CN113999791B - 一种吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素b1的假中间布鲁氏菌及其应用 - Google Patents

一种吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素b1的假中间布鲁氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌及其应用，所述假中间布鲁氏菌命名为假中间布鲁氏菌(Brucella pseudintermedia)ASAG‑D25菌株。本发明所涉及的假中间布鲁氏菌具有高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的特性，且解吸附率很低，其可用于粮食、农副产品及饲料中呕吐毒素/黄曲霉素B1消减，具有生产使用成本低、简单、易操作、安全、高效等优点，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。

Description

一种吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌及其 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种新型的假中间布鲁氏菌及其应用，尤其涉及一种高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌及其应用。
背景技术
粮食及制品安全作为世界各国普遍关注的焦点问题，涉及从农田到餐桌整个食物链的安全保障。据统计，每年约有25％的谷物不同程度受到真菌毒素的污染，对畜牧业造成的经济损失达数十亿美元。呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，其对谷物的污染居于镰刀菌毒素之首，严重威胁人和家畜的健康。动物和人类食用污染DON的食物和饲料后，DON与脑干后区呕吐中枢的5-羟色胺受体及多巴胺受体互作产生催吐作用，因此又被成为呕吐毒素。
DON多分布于小麦、大麦和玉米等谷物籽实中，阴雨潮湿或低温高湿可导致谷物被呕吐毒素污染，且DON具有较强的耐热和耐酸性。粮食深加工条件具有高盐、高温、高酸等特点，传统技术手段受限于反应条件温和、溶液渗透压等问题，在不改变现有工艺条件下难以取得预期效果。吸附剂是饲料领域目前应用最广的真菌毒素消减技术手段，在上述生产环境及动物胃肠道中具有较好表现。微生物吸附是指其菌体细胞壁通过非共价键与毒素分子结合，由于菌体细胞壁很难被人和动物消化分解，可携带毒素随粪便一起排出体外。微生物吸附法中的微生物细胞壁不生长、不携带有害化学物质，因而不会造成饲料营养、感官特性如颜色和风味的改变。与传统技术相比，真菌毒素微生物吸附技术被认为是食物和饲料脱毒最佳策略。
现有技术中多为主要针对黄曲霉毒素的硅铝酸盐类吸附剂，对粮油副产物中黄曲霉毒素吸附效果较好且很少吸附其他营养成分，解吸附性弱。而针对呕吐毒素等污染较严重的真菌毒素，市面上现有吸附剂对其吸附效果较差。因此，开发出能够能够快速吸附呕吐毒素和/或黄曲霉毒素且解吸附率低的吸附策略是非常有必要的，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提高经济效益具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的假中间布鲁氏菌及其应用，尤其提供一种高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌，所述假中间布鲁氏菌命名为假中间布鲁氏菌(Brucella pseudintermedia)ASAG-D25菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年7月15日，保藏编号为CGMCC No.22904，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述假中间布鲁氏菌(Brucella pseudintermedia)的同种异名为假中间苍白杆菌(Ochrobactrum pseudintermedium)。
上述“高效吸附”是指活化后的ASAG-D25菌株以1％的接种量接种至LB液体培养基中24h后，1mL菌悬液离心收集到的菌体在含有10μg/mL呕吐毒素和0.5μg/mL黄曲霉素B1的10mL MM液体培养基中进行脱毒反应，15分钟后，呕吐毒素吸附率达到95％以上，黄曲霉素B1吸附率达到70％以上。
本发明所涉及的假中间布鲁氏菌具有高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的特性，且解吸附率很低，其可用于粮食、农副产品及饲料中呕吐毒素/黄曲霉素B1消减，具有生产使用成本低、简单、易操作、安全、高效等优点，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。
本发明所涉及的高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌可以通过如下方法分离和筛选得到：
(1)从江苏徐州地区种植小麦土壤采来的土样，通过富集培养，获得菌悬液，然后将菌悬液依次进行梯度稀释，取稀释后的样品涂布在LB琼脂平板(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，121℃灭菌20min)上；
(2)挑取生长分离程度良好且菌落形态特征、颜色不同的菌落，在呕吐毒素为10μg/mL的无机盐培养基(又称MM培养基，组分如下：Na2HPO4 2g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.7H2O0.03g/L，NH4Cl 0.53g/L，121℃灭菌20min)中进行脱毒试验；
(3)甲醇提取残留呕吐毒素并进行HPLC检测，验证各个纯培养物的呕吐毒素吸附效果，最终成功获得能够吸附呕吐毒素的菌株ASAG-D25，挑取ASAG-D25单菌落于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，121℃灭菌20min)中，培养至对数期中期时，用70％的甘油溶液(甘油:水＝1:1)与培养物等体积混合后置于-80℃保存。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的假中间布鲁氏菌在吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1中的应用。
第三方面，本发明提供一种吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的液态菌剂，所述液态菌剂中的活性组分包括如第一方面所述的假中间布鲁氏菌。
优选地，所述液态菌剂中还含有吸附剂，所述吸附剂包括玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、碳酸钙或泥炭中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如玉米芯粉和麸皮的组合、淀粉和硅藻土的组合、凹凸棒土和蛭石的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述液态菌剂中的活性组分与吸附剂的质量比为1:(2-10)，例如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等，该数值范围内的其他任意的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的液态菌剂中的活性组分还包括如第七方面所述的生物吸附剂。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的液态菌剂的制备方法，所述制备方法包括：(1)将第一方面所述的假中间布鲁氏菌活化后接种于种子培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；(2)将所述种子液接种于发酵培养基中，培养至稳定期，制得所述液态菌剂。
在上述制备方法中，用来培养假中间布鲁氏菌ASAG-D25的种子培养基和发酵培养基可以有多种形式的，但是综合考虑生产成本、细胞生物量、脱毒活性等方面，优选某些培养基，例如，优选碳源为麦芽糖，但也可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、果糖、半乳糖、甘露糖、糖蜜等；优选氮源为胰蛋白胨，但也可以使用牛肉膏、玉米浆、酵母膏、酵母提取物等；可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下列离子的常规可溶性盐：锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铁离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。
优选地，所述的种子培养基和发酵培养基在115-125℃下灭菌后冷却至30-32℃使用。
优选地，所述活化后的菌种按种子罐中种子培养基的0.5-10％接种量接种入种子罐；所述种子液按发酵罐中发酵培养基的0.5-10％接种量接种入发酵罐。
优选地，所述培养至稳定期的条件为：无菌空气的通气量为1:(0.5-1.2)，搅拌速度为50-300转/分，培养温度约30-32℃，液态菌剂中活细胞数量至少达到107CFU/mL。
第五方面，本发明提供一种吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的固态菌剂，所述固态菌剂中的活性组分包括第一方面所述的假中间布鲁氏菌。
优选地，所述固态菌剂中还含有吸附剂，所述吸附剂包括玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、碳酸钙或泥炭中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如玉米芯粉和麸皮的组合、淀粉和硅藻土的组合、凹凸棒土和蛭石的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述固态菌剂中的活性组分与吸附剂的质量比为1:(2-10)，例如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等，该数值范围内的其他任意的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的固态菌剂中的活性组分还包括如第七方面所述的生物吸附剂。
第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的固态菌剂的制备方法，所述制备方法包括：将第三方面所述的液态菌剂经过干燥处理得到。例如可以采用喷雾干燥法制得。
第七方面，本发明提供一种吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的生物吸附剂，所述生物吸附剂中的活性组分包括第一方面所述的假中间布鲁氏菌的细胞壁和/或其胞外多聚物。
所述假中间布鲁氏菌的细胞壁多聚物示例性地可以采用如下方法制得：
将假中间布鲁氏菌ASAG-D25接种于LB培养基中，在温度25-35℃、100-400rpm转速、通风比1:(0.5-1.5)，培养18-20小时，活细胞数量至少达到107CFU/mL，在110-130℃的温度下对ASAG-D25细胞进行裂解，裂解后，将得到的细胞壁离心洗涤数次，即得。
所述假中间布鲁氏菌的胞外多聚物示例性地可以采用如下方法制得：
将假中间布鲁氏菌ASAG-D25的发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/4-1/2，用1-3倍体积的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经75％乙醇洗涤2-3次，烘干后即得。
优选地，所述吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的生物吸附剂中的活性组分还包括如第三方面所述的液态菌剂和/或如第五方面所述的固态菌剂。
第八方面，本发明提供如第三方面所述的液态菌剂或第五方面所述的固态菌剂在吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1中的应用。
优选地，所述应用的方法包括：
将液态菌剂或固体菌剂与受呕吐毒素和/或黄曲霉素B1污染的农产品或农副产品混合均匀即可。
所述农产品包括但不限于谷物、饲料原料、饲料原料打工而成的饲料。
优选地，所述谷物包括但不限于玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁。
优选地，所述饲料原料包括但不限于玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁。
所述农副产品包括但不限于酒糟、玉米浆、喷浆玉米皮、果渣、淀粉渣。
优选地，所述液态菌剂与所述农产品或农副产品的质量比为1:3-3:1，例如1:3、1:2、1:1、2:1、3:1等；所述液态菌剂的活细胞数量大于10 7CFU/mL，例如10 7CFU/mL、2×107CFU/mL、3×10 7CFU/mL、5×10 7CFU/mL、10 8CFU/mL、5×10 8CFU/mL、10 9CFU/mL等；上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述固态菌剂与所述农产品或农副产品的质量比为(1-10):100，例如1:100、2:100、3:100、4:100、5:100、6:100、7:100、8:100、9:100、10:100等；所述固态菌剂的活细胞数量大于10 8CFU/g，例如10 8CFU/g、2×10 8CFU/g、3×108CFU/g、5×10 8CFU/g、109CFU/g、5×10 9CFU/g、10 10CFU/g等；上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的假中间布鲁氏菌具有高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的特性，且解吸附率很低，其可用于粮食、农副产品及饲料中呕吐毒素/黄曲霉素B1消减，具有生产使用成本低、简单、易操作、安全、高效等优点，对于解决饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产和动物产品的食品安全、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。
附图说明
图1是ASAG-D25菌体及其细胞壁多聚物在DON浓度为10μg/mL的pH4.5无机盐培养基中呕吐毒素吸附效果的结果统计图；
图2是ASAG-D25菌体及其细胞壁多聚物在DON浓度为10μg/mL的pH7无机盐培养基中呕吐毒素吸附效果的结果统计图；
图3是ASAG-D25菌体及其细胞壁多聚物在AFB1浓度为0.5μg/mL的pH4和pH7无机盐培养基中黄曲霉素B1吸附效果的结果统计图；
图4是ASAG-D25液体菌剂对玉米浆中呕吐毒素吸附效果的结果统计图；
图5是ASAG-D25液体菌剂对玉米浆中黄曲霉素B1吸附效果的结果统计图；
图6是ASAG-D25固体菌剂对玉米浆中呕吐毒素吸附效果的结果统计图；
图7是ASAG-D25固体菌剂对玉米浆中黄曲霉素B1吸附效果的结果统计图；
图8是ASAG-D25生物吸附剂对玉米浆中呕吐毒素吸附效果的结果统计图；
图9是ASAG-D25生物吸附剂对玉米浆中黄曲霉素B1吸附效果的结果统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所涉及的LB液体培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，余量为水。
下述实施例中所涉及的MM培养基的配方为：Na2HPO4 2g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4.7H2O 0.03g/L，NH4Cl 0.53g/L，余量为水。
实施例1
本实施例提供一种高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌，其分离和筛选方法如下：
(1)从江苏徐州地区种植小麦土壤采来的土样，取5g加50mL无菌水，30℃摇床震荡1h后，用无菌水依次稀释成10-1-10-8倍，取10-7样品涂布在LB琼脂平板(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，121℃灭菌20min)上进行培养24h后，挑取单菌落于LB试管斜面，培养48h后保存于4℃冰箱备用；
(2)挑取生长分离程度良好且菌落形态特征、颜色不同的菌落，在呕吐毒素为10μg/mL的无机盐培养基(又称MM培养基，组分如下：Na2HPO4 2g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.7H2O0.03g/L，NH4Cl 0.53g/L，121℃灭菌20min)中进行脱毒试验；
(3)甲醇提取残留呕吐毒素并进行HPLC检测，验证各个纯培养物的呕吐毒素吸附效果，选取吸附效果最好的菌种，即为菌株ASAG-D25。挑取ASAG-D25单菌落于LB液体培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，121℃灭菌20min)中，培养至对数期中期时，用70％的甘油溶液(甘油:水＝1:1)与培养物等体积混合后置于-80℃保存。对其进行保藏，保藏信息如下：
所述假中间布鲁氏菌命名为假中间布鲁氏菌(Brucella pseudintermedia)ASAG-D25菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年7月15日，保藏编号为CGMCC No.22904，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行鉴定，方法如下：
对筛选到的假中间布鲁氏菌ASAG-D25菌株进行16Sr DNA分子鉴定，把测序结果在Genbank进行BLAST比对分析序列同源性，经过序列比对，该菌株的16S rDNA序列与Brucella pseudintermedia的序列相似性达99％以上，确定为假中间布鲁氏菌(Brucellapseudintermedia)。该菌株的16S rDNA序列如下：
TTAGCACAGCGCCTTCGGGTAAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTTTGGAGATTAGCTCACACTCGCGTGCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCTCGGCTTATCACCGGCAGTCCCCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCGATCCAGCCGAACTGAAGGAAAGTGTCTCCACTAACCGCGATCGGGATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGTTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGAAGAGTAAACTCCCCAACGGCTAACATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGACCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTTCCATACTCAAGACTAACAGTATCAAAGGCAGTTCCGGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTATTAGCCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTCCGGTTACCGTCATTATCTTCACCGGTGAAAGAGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCTCATCCATCACCGATAAATCTTTCACCTCTCGGTCGTATAGGGTATTAGCACAAGTTTCCCTGAGTTATTCCCTAGTGATGGGTAGATTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTCGTATTGCTACGCGCTCGACTG。
对筛选到的假中间布鲁氏菌ASAG-D25菌株进行生理、生化特征鉴定，其结果如表1所示：
表1
实施例3
本实施例对实施例1筛选得到的菌株及其细胞壁多聚物在无机盐培养基(Mineralmedium，以下简称“MM”)中的脱毒效果进行评价：
将活化后的ASAG-D25以1％的接种量接种至LB液体培养基中培养18h，取1mL菌悬液离心(细胞壁多聚物则需先将菌悬液在120℃的温度下裂解后，再离心获得)，收集菌体或细胞碎片加入含有10μg/mL呕吐毒素或0.5μg/mL黄曲霉素B1的10mL MM液体培养基(pH4或pH7)中，在200转/分的振荡条件下进行脱毒反应，定时取样检测，最终培养物中呕吐毒素(DON)和黄曲霉素(AFB1)B1的剩余含量经质谱检测。
结果如图1-图3所示，图1和图2中对照组为含有呕吐毒素或黄曲霉素B1的MM液体培养基，灭活处理组为细胞壁多聚物处理组，未灭活处理组为ASAG-D25菌株处理组；0h表示将ASAG-D25活细胞加入含有DON或AFB1的培养基中反应10min后的取样检测结果。图3中AFB1吸附率计算公式为(1-实验组AFB1含量/对照组AFB1含量)×100％，4M为pH4培养基中ASAG-D25灭活处理组在0h、12h、24h和36h对AFB1吸附率，4E为pH4培养基中ASAG-D25未灭活理组在0h、12h、24h和36h对AFB1吸附率，7M和7E则是在pH7条件下AFB1吸附率；0h表示将细胞壁及胞外多聚物加入含有DON或AFB1的培养基中反应10min后的取样检测结果。
然后将沉淀烘干，加入1mL甲醇，超声处理30min，检测甲醇溶液中呕吐毒素和黄曲霉素B1含量，测得呕吐毒素的解吸附率均不足1％，测得黄曲霉素B1的解吸附率均不足5％。
由图1-图3可知：在脱毒反应进行15min后，MM培养基中的呕吐毒素和黄曲霉素B1含量明显降低，呕吐毒素吸附率最高达到95％以上，黄曲霉素B1吸附率最高达到70％以上。通过烘干细胞壁及胞外多聚物后核算，1mg干重细胞壁多聚物可吸附15-20μg呕吐毒素，而对黄曲霉素B1的吸附量约为2μg。
实施例4
本实施例对实施例1筛选得到的菌株制得的液态菌剂在农产品中的脱毒效果进行评价：
制备ASAG-D25液态菌剂：
(1)菌种活化：将ASAG-D25接种于固体培养基(酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl 1％，琼脂粉1.6％，Ph 7.2～7.4，121℃下高温蒸汽灭菌20min)上，于30℃条件下培养24h，再接种于试管斜面上备用。
(2)种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基(80g/L玉米粉，80g/L淀粉，80g/L蔗糖，40g/L豆油，3g/L NaCl，5g/L KH2PO4，5g/L FeSO4，121℃下高温蒸汽灭菌20min)中，于30℃条件下培养至对数期，制得备用菌种；然后，用10L的种子罐，种子培养基投料量7L，投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的菌种以体积比3％的接种量接种入种子罐，搅拌速度为220转/分，培养温度30℃，无菌空气通入量为1:1(体积比)，约16-20小时培养至对数生长期，获得种子液。
(3)发酵培养：采用容积为1000L的生产罐，发酵培养基(马铃薯汁20％，(NH4)2SO40.8％，葡萄糖2％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.01％，121℃下高温蒸汽灭菌20min)投料量700L，在1.1kg/cm2的压力、121℃的温度下，进行高压湿热灭菌，灭菌后冷却30℃，将种子液按1％的接种量接种入发酵罐，发酵条件：无菌空气的通气量为1:1，搅拌速度为150转/分，培养温度30℃，在培养过程中取样并进行显微镜直接计数，当发酵液中活细胞数量达到109CFU/mL，发酵结束，形成ASAG-D25液态菌剂。
对吸附呕吐毒素和黄曲霉素B1能力的评价：
将制备的ASAG-D25液态菌剂进行稀释，稀释后的液体型菌株活细胞数量为107CFU/mL，按体积比1:1的配比添加至呕吐毒素或黄曲霉素B1污染的玉米浆(毒素干基含量分别约为11000μg/kg和200μg/kg)中作为试验组，无菌发酵培养基以同样的配比添加至呕吐毒素或黄曲霉素B1污染的玉米浆中作为对照组，混合均匀后于30℃的温度下反应半小时后，从对照组和试验组准确称量100mL样品烘干、粉碎后取5g于离心管中，加入25ml 50％的甲醇至脱毒样品中，振荡使毒素充分抽提，经玻璃纤维滤纸过滤，取上清；用呕吐毒素检测试剂盒(Romer公司)检测呕吐毒素含量，结果如图4-图5所示。
图4-图5结果表明：ASAG-D25液态菌剂对呕吐毒素和黄曲霉素B1吸附率分别约为90％和75％，而对照组中呕吐毒素和黄曲霉素B1无显著降低。
实施例5
本实施例对实施例1筛选得到的菌株制得的固态菌剂在农产品中的脱毒效果进行评价：
制备ASAG-D25固态菌剂：
将实施例3制得的ASAG-D25液态菌剂中加入硅藻土和粘结剂(糊精)，添加量分别为400g/L和100g/L，然后将混合物在造粒机上过16目筛造粒，再用60℃热空气烘干，直至水分降至5％左右，即得固态菌剂，菌剂中活菌数量为108CFU/g。
对吸附呕吐毒素和黄曲霉素B1能力的评价：
将制备得到的ASAG-D25固态菌剂按照3％、5％、10％的比例添加到呕吐毒素或黄曲霉素B1污染的玉米浆(毒素干基含量分别约为12000μg/kg和42μg/kg)中作为试验组，硅藻土-糊精(以4:1比例混合)混合物同样以3％、5％、10％添加至呕吐毒素或黄曲霉素B1污染的玉米浆中作为对照组，将对照组和试验组均按1:1的比例加入无菌水，混合均匀后于30℃下发酵48小时，从对照组和试验组准确称量100mL样品烘干、粉碎后取5g于离心管中，加入25mL 50％的甲醇至脱毒样品中，振荡使毒素充分抽提，振荡使毒素充分抽提，经玻璃纤维滤纸过滤，取上清；用呕吐毒素检测试剂盒(Romer公司)检测呕吐毒素含量，结果如图6-图7所示。
图6-图7结果表明：ASAG-D25固态菌剂对玉米浆中呕吐毒素和黄曲霉素B1吸附率分别约为90％和70％，而对照组中呕吐毒素和黄曲霉素B1无显著降低。
实施例6
本实施例对实施例1筛选得到的菌株制得的生物吸附剂在农产品中的脱毒效果进行评价：
制备生物吸附剂：
(1)将假中间布鲁氏菌ASAG-D25接种于LB液体培养基中，在温度30℃、200rpm转速、通风比1:1，培养24h，细胞密度达到109CFU/mL，然后在120℃的温度下进行热裂解，将得到的细胞壁离心洗涤数次。
(2)将假中间布鲁氏菌ASAG-D25接种于LB培养基中，在温度30℃、200rpm转速、通风比1:1，培养18h，获种子培养液；所述种子培养液接种于多糖发酵培养基中，组分如下：马铃薯汁20％，(NH4)2SO4 0.8％，葡萄糖2％，CaCl20.02％，MgSO4 0.01％；菌体质量浓度为5％，摇床中发酵5天；发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/3，用2倍体积的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤3次，烘干后得胞外粗多糖产品。
(3)将制得的ASAG-D25细胞壁及胞外多糖进行等比例混合，得到所述生物吸附剂。
对吸附呕吐毒素和黄曲霉素B1能力的评价：
将制备得到的生物吸附剂按照3g/L、5g/L、10g/L的比例添加到呕吐毒素或黄曲霉素B1污染的玉米浆中作为试验组，玉米浆作为对照组，混合均匀后于30℃下反应0.5小时，从对照组和试验组准确称量100mL样品烘干、粉碎后取5g于离心管中，加入25mL 50％的甲醇至脱毒样品中，振荡使毒素充分抽提，振荡使毒素充分抽提，经玻璃纤维滤纸过滤，取上清；用呕吐毒素检测试剂盒(Romer公司)检测呕吐毒素含量，结果如图8-图9所示。
图8-图9结果表明：ASAG-D25细胞壁及胞外多糖对呕吐毒素和黄曲霉素B1吸附率最高达90％和75％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种高效吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家粮食和物资储备局科学研究院
<120> 一种吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌及其应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1332
<212> DNA
<213> 假中间布鲁氏菌ASAG-D25菌株
<400> 1
ttagcacagc gccttcgggt aaaaccaact cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg 60
cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc caacttcatg 120
cactcgagtt gcagagtgca atccgaactg agatggcttt tggagattag ctcacactcg 180
cgtgctcgct gcccactgtc accaccattg tagcacgtgt gtagcccagc ccgtaagggc 240
catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tctcggctta tcaccggcag tccccttaga 300
gtgcccaact gaatgctggc aactaagggc gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360
aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtctccgat ccagccgaac 420
tgaaggaaag tgtctccact aaccgcgatc gggatgtcaa gggctggtaa ggttctgcgc 480
gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 540
gttttaatct tgcgaccgta ctccccaggc ggaatgttta atgcgttagc tgcgccaccg 600
aagagtaaac tccccaacgg ctaacattca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660
aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagcgtcag taatggacca gtgagccgcc 720
ttcgccactg gtgttcctcc gaatatctac gaatttcacc tctacactcg gaattccact 780
cacctcttcc atactcaaga ctaacagtat caaaggcagt tccggggttg agccccggga 840
tttcacccct gacttattag cccgcctacg tgcgctttac gcccagtaaa tccgaacaac 900
gctagccccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt tagccggggc ttcttctccg 960
gttaccgtca ttatcttcac cggtgaaaga gctttacaac cctagggcct tcatcactca 1020
cgcggcatgg ctggatcagg cttgcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg 1080
taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggctgatc atcctctcag accagctatg 1140
gatcgtcgcc ttggtaggcc tttaccccac caactagcta atccaacgcg ggctcatcca 1200
tcaccgataa atctttcacc tctcggtcgt atagggtatt agcacaagtt tccctgagtt 1260
attccctagt gatgggtaga ttcccacgcg ttactcaccc gtctgccgct cgtattgcta 1320
cgcgctcgac tg 1332

Claims (15)

1.一种吸附呕吐毒素和黄曲霉毒素B1的假中间布鲁氏菌，其特征在于，所述假中间布鲁氏菌命名为假中间布鲁氏菌(Brucella pseudintermedia)ASAG-D25菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年7月15日，保藏编号为CGMCC No.22904，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的假中间布鲁氏菌在吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1中的应用。
3.一种吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的液态菌剂，其特征在于，所述液态菌剂中的活性组分包括权利要求1所述的假中间布鲁氏菌。
4.根据权利要求3所述的液态菌剂，其特征在于，所述液态菌剂中还含有吸附剂，所述吸附剂包括玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、碳酸钙或泥炭中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的液态菌剂，其特征在于，所述液态菌剂中的活性组分与吸附剂的质量比为1:(2-10)。
6.如权利要求3所述的液态菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：(1)将权利要求1所述的假中间布鲁氏菌活化后接种于种子培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；(2)将所述种子液接种于发酵培养基中，培养至稳定期，制得所述液态菌剂。
7.一种吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的固态菌剂，其特征在于，所述固态菌剂中的活性组分包括权利要求1所述的假中间布鲁氏菌。
8.根据权利要求7所述的固态菌剂，其特征在于，所述固态菌剂中还含有吸附剂，所述吸附剂包括玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、碳酸钙或泥炭中的任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求8所述的固态菌剂，其特征在于，所述固态菌剂中的活性组分与吸附剂的质量比为1:(2-10)。
10.如权利要求7所述的固态菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将权利要求3所述的液态菌剂经过干燥处理得到。
11.一种吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1的生物吸附剂，其特征在于，所述生物吸附剂中的活性组分包括权利要求1所述的假中间布鲁氏菌的细胞壁和/或其胞外多聚物。
12.如权利要求3所述的液态菌剂或权利要求7所述的固态菌剂在吸附呕吐毒素和/或黄曲霉素B1中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：
将液态菌剂或固体菌剂与受呕吐毒素和/或黄曲霉素B1污染的农产品混合均匀即可。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述液态菌剂与所述农产品的质量比为1:3-3:1，所述液态菌剂的活细胞数量大于10 7CFU/mL。
15.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述固态菌剂与所述农产品的质量比为(1-10):100，所述固态菌剂的活细胞数量大于10 8CFU/g。
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