CN113999921B - 快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒 - Google Patents

快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于IMB‑RPA‑CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒，通过免疫捕获磁珠(IMB)预富集样本，RPA扩增，与CRISPR/Cas12的检测方法结合成为IMB‑RPA‑CRISPR/Cas12a的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、极高的灵敏度，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更有利于对福式志贺氏菌的分子检测技术在基层中的推广和应用。

Description

快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒。
背景技术
痢疾或细菌性痢疾是通过粪-口途径感染的急性感染性腹泻，以其高发病率(36.4/1000)和高死亡率(2.9/10万)威胁着全球的公共卫生***。据估计，由志贺菌属细菌引起的志贺氏细菌性痢疾每年在全球引起1.65亿人感染，五岁以下的幼儿占比较高。志贺菌属细菌根据抗原结构的不同分为痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌4种，分别对应于A、B、C和D亚群。研究发现福氏志贺氏菌感染的死亡率显著高于其他三种，约 60％的细菌性痢疾是由福氏志贺氏菌引起的。
目前病原菌的检测主要依靠常规的细菌学培养方法、免疫学方法、核酸探针技术、PCR 等。细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，一般需4到7天，操作繁琐、费时耗力并且敏感性低、特异性差，且无法检测受损菌及死菌；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低；核酸探针检测技术的最大优点是特异性强，但探针检测技术中也存在一定的问题，如灵敏度不够高，检测一种菌就需制备一种探针。常规PCR方法检测的灵敏度和特异性都能有所保障，但其检测时间长，需要昂贵的PCR控温仪器等配套仪器，不能很好的用于床旁检测(POCT)。
CRISPR/Cas(规律间隔成簇短回文重复序列及其关联基因)***是存在于细菌及古细菌中一种用于抵御噬菌体入侵的天然免疫***。当外来噬菌体入侵时，细菌能够生成用于识别病毒基因组的crRNA，与具有核酸内切酶活性的Cas蛋白结合形成复合体，共同对病毒靶序列进行识别和切割。该***近些年在基因编辑领域崭露头角，其基因编辑能力给生物学界带来了新的革命。目前已鉴定出很多种Cas蛋白能在sgRNA引导下对靶位点进行切割。Cas12a 属于该家族中的一种，能在sgRNA引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的Cas12a可发挥非特异性剪切酶活性，对所遇到的单链DNA(ssDNA)进行非特异性剪切。该***具有特异性靶向靶标DNA和附属非特异性切割单链DNA等特点，其出色的靶向效率和特异酶切能力使其在核酸快速检测方面具有良好的应用前景。
然而，使用单一的CRISPR/Cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。现有的一些核酸快速检测方法有LAMP(环介导等温扩增)以及RPA(重组酶聚合酶扩增)等。这类方法在一些特殊恒温核酸扩增酶介导下，摆脱了对变温设备的依赖，靶标核酸可以在固定温度进行核酸扩增与检测。基于LAMP或RAA的核酸恒温扩增检测，虽然摆脱了热循环设备的限制，但是其高速扩增和高灵敏度带来了假阳性的可能。故在恒温扩增方法的基础上引入了高度精确的CRISPR/Cas ***，能极大提高检测方法的精确度与灵敏度。
尽管将恒温扩增与CRISPR/Cas***结合能够极大的提升检测的精准度，但是对于极低浓度的样本仍然不适用。极低浓度的样本需要在检测前进行病原体的富集和DNA的提取以提高检测的灵敏度。免疫磁分离技术是将病原体特异性抗体与一定大小的磁珠偶联制成免疫捕获磁珠(IMB)，利用特异性抗体能与细菌的表面抗原相结合的原理，在外磁场的作用下，将IMB-细菌复合物从环境中分离出来，达到获取目标病原体的一项技术，但是单独使用该技术时只能实现分离，还需结合其他手段进行检测，而目前使用免疫磁分离技术进行分离的检测方法的灵敏度仍有待提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法。
另一目的是提供一种基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的试剂盒。
本发明的技术方案为：基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法，包括如下步骤：
(1)通过免疫磁珠(IMB)富集待检测样品；
(2)提取步骤(1)免疫磁珠分离后得到的溶液的总DNA；
(3)以步骤(2)得到的总DNA为模板，以RPA-F和RPA-R为引物进行重组酶聚合酶扩增(RPA)扩增，所述RPA-F序列为TTTGACCAAGCCTATCGTTGTTAATAATAC (SEQ ID No.1)，RPA-R序列为AAACTTTCAGTTTATGGTCCGGGTTATTG(SEQ ID No.2)；
(4)将步骤(3)的扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中进行酶切并进行荧光检测， CRISPR/Cas12a检测体系的sgRNA的序列为sgRNA1： GAAUUUCUACUGUUGUAGAUUGCGGAGAGCAGUACUUCAGCGGA(SEQ ID No.3)A或 sgRNA2：GAAUUUCUACUGUUGUAGAUUGGUCCGGGUUAUUGUCACCAGAA(SEQ ID No.4)。
进一步地，步骤(3)中，所述重组酶聚合酶扩增(RPA)扩增的反应体系为：20μL的试剂体系包含：10μL 2x Reaction Buffer，2μL 10x Basic E-mix，1.8mMdNTPs，1μL 10mM正/反向引物，1μL 20x Core Reaction Mix，1μL 280mMMgOAc以及5μL的模板DNA，反应条件：38℃扩增10min。
进一步地，步骤(4)中，所述CRISPR/Cas12a检测体系包含150nM的Lba Cas12a，0.625μMsgRNA，4U/μL RNA酶抑制剂，2μL的NEBuffer 2.1，1μM荧光-淬灭标记的 ssDNA探针以及DEPC水。
进一步地，所述荧光检测采用485nm的光源透射。
基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的试剂盒，包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂，所述RPA扩增试剂中含有RPA扩增引物对，RPA扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，CRISPR/Cas12a检测试剂中含有sgRNA引物，sgRNA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示。
进一步地，所述RPA扩增试剂含有：10μL 2x Reaction Buffer，2μL 10x Basic E-mix， 1.8mMdNTPs，1μL 10mM正/反向引物，1μL 20x Core Reaction Mix，1μL 280mMMgOAc。
进一步地，CRISPR/Cas12a检测试剂含有：150nM的Lba Cas12a，0.625μMsgRNA，4U/μL RNA酶抑制剂，2μL的NEBuffer 2.1，1μM荧光-淬灭标记的ssDNA探针以及DEPC 水。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对免疫捕获磁珠(IMB)预富集样本，RPA扩增，与CRISPR/Cas12的检测方法结合成为IMB-RPA-CRISPR/Cas12a的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、极高的灵敏度，操作简便快捷，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更有利于对福式志贺氏菌的分子检测技术在基层中的推广和应用。
附图说明
图1构建的IMB在与福氏志贺氏菌溶液孵育捕获图；
图2 CRISPR/Cas12a检测体系的sgRNA筛选；
图3荧光强度随着孵育时间的变化情况；
图4 IMB-RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系的灵敏度检测；
图5 IMB-RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系检测；
图6 20株临床福氏志贺氏菌通过IMB-RPA-CRISPR/Cas12a鉴定的情况。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
实施例1：免疫捕获磁珠(IMB)的构建
1.1磁珠预处理
将磁珠漩涡振荡1min，使磁珠充分振荡重悬；取500μL磁珠悬液置于1.5mLEP管中，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。加1mL 4℃的预冷的Wash Buffer A 洗涤，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下EP管，重复洗涤一次。
1.2抗体偶联
将步骤1.1预处理的磁珠悬液进行磁性分离后加入500μL福氏志贺氏菌抗体溶液于EP 管中，涡旋30s，使其混合均匀。将EP管涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合2h。采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。
1.3磁珠封闭
加1mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋30s，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。重复操作四次。再加1mL Blocking Buffer于EP管中，涡旋30s，将EP管置于垂直混合仪中室温反应2h。将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。加1mL超纯水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。
1.4免疫磁珠捕获抗原时间确定
将5×103CFU/mL福氏志贺氏菌溶液加入步骤1.3的结合有福氏志贺氏菌特异抗体的偶联磁珠溶液中，置于水平摇床100转/分钟室温孵育，每隔10分钟进行磁性分离，然后通过平板计数检测上清中的细菌数量。
如图1所示，本发明中构建的IMB在与5.5×103CFU/mL福氏志贺氏菌溶液孵育30分钟后达到捕获上限。
实施例2：特异性靶基因筛选及建立RPA扩增方法
1.1本地BLAST分析
从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载福氏志贺氏菌全基因组序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到菌种各序列片段与数据库的比对结果。
1.2BLAST重确认
使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和菌种鉴定可用性。一种策略为BLAST时排除目的菌种，结果显示无任何相似序列者为目的菌种特异基因；第二种策略为BLAST时选择在目的菌种内进行检索，结果返回大量相似序列者是目的菌种的不同菌株共有序列。结合两种策略，最终找出符合两种策略标准的目的基因。
1.3引物设计
本试验以福氏志贺氏菌的假说蛋白基因(hypothetical protein)，GenBank登陆号为 AE014073(4170556..4171068)设计特异引物。特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)设计完成，引物F：TTTGACCAAGCCTATCGTTGTTAATAATAC，引物R：AAACTTTCAGTTTATGGTCCGGGTTATTG，该引物用于RPA扩增。
1.4RPA扩增反应
1.4.1DNA的提取
用天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
①取细菌培养液5mL，10,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
②向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
③向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
④加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑤加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
⑥将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)， 12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑧向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
⑨重复操作步骤8。
⑩将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
Figure RE-GDA0003400713670000051
将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
1.4.2RPA扩增体系
取上述提出的DNA进行RPA反应。20μL的试剂体系包含：10μL2x Reaction Buffer，2μL10x Basic E-mix，1.8mMdNTPs，1μL10mM正/反向引物，1μL20x Core Reaction Mix， 1μL 280mMMgOAc以及5μL的模板DNA。反应条件：38℃扩增10min。
实施例3：建立IMB-RPA-CRISPR/Cas12a酶切方法
1.1建立RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系
1.1.1CRISPR/Cas12a检测体系的优化
设计4条针对假说蛋白基因的sgRNA序列，具体序列如下：
sgRNA1：GAAUUUCUACUGUUGUAGAUUGCGGAGAGCAGUACUUCAGCGGA
sgRNA2：GAAUUUCUACUGUUGUAGAUUGGUCCGGGUUAUUGUCACCAGAA
sgRNA3：GAAUUUCUACUGUUGUAGAUCCUGACAACGCUUGAGCAGGAUCC
sgRNA4：GAAUUUCUACUGUUGUAGAUAGCAUCAUAUAACGCUUACCGCCA
以经过IMB捕获的5×103CFU/mL福氏志贺氏菌释放的DNA作为RPA扩增的模板，于管底发生RPA扩增反应。共20μLRPA反应产物作为酶切底物，采用20μL的 CRISPR/Cas12a反应体系对sgRNA切割活性进行筛选。为避免RPA扩增后开盖操作造成气溶胶传播，CRISPR/Cas12a反应体系预置在PCR管盖部，包含150nM的
Figure RE-GDA0003400713670000061
Lba Cas12a， 0.625μMsgRNA，4U/μL RNA酶抑制剂，2μL的NEBuffer 2.1，1μM FAM-BHQ1标记的 ssDNA探针(FAM-TTTTTT-BHQ1)以及DEPC水。当10min的RPA反应完成后，颠倒混匀PCR反应管，并在38℃条件下进行40min的酶切。荧光信号由CFX96 Touch Real-Time PCR检测***采集，可视化结果由激发波长为485nm的透射光源实现。
如图2，CRISPR/Cas12a检测体系的sgRNA筛选结果显示，本发明中，sgRNA1和2有荧光产生，且在激发波长为485nm的透射光源下sgRNA2可产生更加明亮的荧光，将 sgRNA2用作后续试验的检测。
为了进一步的缩短检测用时，对荧光产生过程用CFX96 Touch Real-Time PCR检测***采集进行实时监测，并对不同时间点的荧光强度通过手机拍照进行记录。
如图3所示，本发明中，荧光强度随着孵育时间的增加而增强，在20分钟左右达到最大值。根据不同时间点荧光强度，我们可以在10分钟对酶切结果进行可视化判别。
1.1.2IMB-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法灵敏度分析
用免免疫捕捕获磁珠富集10倍梯度稀释后的福氏志贺氏菌，磁分离后通过加热释放 DNA，进行RPA-CRISPR/Cas12a检测，其反应体系和反应程序如前所述。
如图4，IMB-RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系的灵敏度检测结果显示，本发明中的IMB- RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系的灵敏度为5×100CFU/mL菌液。
1.1.3IMB-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法特异性分析
根据RPA反应体系的最佳反应条件和CRISPR/Cas12a最佳切割反应条件下对福氏志贺氏菌，粪肠球菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行检测，用以验证该方法对福氏志贺氏菌的特异性检测。
如图5所示，本发明中，经IMB-RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系检测，有且仅有福氏志贺氏菌检测产生荧光呈阳性，粪肠球菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌检测均呈阴性无荧光。
1.1.4IMB-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法对临床菌株分离株的检测
对20份经临床鉴定的福氏志贺氏菌临床分离株，通过IMB富集福氏志贺氏菌，磁分离后通过加热释放DNA，然后使用本发明的RPA-CRISPR/Cas12a对样本进行检测，以验证IMB-RPA-CRISPR/Cas12a检测临床分离株的能力。
如图6所示，本发明中，IMB-RPA-CRISPR/Cas12a鉴定体系在20份经临床鉴定的福氏志贺氏菌临床分离株中得到了验证。表明了IMB-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法可以运用到临床分离株的检测，而且IMB-RPA-CRISPR/Cas12a检测更加方便快捷，较高灵敏度和特异性，并且能够直观，肉眼可见的观察检测结果。
序列表
<110> 中国医学科学院输血研究所
<120> 快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法和试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttgaccaag cctatcgttg ttaataatac 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaactttcag tttatggtcc gggttattg 29
<210> 3
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaauuucuac uguuguagau ugcggagagc aguacuucag cgga 44
<210> 4
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaauuucuac uguuguagau ugguccgggu uauugucacc agaa 44

Claims (8)

1.非疾病诊断目的的基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）通过免疫磁珠（IMB）富集待检测样品；
（2）提取步骤（1）免疫磁珠分离后得到的溶液的总DNA；
（3）以步骤（2）得到的总DNA为模板，以RPA-F和RPA-R为引物进行重组酶聚合酶扩增（RPA）扩增，所述RPA-F序列如SEQ ID No.1所示，RPA-R序列如SEQ ID No.2所示；
（4）将步骤（3）的扩增产物在CRISPR/Cas12a检测体系中进行酶切并进行荧光检测，所述CRISPR/Cas12a检测体系的sgRNA的序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述重组酶聚合酶扩增（RPA）扩增的反应体系为：20 μL的试剂体系包含：10 μL 2x Reaction Buffer，2 μL 10x BasicE-mix，1.8 mM dNTPs，1 μL 10 mM正/反向引物，1 μL 20x Core Reaction Mix，1 μL 280mM MgOAc以及5 μL的模板DNA，反应条件：38 ℃扩增10min。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述CRISPR/Cas12a检测体系包含150 nM的Lba Cas12a，0.625 μM sgRNA，4 U/μL RNA酶抑制剂，2 μL的NEBuffer 2.1，1μM 荧光-淬灭标记的ssDNA探针以及DEPC水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光检测采用485nm的光源透射。
5. 基于IMB-RPA-CRISPR/Cas12a快速可视化检测福氏志贺氏菌的试剂盒，包括RPA扩增试剂和CRISPR/Cas12a检测试剂，所述RPA扩增试剂中含有RPA扩增引物对，RPA扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，CRISPR/Cas12a检测试剂中含有sgRNA引物，sgRNA引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4所示。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂含有：10 μL 2xReaction Buffer，2 μL 10x Basic E-mix，1.8 mM dNTPs，1 μL 10 mM RPA扩增引物对，1μL 20x Core Reaction Mix，1 μL 280 mM MgOAc。
7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，CRISPR/Cas12a检测试剂含有：150 nM的Lba Cas12a，0.625 μM sgRNA，4 U/μL RNA酶抑制剂，2 μL的NEBuffer 2.1，1 μM 荧光-淬灭标记的ssDNA探针以及DEPC水。
8. 根据权利要求5-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，sgRNA引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
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