CN109234196A - 一种降解伏马毒素b1的混合菌群及其粗酶制剂 - Google Patents

一种降解伏马毒素b1的混合菌群及其粗酶制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降解伏马毒素B1的混合菌群及其粗酶制剂。本发明的降解伏马毒素B1的混合菌群，包括如下成分：假单胞菌属(Pseudomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)，其总有效活菌数占混合菌群总数量的90％以上。本发明的降解伏马毒素B1的混合菌群在含蔗糖的MM培养基中扩增培养，离心获得的菌体超声破壁后，上清液冻干即获得粗酶制剂。本发明获得的降解伏马毒素B1的混合菌群及其粗酶制剂在24h内对伏马毒素B1降解率均达90％以上。该混合菌群及其粗酶制剂具有发酵简单、生产成本低等特点，对饲料中伏马毒素B1的脱毒具有广阔的应用前景。

Description

一种降解伏马毒素B1的混合菌群及其粗酶制剂
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说涉及一种降解伏马毒素B1的混合菌群及其粗酶制剂。
背景技术
伏马毒素(FB)是由串珠镰刀菌和轮枝镰刀菌等产生的一类有毒次级代谢产物。目前，已知的FB有11种，其中以伏马毒素B1(FB1)污染范围最广、毒性最强，对人畜造成的健康危害最大。FB1可广泛污染饲料及其原料等。近年来调查表明我国饲料中FB1的污染率普遍超过90％，对畜牧业造成了不容忽视的危害。FB1不仅干扰植物正常生理功能，而且对畜禽具有各种特异性毒性作用，可引起马和兔的脑白质软化症、猪肺水肿，对啮齿类动物具有肾毒性和肝毒性等。另外，研究表明FB1与人类食道癌的发生有潜在关联性，国际癌症研究机构(IARC)已将其列为2B类致癌物。伏马毒素的全球污染性和高危害性引起了人们广泛关注，因此如何去除或降低FB1对人和动物造成的健康危害具有重要意义。
目前，伏马毒素常用脱毒方法包括化学法、物理法、吸附法和微生物脱毒法。传统的化学法(氨气、臭氧、异硫氰酸盐及肉桂油处理法)可降低饲料或谷物中FB含量，但该法易引入新的有害物质，可破坏营养成分，增加饲料和谷物的安全隐患；物理法(拣选与漂洗、热处理、脱壳及研磨)也可去除一定量FB，但该法条件要求高、可改变食品品质，其应用性受到限制。吸附脱毒法是当前一种最有效的去除真菌毒素的方法。研究发现饲料中添加消胆胺、AdiDetoxTM等吸附剂可显著降低FB对大鼠的毒性作用。然而，吸附法具有特异性不高，易吸附饲料中营养成分等缺点。微生物脱毒法可通过酶促反应将毒素转化为低毒或无毒的产物，或者通过细胞壁吸附作用达到去除毒素的目的。与化学和物理法相比，微生物法具有专一性强、处理条件温和、营养成分损失少、对原料感官性和适口性影响小、易于产业化等优点，已成为真菌毒素脱毒主要研究方向，被认为有良好的开发和应用前景。大多数微生物对伏马毒素的降解归根结底是通过其产生的关键酶来实现的。当前，国内外已报道的对伏马毒素B1有降解效果的菌株仅有3株，分别属于鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、斯平尼弗外瓶柄霉(Exophialaspinifera)和喙枝孢属(Rhinocladiella atrovirens)。但是，受限于生产工艺等原因并未在实际生产中得到应用。
发明内容
本发明的目的首先在于提供一种降解伏马毒素B1的混合菌群，该菌群包括如下成分：
假单胞菌属(Pseudomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)；这三种菌属占混合菌群总数量的90％以上；
进一步的，假单胞菌属(Pseudomonas)占混合菌群总数量的85％以上。
本发明的上述降解伏马毒素B1的混合菌群，是通过如下方法制备得到的：
(1)采集江西省草菇生产基地的菌渣，4℃条件下保存备用；
(2)称取菌渣样品溶解于蒸馏水，在37℃条件下振荡12h；收集振荡液；
(3)筛选可降解伏马毒素B1的菌群：使用含伏马毒素B1作为唯一碳源的无机盐培养基(MM培养基)进行筛选驯化培养，调节PH至7.0；将驯化筛选的菌群转移至MM培养基中，再次驯化培养，反复10次；将驯化所得的菌液在MM固体培养基中划线分离，在28℃条件下培养后，挑取单菌落至MM培养基中培养48h，获得一种降解伏马毒素B1的混合菌群；
其中所述的无机盐培养基配方(MM培养基)为：K2HPO4(2.5g/L)、KH2PO4(2.5g/L)、(NH4)2HPO4(1.0g/L)、MgSO4·7H2O(0.2g/L)、FeSO4(0.01g/L)、MnSO4.7H2O(0.004g)，
MM培养基在使用时可根据需要添加不同浓度的伏马毒素B1。
MM培养基的PH为7时，混合菌群对伏马毒素B1的降解效率最高。
对于获得的混合菌群进行16SrDNA宏基因组分析，结果表明混合菌群主要包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)，其总有效活菌数占混合菌群总数量的90％以上。其中，假单胞菌属菌株占混合菌群总数量的85％以上。
本发明还提供了上述降解伏马毒素B1的混合菌群的粗酶制剂，其是通过如下方法制备得到的：
将获得的混合菌群接种至含1％蔗糖的MM培养基中(10g蔗糖溶解于1L MM培养基，调节PH至7，在121℃条件下高压灭菌30min)，在28℃下振荡培养48h，离心后收集菌体并经过反复清洗，然后加入PBS缓冲溶液进行超声破碎提取；收集上清液置于冷冻干燥机中冻干，得到混合菌群的粗酶制剂。
将混合菌群或粗酶制剂接种至含50mg/L伏马毒素B1的MM培养基(pH值为6-8，优选为PH为7)，在28℃条件下200rpm振荡培养48h；利用LC-MS/MS测定培养液中伏马毒素B1的浓度，根据培养液中伏马毒素B1的含量，判断混合菌群或粗酶制剂对伏马毒素B1的降解效率。结果表明：在48h内，混合菌群或粗酶制剂对50mg/L伏马毒素B1的降解率达90％以上。
本发明的一种降解伏马毒素B1的混合菌群及其粗酶制剂具有如下有益效果：
本发明公开的降解伏马毒素B1的混合菌群，以假单胞菌属菌株(Pseudomonadaceae)为主要成分，在24h内对伏马毒素B1降解率高达90％以上。同时，通过超声波破碎法获得的混合菌群粗酶制剂，对该毒素也具有较高的降解效率(90％以上)。本发明对饲料中真菌毒素的脱毒具有极高的应用价值。
本发明公开的降解伏马毒素B1的混合菌群及其粗酶制剂为国内外首次报道的可降解伏马毒素B1的菌群/酶制剂。同时，通过简单的培养基和发酵方法即可获得大量的有效菌群用于制备可降解伏马毒素B1的粗酶制剂，发酵方法简单且生产成本低。另外，与化学和物理法相比，微生物法具有专一性强、处理条件温和、营养成分损失少、对原料感官性和适口性影响小的优点，对于防控饲料中伏马毒素B1对畜牧业造成的危害具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明
图1为混合菌群中主要菌群结构分析
图2为混合菌群在不同PH值条件下对伏马毒素B1的降解效率
图3为粗酶制剂在不同PH条件下对伏马毒素B1的降解效率
具体实施方式
下面结合实施例对本发明实施过程作详尽描述。特别需要指出的是所有类似的替换或更改，均被视为包括在本发明。
下列实施例中所用原料或制剂的来源：
本实验所用的样品来自江西省广昌县延陵食用菌种植专业合作社的菌渣，将采集的菌渣贮存于已灭菌的透明封口袋内，4℃冰箱中保存备用。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
实施例1：降解伏马毒素B1的混合菌群的分离筛选
配制MM培养基：
称取2.5g K2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0g(NH4)2HPO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4，0.004g MnSO4·7H2O置于容量瓶中，加水定容至1L，调节PH至7。在121℃条件下高压灭菌30min。
称取10g菌渣样品溶解于100mL灭菌的蒸馏水，在37℃条件下振荡12h。取1mL振荡液稀释至10mL，取100μL稀释液接种至2mL含50mg/L伏马毒素B1的MM培养基(灭菌)，在28℃条件下200rpm振荡培养7d。利用LC-MS/MS测定培养液中伏马毒素B1的含量。结果表明：在7d培养期内，该培养液对伏马毒素B1的降解力达99％以上。进一步，取100μL该培养液加入至2mL含100mg/L伏马毒素B1的MM培养基(灭菌)中，同上述步骤，反复富集培养9次，获得富集菌液。
将上述获得的富集菌液用灭菌水进行梯度稀释(10-1和10-2)，涂布或划线在无机盐琼脂培养基上(无机盐培养基加热溶解后加入伏马毒素B1，配置成终浓度20μg/mL，倒平板)，在28℃条件下倒置培养，待有菌落长出后，挑取在固体培养基平板上生长状况良好的单菌落接种至含20μg/mL伏马毒素B1的MM培养基。在28℃条件下200rpm振荡培养7d，利用LC-MS/MS测定培养基中伏马毒素B1的浓度，评价挑取的不同菌落对伏马毒素B1降解能力。结果表明：挑取的1个单菌落对伏马毒素B1降解率达96％。将该菌落作为分离获得的混合菌群，溶解在20％甘油溶液中保存在-80℃下。
实施例2：混合菌群的群落结构分析
取200μL实例1中所述的混合菌群接种至含50mg/L伏马毒素B1的MM培养基中，在28℃条件下200rpm振荡培养24h，在15000rpm条件下离心10min，菌体保存在-20℃条件下。
按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Ki试剂盒(德国Qiagen公司)提取菌体中总DNA，并进行电泳鉴定成功得到细菌DNA。利用高通量测序的方法，采用引物926F(5’-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3’)和518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)扩增细菌16S rDNA的V4-V5区片段(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)有限公司进行Illumina双末端测序分析。，高通量测序所得的序列数据采用FLASH和Fastq进行质量控制，再通过Qiime软件流程进行校正，去除嵌合体及靶向区域外的序列，然后进行OUT聚类分析，采用RPD classifier软件贝叶斯算法对97％的相似度水平的OUT代表性序列进行分类学分析，统计各个样品之间的群落组成，分类可信度采用Bootstrap方法估算。
通过对获得的混合菌群进行16SrDNA分析发现：混合菌群以假单胞菌属(Pseudomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas)和鞘氨醇杆菌属(sphingobacterium)为主，分别占总量的86.43％、5.57％和1.8％，总共占总菌数的93.8％(各菌属的占比分布见图1)。
同时，本试验利用抗生素筛选法明确对伏马毒素B1起主要降解作用的菌群。考察在接种混合菌群的MM培养基中加入不同浓度水平的头孢他啶(法国A2S公司)(0、1、10、50和100ppm)后菌群结构的变化。通过16S rDNA宏基因组测序分析发现：未加头孢他啶处理组中假单胞菌属(Pseudomonas)的数量占总菌的约85％；1ppm头孢他啶处理组中假单胞菌属(Pseudomonas)的数量占总量约48％；大于1ppm头孢他啶处理组中假单胞菌属(Pseudomonas)的数量约占20％-35％。在48h内，0处理组对伏马毒素B1降解率为92％；大于1ppm头孢处理组对伏马毒素B1降解率低于30％，表明对伏马毒素B1降解起主要作用的菌属为假单胞菌属。
实施例3：混合菌群对伏马毒素B1的降解效率
考察混合菌群在不同培养基及培养条件下对伏马毒素B1的降解能力。
(1)混合菌群在不同培养基条件下对FB1的降解效率
配置不同的培养基，具体如下：①无机盐培养基(MM)：称取2.5g K2HPO4、2.5gKH2PO4、1.0g(NH4)2HPO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4，0.004g MnSO4·7H2O置于容量瓶中，加水定容至1L，调节PH至7。在121℃条件下高压灭菌30min；②LB培养基：称取5g酵母提取物、10g蛋白胨、10g NaCl置于容量瓶中，加水定容至1L，调节PH至7，在121℃条件下高压灭菌30min；③营养肉汤培养基(NB)：称取10.0g蛋白胨、3.0g牛肉粉、5.0g NaCl，溶解于1L蒸馏水中，在121℃条件下高压灭菌30min；④含1％葡萄糖的MM培养基(MM+PT)：称取10g葡萄糖溶解于1L MM培养基，调节PH至7，在121℃条件下高压灭菌30min；⑤含1％蔗糖的MM培养基(MM+GT)：称取10g蔗糖溶解于1L MM培养基，调节PH至7，在121℃条件下高压灭菌30min；⑥含0.5％蛋白胨的MM培养基：称取5g蛋白胨溶解于1L MM培养基，调节PH至7。在121℃条件下高压灭菌30min。
取100μL实施例1中的混合菌群接种至2mL含50mg/L伏马毒素B1的不同培养基中，在28℃条件下200rpm振荡培养48h。然后，取100μL培养液加入等体积乙腈，充分振摇后，超声提取15min，利用LC-MS/MS测定不同培养液中伏马毒素B1的含量，评价混合菌群在不同培养基中对伏马毒素B1的降解能力。结果表明：混合菌群在MM培养基中对伏马毒素B1降解率为93％，在含有蔗糖或葡萄糖的MM培养基中降解率在60-80％之间，在其他培养基中降解率均小于50％。因此，后续试验均采用无机盐培养基进行降解效率的研究。
(2)混合菌群在不同pH条件下对伏马毒素B1降解效率
利用0.1M NaOH溶液或HCl溶液调节MM培养基的PH值，分别为2、4、5、7、8、9和10。将实例1中的混合菌群接种至含有10ppm伏马毒素B1的MM培养基中，在28℃条件下振荡培养，分别于24h和48h收集培养液。取100μL培养液加入等体积乙腈，充分振摇后，超声提取15min，利用LC-MS/MS测定不同培养液中伏马毒素B1的含量，从而评价培养基的PH值对伏马毒素B1降解效率的影响。如图2所示，在PH＝7条件下，12h内混合菌群对伏马毒素B1的降解率达95％；在24h内对伏马毒素B1降解率达100％。同时，在酸性或碱性PH条件下，混合菌群对伏马毒素B1的降解率仅为30％以下。通过本试验得出：在PH＝7条件下混合菌群降解效率最高。
实施例4：粗酶制剂的制备及其对伏马毒素B1的降解效率
取适量实例1中的混合菌群接种至100mL含1％蔗糖的MM培养基中(10g蔗糖溶解于1L MM培养基，调节PH至7，在121℃条件下高压灭菌30min)中，在28℃条件下200rpm振荡培养48h。在4500rpm下离心10min后，菌体沉淀使用灭菌后的50mM PBS缓冲溶液反复冲洗2次。在4500rpm下离心10min后，菌体溶解于2mL PBS缓冲溶液中，置于超声破碎仪中提取30min。在4℃条件下4500rpm离心后，上清液冻干后即为混合菌群的粗酶制剂。将粗酶制剂溶解于1mL PBS缓冲溶液中，通过考马斯亮蓝法进行蛋白定量。
使用0.1M NaOH溶液或HCl溶液调节MM培养基的PH值，分别为2、4、6、7、8、9和10。取适量粗酶制剂至含有10ppm伏马毒素B1的MM培养基中，在28℃条件下振荡培养，分别于24h和48h收集培养液。取100μL培养液加入等体积乙腈，充分振摇后，超声提取15min，利用LC-MS/MS测定不同培养液中伏马毒素B1的含量，从而评价培养基的PH值对伏马毒素B1降解效率的影响。如图3所示，当PH在6-8范围时，粗酶制剂对伏马毒素B1降解率在85％-100％之间；PH为7时，粗酶制剂对伏马毒素B1的降解率超过95％；当PH在2-4之间时，对伏马毒素B1降解率在65％以下；当PH在9-10之间时，对伏马毒素B1降解率在68-78％范围内。

Claims (4)

1.一种降解伏马毒素B1的混合菌群，其特征在于该菌群包括如下成分：
假单胞菌属Pseudomonas、丛毛单胞菌属Comamonas和鞘氨醇杆菌属sphingobacterium；这三种菌属占混合菌群总数量的90％以上。
2.根据权利要求1所述的降解伏马毒素B1的混合菌群，其特征在于其中假单胞菌属Pseudomonas占混合菌群总数量的85％以上。
3.一种制备权利要求1或2所述降解伏马毒素B1的混合菌群的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)采集草菇生产基地的菌渣，4℃条件下保存备用；
(2)称取菌渣样品溶解于蒸馏水，在37℃条件下振荡12h；收集振荡液；
(3)筛选可降解伏马毒素B1的菌群：使用含伏马毒素B1的MM培养基进行筛选驯化培养，调节PH至7.0；将驯化筛选的菌群转移至MM培养基中，再次驯化培养，反复10次；将驯化所得的菌液在MM固体培养基中划线分离，在28℃条件下培养后，挑取单菌落至MM培养基中培养48h，获得一种降解伏马毒素B1的混合菌群；
其中所述的MM培养基为：K2HPO4 2.5g/L、KH2PO4 2.5g/L、(NH4)2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、FeSO4 0.01g/L、MnSO4.7H2O 0.004g。
4.一种权利要求1或2的降解伏马毒素B1的混合菌群的粗酶制剂，其特征在于其是通过如下方法制备得到的：
将权利要求1或2的混合菌群接种至含1％蔗糖的MM培养基中，PH为6-8，28℃下振荡培养48h，离心后收集菌体并经过清洗，然后加入PBS缓冲溶液进行超声破碎提取；收集上清液置于冷冻干燥机中冻干，得到混合菌群的粗酶制剂。
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