）、将步骤（3）所得的产物在溶剂中，超声分散均匀，加入二氧化钛前驱体，20~80℃搅拌反应 5~10小时，磁滞分离收集产物，用去离子水和乙醇洗涤然后真空干燥；即得纳米材料，该纳米材料为Fe3O4@mSiO2@TiO2，具有球形结构；其中，球形结构的核心为用于提供磁性的四氧化三铁，四氧化三铁的外层包裹用于蛋白质酶解的介孔二氧化硅层，介孔二氧化硅层外部包覆用于磷酸化肽富集的二氧化钛层。
2.根据权利要求1所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，三氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠的质量比为：(2~4)：(3~10)：(1~1.5)。
3.根据权利要求1所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，步骤（1）所得产物和无水乙醇的质量体积比为1：1000；正硅酸乙酯与分散液的体积比为1：(300~400)。
4.根据权利要求1所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，步骤（2）所得的产物、十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺的质量比为1：30：(1~2)；环己烷混合液中包含5wt% 的正硅酸四乙酯和2.5wt%的异丙醇；产物在硝酸乙醇溶液中回流次数为3~5次。
5.根据权利要求1所述的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中，步骤（3）所得的产物与二氧化钛前驱体的质量比为(10~20)：1；其中，二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯、硫酸钛或四氯化钛中的一种或几种的混合；在加入二氧化钛前驱体前，还加入氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。
6.一种权利要求1所述的制备方法制得的金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料在非标记磷酸化蛋白质组定量分析中的应用，其特征在于，定量分析的具体步骤为：
步骤一、将金属氧化亲和色谱磁性介孔纳米材料置于溶剂中配制成分散液；
步骤二、在分散液中加入蛋白质溶液，混合，再加入胰蛋白酶，37℃孵育；最后加入三氟乙酸和乙腈，室温振荡孵育；
步骤三、将步骤二所得溶液通过外加磁场分离出纳米材料，用缓冲液洗涤，除去非磷酸化肽段，再加入氨水37℃下振荡洗脱，取洗脱液点靶，自然干燥进行质谱分析。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤一中，分散液的浓度10~30 mg/mL；溶剂采用25 mM的碳酸氢钠溶液。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤二中，胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1：50~1：200；37℃孵育时间为1~16小时；室温振荡孵育时间为10~30分钟。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述步骤三中，缓冲液包含15 mM的碳酸氢铵，20~50wt%的乙腈和0.5~5wt%的三氟乙酸。
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