CN113999841A - 蛋白质支架oval100及其在放射配体法中的应用 - Google Patents

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陈恒
杨涛
郑帅
付煜
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Abstract

本发明公开了一种可携带放射性信号的蛋白质支架OVAL100及其在放射配体法检测抗体中的应用，属于生物技术领域。所述蛋白质支架OVAL100的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的蛋白质支架OVAL100在RBA检测中可有效携带放射性信号，其放射读数随着抗体含量的增加而增加；该OVAL100蛋白质支架可用于携带微小抗原，以及一些自身无法携带放射性信号的抗原，用于抗体的捕获及鉴定。

Description

蛋白质支架OVAL100及其在放射配体法中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可携带放射性信号的蛋白质支架OVAL100及其在放射配体法检测抗体中的应用。
背景技术
放射配体法在进行抗原抗体的检测中具有信号灵敏、线性范围广泛、成本低廉等优势。利用受体的放射配体结合分析（radioligand binding assay，RBA）检测ZnT8自身抗体，目前已成为全球糖尿病自身抗体检测的金标准。该方法在抗原制备的过程中有得天独厚的优势：1、将抗原中含S的蛋氨酸，替换成35S标记的放射性蛋氨酸，不改变原来抗原的任何空间结构，区别于其他的需要标记外源物质的检测方法；2、快速转录翻译抗原制备只需90分钟，时间短，成本低；3、抗原用量极低，90分钟制备的抗原可检测上千份样本。
但是，发明人在研究中发现，放射性抗原在制备的过程中需要满足一定的条件：1）抗原的序列中要包含一定量的蛋氨酸，但部分抗原内不含或者含有极少量的蛋氨酸，无法有效携带放射性信号，从而无法快速转录翻译放射性抗原，限制了该方法的应用；2）部分微小的抗原结构域，由于其自身过小，不仅难以常规生物合成，也不能进行快速转录翻译。
发明内容
本发明的目的是提供一种可携带放射性信号的蛋白质支架OVAL100，该蛋白质支架富含蛋氨酸，可与已知抗原连接，通过转录翻译获得放射性抗原进行抗体的捕获，完成放射配体法检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
蛋白质支架OVAL100，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体如下：
GTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCT。
上述蛋白质支架OVAL100在放射配体法检测抗体中的应用。
进一步地，所述抗体为ZnT8自身抗体。
进一步地，所述应用的具体步骤为：
步骤1，构建含蛋白质支架OVAL100核苷酸序列和抗原核苷酸序列的质粒；
步骤2，采用35S-蛋氨酸标记步骤1得到的质粒，并进行转录翻译，获得放射性标记的抗原；
步骤3，采用步骤2得到的抗原对待测抗体进行检测。
本发明的蛋白质支架OVAL100在RBA检测中可有效携带放射性信号，其放射读数随着抗体含量的增加而增加；该OVAL100蛋白质支架可用于携带微小抗原，以及一些自身无法携带放射性信号的抗原，用于抗体的捕获及鉴定。
附图说明
图1为蛋白质支架OVAL100携带放射性信号的效率。
图2为RBA检测ZnT8及OVAL100ZnT8的ROC曲线。
图3为RBA检测ZnT8及OVAL100ZnT8的相关性分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
蛋白质支架OVAL100在放射配体法检测ZnT8自身抗体中的应用
1、实验材料
（1）样本来源：ZnT8阳性质控血清标本取自于美国Barbara Davis Center forChildhood Diabetes实验室，阴性质控血清标本取自于无糖尿病家族史的健康志愿者。糖尿病患者血样192例，来自于临床血糖异常的患者。1型糖尿病（T1DM）ZnT8阳性血清17例，来自申请人RBA ZnT8检测技术平台验证后的临床诊断T1D样本。健康人（Health）133例来自招募人群［年龄(23.8±8.9)岁；男72例，女61例］；糖耐量检测（OGTT）空腹及2h血糖正常，排除心、脑、肝、肾等慢性及内分泌疾病，无糖尿病家族病史及自身免疫疾病史。
（2）主要试剂及仪器：TNT SP6快速转录翻译试剂盒（Promega公司，货号L2080)；35S-蛋氨酸（5mCi，PerkinElmer，货号NEG709A）；蛋白A琼脂糖（GE公司，货号17-5280-02）；NAP-5柱（GE公司）；96孔PVDF平板（Corning公司，货号3504）；Microscint-20闪烁液（PerkinElmer公司，货号6013621）；TBST缓冲液（Tris-Base 2.424g，NaCl 8.70g， Tween-20 1.5mL，BSA 1.0g加蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.4）；β Counter液体闪烁计数仪（PerkinElmer）；蛋白纯化柱 NAP Column（GE公司，货号17-0853-02）；Anti-Ovalbumin抗体（abcam公司，货号ab181688）。
2、实验方法
（1）构建三种质粒
Figure 59963DEST_PATH_IMAGE001
OVAL100
Figure 398674DEST_PATH_IMAGE002
ZnT8
Figure 847585DEST_PATH_IMAGE003
OVAL100ZnT8
a、构建方案：按照哺乳蛋白表达体系进行密码子优化后（避开两个酶切位点）构建在载体上，包含kozak序列，XhoI、XbaI酶切位点，目的序列。方式如下：
XhoI（ctcgag）+kozak序列（gccacc）+ ATG +目的序列+终止密码子+ XbaI
b、目的序列：
质粒
Figure 190930DEST_PATH_IMAGE001
OVAL100目的序列如SEQ ID NO.2所示。具体如下：
GTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCTCCTAAACCCTCCACCCCGCCTGGTTCTTCAGGCGGTGGATCCGTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCT
质粒
Figure 426872DEST_PATH_IMAGE002
ZnT8目的序列如SEQ ID NO.3所示。具体如下：
ATGAAGGACTTCTCCATCTTACTCATGGAAGGTGTGCCAAAGAGCCTGAATTACAGTGGTGTGAAAGAGCTTATTTTAGCAGTCGACGGGGTGCTGTCTGTGCACAGCCTGCACATCTGGTCTCTAACAATGAATCAAGTAATTCTCTCAGCTCATGTTGCTACAGCAGCCAGCCGGGACAGCCAAGTGGTTCGGAGAGAAATTGCTAAAGCCCTTAGCAAAAGCTTTACGATGCACTCACTCACCATTCAGATGGAATCTCCAGTTGACCAGGACCCCGACTGCCTTTTCTGTGAAGACCCCTGTGACCCTAAACCCTCCACCCCGCCTGGTTCTTCAGGCGGTGGATCCATGAAGGACTTCTCCATCTTACTCATGGAAGGTGTGCCAAAGAGCCTGAATTACAGTGGTGTGAAAGAGCTTATTTTAGCAGTCGACGGGGTGCTGTCTGTGCACAGCCTGCACATCTGGTCTCTAACAATGAATCAAGTAATTCTCTCAGCTCATGTTGCTACAGCAGCCAGCTGGGACAGCCAAGTGGTTCGGAGAGAAATTGCTAAAGCCCTTAGCAAAAGCTTTACGATGCACTCACTCACCATTCAGATGGAATCTCCAGTTGACCAGGACCCCGACTGCCTTTTCTGTGAAGACCCCTGTGAC
质粒
Figure 931890DEST_PATH_IMAGE003
OVAL100ZnT8目的序列如SEQ ID NO.4所示。具体如下：
ATGAAGGACTTCTCCATCTTACTCATGGAAGGTGTGCCAAAGAGCCTGAATTACAGTGGTGTGAAAGAGCTTATTTTAGCAGTCGACGGGGTGCTGTCTGTGCACAGCCTGCACATCTGGTCTCTAACAATGAATCAAGTAATTCTCTCAGCTCATGTTGCTACAGCAGCCAGCCGGGACAGCCAAGTGGTTCGGAGAGAAATTGCTAAAGCCCTTAGCAAAAGCTTTACGATGCACTCACTCACCATTCAGATGGAATCTCCAGTTGACCAGGACCCCGACTGCCTTTTCTGTGAAGACCCCTGTGACCCTAAACCCTCCACCCCGCCTGGTTCTTCAGGCGGTGGATCCGTGACTGAGCAAGAAAGCAAACCTGTGCAGATGATGTACCAGATTGGTTTATTTAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAGAAAATGAAGATCCTGGAGCTTCCATTTGCCAGTGGGACAATGAGCATGTTGGTGCTGTTGCCTGATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGATCAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATACAACCTCACATCTGTCTTAATGGCTCCTAAACCCTCCACCCCGCCTGGTTCTTCAGGCGGTGGATCCATGAAGGACTTCTCCATCTTACTCATGGAAGGTGTGCCAAAGAGCCTGAATTACAGTGGTGTGAAAGAGCTTATTTTAGCAGTCGACGGGGTGCTGTCTGTGCACAGCCTGCACATCTGGTCTCTAACAATGAATCAAGTAATTCTCTCAGCTCATGTTGCTACAGCAGCCAGCTGGGACAGCCAAGTGGTTCGGAGAGAAATTGCTAAAGCCCTTAGCAAAAGCTTTACGATGCACTCACTCACCATTCAGATGGAATCTCCAGTTGACCAGGACCCCGACTGCCTTTTCTGTGAAGACCCCTGTGAC
（2）转录翻译质粒，获得放射性标记的抗原
35S-蛋氨酸和TNT SP6混合液解冻后置于冰上，依次加入40μL TNT混合液、1μL（1μg/μL）质粒和5μL35S-蛋氨酸，用4μL无核酸酶水补充至总反应体系为50μL，充分混匀后置于30℃水浴箱孵育90min，随后取出置于冰上准备过NAP-5柱。
取出1只NAP-5柱置于试管架上，将其上下盖子均打开，弃去平衡液后加入1mL的TBST缓冲液平衡NAP-5柱， 洗脱3次。将反应混合物小心加在NAP-5柱填充物表面，再用100μL的缓冲液清洗反应管后仍将其加入NAP-5柱中，待红色液体缓慢下移至柱2/3后，加入500μL缓冲液，仔细观察柱下液滴的颜色变化，收集红色过柱液约500μL，从中取出2μL过柱抗原于闪烁管中与1mL闪烁液混匀，置96孔β Counter闪烁计数仪上计数其每分钟脉冲数（countsperminute, CPM）值。
以上根据三种质粒转录翻译出三种蛋白OVAL100、ZnT8、OVAL100ZnT8。
（3）待测样本与抗原的结合与检测
每孔各加5μL血清，每个标本和质控血清均为双复孔，取适量标记抗原，用6mLTBST缓冲液稀释标记抗原至20000CPM/60μL，向其中每孔加60μL稀释后的标记抗原，每孔CPM值要求≥20000，标记抗原与血清混匀振荡1小时。4℃冰箱中过夜。次日依次从96孔平板各孔中取出50μL混合液转移至96孔PVDF过滤板上，每孔中加25μL的蛋白A-琼脂糖，沉淀抗原-抗体复合物，再在4℃冰箱中混匀1h后取出，先向PVDF过滤板各孔中加200μL TBST缓冲液洗涤沉淀物，真空泵抽吸去液体留取沉淀物（为防止抽吸时沉淀物丢失，真空泵压力不宜过大），再加150μL缓冲液重复洗涤7次，置于烘箱烘干后每孔加入200μL闪烁液，置96孔βCounter计数仪上计数，每孔计数1min。
结果计算：
指数=（标本血清CPM－阴性质控CPM)/( 阳性质控CPM－阴性质控CPM)。
统计学处理：
所有数据均采用GraphPad软件进行统计，对所有计量资料符合正态分布的以用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验、单因素方差分析、方差分析趋势性检验，两种方法的比较采用受试者工作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析，并采用 Cohen′s kappa 系数分析结果的一致性，Spearman分析结果的相关性。P<0.05 为差异具有统计学意义。
3、实验结果
（1）蛋白质支架OVAL100携带放射性信号的有效性
转录翻译质粒
Figure 596583DEST_PATH_IMAGE001
OVAL100，获得带有放射性信号的蛋白质支架OVAL100，将购买的 针对OVAL100蛋白的抗体作为模拟样本，使用该蛋白质支架进行模拟样本的捕获，根据上述 实验方法，检测不同模拟样本量下的放射读数。
如图1所示，蛋白质支架OVAL100可有效捕获抗体，其携带的放射信号随着抗体浓度的变化而变化。
（2）RBA检测ZnT8及OVAL100ZnT8结果的一致性检验，ROC曲线分析
利用申请人已有的经过国际IASP认证的RBA检测ZnT8 抗体技术平台，对T1DM患者血清中的ZnT8 抗体进行常规的检测。随后将ZnT8蛋白替换为OVAL100ZnT8蛋白，检测方法不变，一致性检验结果如下表所示。
Figure 992886DEST_PATH_IMAGE004
经一致性检验，Kappa=0.932，阳性判断一致率达97.95%，放射配体法的ZnT8和OVAL100ZnT8抗体检测结果高度一致。
ROC曲线如图2所示，OVAL100ZnT8抗体的敏感性90.8%（59/65），特异性99.6%（276/277），AUC曲线下面积为0.904，P < 0.0001，二者无显著性差异。
（3）RBA检测ZnT8及OVAL100ZnT8结果的相关性分析
RBA ZnT8及OVAL100ZnT8分别检测192例DM血样、17例T1DM ZnT8阳性血清、133例健康人（Health），合计n＝342，检测结果进行相关性分析。
结果如图3所示，经Spearman分析，两种方法的检测结果相关性r＝0.5390，95%置信区间0.4567～0.6122，P< 0.0001，两组检测结果高度相关。
本发明的蛋白质支架OVAL100在RBA检测中可有效携带放射性信号，其放射读数随着抗体含量的增加而增；OVAL100可携带抗原，用于抗体的捕获与检测，在ZnT8抗体的检测中，无论是否携带支架，两者的结果高度相关。因此OVAL100蛋白质支架可用于携带微小抗原，以及一些自身无法携带放射性信号的抗原，用于抗体的捕获及鉴定。
序列表
<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
<120> 蛋白质支架OVAL100及其在放射配体法中的应用
<130> 20210916
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgactgagc aagaaagcaa acctgtgcag atgatgtacc agattggttt atttagagtg 60
gcatcaatgg cttctgagaa aatgaagatc ctggagcttc catttgccag tgggacaatg 120
agcatgttgg tgctgttgcc tgatgaagtc tcaggccttg agcagcttga gagtataatc 180
aactttgaaa aactgactga atggaccagt tctaatgtta tggaagagag gaagatcaaa 240
gtgtacttac ctcgcatgaa gatggaggaa aaatacaacc tcacatctgt cttaatggct 300
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgactgagc aagaaagcaa acctgtgcag atgatgtacc agattggttt atttagagtg 60
gcatcaatgg cttctgagaa aatgaagatc ctggagcttc catttgccag tgggacaatg 120
agcatgttgg tgctgttgcc tgatgaagtc tcaggccttg agcagcttga gagtataatc 180
aactttgaaa aactgactga atggaccagt tctaatgtta tggaagagag gaagatcaaa 240
gtgtacttac ctcgcatgaa gatggaggaa aaatacaacc tcacatctgt cttaatggct 300
cctaaaccct ccaccccgcc tggttcttca ggcggtggat ccgtgactga gcaagaaagc 360
aaacctgtgc agatgatgta ccagattggt ttatttagag tggcatcaat ggcttctgag 420
aaaatgaaga tcctggagct tccatttgcc agtgggacaa tgagcatgtt ggtgctgttg 480
cctgatgaag tctcaggcct tgagcagctt gagagtataa tcaactttga aaaactgact 540
gaatggacca gttctaatgt tatggaagag aggaagatca aagtgtactt acctcgcatg 600
aagatggagg aaaaatacaa cctcacatct gtcttaatgg ct 642
<210> 3
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaggact tctccatctt actcatggaa ggtgtgccaa agagcctgaa ttacagtggt 60
gtgaaagagc ttattttagc agtcgacggg gtgctgtctg tgcacagcct gcacatctgg 120
tctctaacaa tgaatcaagt aattctctca gctcatgttg ctacagcagc cagccgggac 180
agccaagtgg ttcggagaga aattgctaaa gcccttagca aaagctttac gatgcactca 240
ctcaccattc agatggaatc tccagttgac caggaccccg actgcctttt ctgtgaagac 300
ccctgtgacc ctaaaccctc caccccgcct ggttcttcag gcggtggatc catgaaggac 360
ttctccatct tactcatgga aggtgtgcca aagagcctga attacagtgg tgtgaaagag 420
cttattttag cagtcgacgg ggtgctgtct gtgcacagcc tgcacatctg gtctctaaca 480
atgaatcaag taattctctc agctcatgtt gctacagcag ccagctggga cagccaagtg 540
gttcggagag aaattgctaa agcccttagc aaaagcttta cgatgcactc actcaccatt 600
cagatggaat ctccagttga ccaggacccc gactgccttt tctgtgaaga cccctgtgac 660
<210> 4
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaggact tctccatctt actcatggaa ggtgtgccaa agagcctgaa ttacagtggt 60
gtgaaagagc ttattttagc agtcgacggg gtgctgtctg tgcacagcct gcacatctgg 120
tctctaacaa tgaatcaagt aattctctca gctcatgttg ctacagcagc cagccgggac 180
agccaagtgg ttcggagaga aattgctaaa gcccttagca aaagctttac gatgcactca 240
ctcaccattc agatggaatc tccagttgac caggaccccg actgcctttt ctgtgaagac 300
ccctgtgacc ctaaaccctc caccccgcct ggttcttcag gcggtggatc cgtgactgag 360
caagaaagca aacctgtgca gatgatgtac cagattggtt tatttagagt ggcatcaatg 420
gcttctgaga aaatgaagat cctggagctt ccatttgcca gtgggacaat gagcatgttg 480
gtgctgttgc ctgatgaagt ctcaggcctt gagcagcttg agagtataat caactttgaa 540
aaactgactg aatggaccag ttctaatgtt atggaagaga ggaagatcaa agtgtactta 600
cctcgcatga agatggagga aaaatacaac ctcacatctg tcttaatggc tcctaaaccc 660
tccaccccgc ctggttcttc aggcggtgga tccatgaagg acttctccat cttactcatg 720
gaaggtgtgc caaagagcct gaattacagt ggtgtgaaag agcttatttt agcagtcgac 780
ggggtgctgt ctgtgcacag cctgcacatc tggtctctaa caatgaatca agtaattctc 840
tcagctcatg ttgctacagc agccagctgg gacagccaag tggttcggag agaaattgct 900
aaagccctta gcaaaagctt tacgatgcac tcactcacca ttcagatgga atctccagtt 960
gaccaggacc ccgactgcct tttctgtgaa gacccctgtg ac 1002

Claims (4)

1.蛋白质支架OVAL100，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的蛋白质支架OVAL100在放射配体法检测抗体中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗体为ZnT8自身抗体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用的具体步骤为：
步骤1，构建含蛋白质支架OVAL100核苷酸序列和抗原核苷酸序列的质粒；
步骤2，采用35S-蛋氨酸标记步骤1得到的质粒，并进行转录翻译，获得放射性标记的抗原；
步骤3，采用步骤2得到的抗原对待测抗体进行检测。
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