CN113999778A - 一种深绿木霉微菌核及其制剂的制备方法和应用 - Google Patents

一种深绿木霉微菌核及其制剂的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种深绿木霉微菌核及其制剂的制备方法和应用。制备方法包括以下步骤：深绿木霉分生孢子悬液的制备；深绿木霉液体深层培养诱导产生微菌核；微菌核的收获；微菌核与载体混合后干燥处理，制备干粉制剂。该方法获取的木霉微菌核具有耐高温、抗紫外线、耐存储等优点，可以大规模液体发酵生产，工艺简单、成本低，可用于含木霉生物有机肥、微生物菌剂等制剂产品的制备，对小麦茎基腐病具有较好的防治作用。

Description

一种深绿木霉微菌核及其制剂的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种深绿木霉微菌核及其制剂的制备方法和应用。
背景技术
木霉菌是一种重要的生防真菌，已广泛应用于农业生产中植物病原真菌的生物防治，木霉菌可以直接拮抗病原菌，也可以诱导植物抗性抵抗病原菌侵袭，同时，多数木霉菌还具有促进植物生长的功能，是具有巨大应用前景的生防菌。当前，木霉菌生物农药活性成分主要由霉的分生孢子组成，这些孢子通常是在湿润的固体发酵培养基上发酵产生的，发酵过程需要持续数周，然后再进行发酵后处理，不仅生产成本高，还受到多种限制因素制约，如劳动力成本高、质量控制差、发酵时间长、规模化困难、产品货架期短等。当前，液体培养研究主要集中在木霉厚垣孢子的生产上，但却存在发酵产量低，缺乏储存稳定性，或在土壤中的持久性较差等问题。
发明内容
本发明的目的在于为深绿木霉规模化生产提供一种液体发酵生产微菌核及其制剂的方法，应用该方法生产的深绿木霉微菌核制备的菌剂制剂生产成本低、产品贮存期长，同时该菌剂复水后菌丝能够快速复苏生长，并产生分生孢子，能够发挥与传统木霉菌剂一致的生防活性。
一方面，本发明提供了一种深绿木霉微菌核的制备方法，包括以下步骤：
（1）深绿木霉分生孢子悬液的制备；
（2）深绿木霉液体深层培养诱导产生微菌核：将步骤（1）制备的分生孢子悬液接种到诱导培养基中，25~30℃，200rpm震荡培养7~9天，得到深绿木霉微菌核发酵液；
（3）震荡培养完成后向微菌核发酵液中加入助滤剂，混匀后抽滤弃去上清，得到深绿木霉微菌核，暂存。
进一步的，深绿木霉为HB20111（Trichoderma atroviride），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2018年12月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16963，公开于公开号为CN110915822A的专利。
进一步的，所述步骤（2）中，分生孢子接种量为每100mL诱导培养基中接种106个孢子。
进一步的，所述步骤（2）中，诱导培养基成分为：KH2PO4 3.0~5.0g/L、CaCl2·2H2O0.5~1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4~0.8g/L、CoCl2·6H2O34~40mg/L、MnSO4·H2O 14~20mg/L、ZnSO4·7H2O 12~16mg/L；FeSO4·7H2O 0.1~0.4g/L；葡萄糖15~30g/L；酪素水解物2.0~3.0g/L。
进一步的，所述步骤（3）中，助滤剂为硅藻土，添加量为1%~5%(w/v)。
再一方面，本发明提供了一种深绿木霉微菌核制剂的制备方法，包括以下步骤：
取抽滤后获得的微菌核与载体混合后低温干燥处理，得到干燥的微菌核-载体混合物，然后再添加助剂均匀混合后即得到深绿木霉微菌核干粉制剂。
进一步的，所述载体为硅藻土、麦饭石、高岭土、淀粉和玉米皮粉中一种或几种组合；抽滤后的微菌核与载体的质量百分比为1：（10~20）。
进一步的，所述助剂为羧甲基纤维素钠、黄原胶、海藻酸钠中的一种或几种的组合，干燥的微菌核-载体混合物与助剂的质量百分比为1000:1~200:1。
进一步的，所述低温干燥采用沸腾干燥流化床，干燥温度为35~40℃，干燥至水份含量至5%以下，然后分装为袋装产品。
另一方面，本发明还提供了一种深绿木霉微菌核制剂在防治植物真菌病害中的应用。
本发明的有益效果在于：
1、本发明选用生物保藏号为CGMCC No.16963的深绿木霉HB20111，其具有拮抗多种植物病原真菌的功能，选用其发酵产生的微菌核作为活性成分用于对小麦茎基腐病的防治，具有较好的防治效果。
2、本发明制备的深绿木霉微菌核制剂抗逆性强，能够适应长期（30天）高温（30~40℃）、紫外线等不利贮存条件，货架期可达12个月以上。
3、本发明制备的深绿木霉微菌核制剂复水后菌丝可以快速复苏并产生分生孢子，实现在土壤和植物根际的大量繁殖，与植物病原菌争夺生态位，同时分泌抗菌物质抑制病原菌生长。
4、本发明制备的深绿木霉微菌核制剂，采用液体发酵工艺，发酵原料均为常见试剂易于获得，成本低，同时生产周期缩短5~7天，易于实现木霉菌的规模化生产，可以替代木霉分生孢子作为微生物菌剂的有效成分，用于新型木霉杀菌剂的工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的深绿木霉液体发酵诱导培养48 h的显微观察图。
图2为实施例1的深绿木霉液体发酵诱导培养120 h的显微观察图。
图3为实施例1的深绿木霉液体发酵诱导培养168 h的显微观察图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1深绿木霉液体发酵制备微菌核
（1）深绿木霉分生孢子悬液的制备
深绿木霉为HB20111（Trichoderma atroviride），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2018年12月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16963。
深绿木霉分生孢子采用固体发酵法大量获得，流程如下：从-80℃超低温冰箱保藏的深绿木霉保藏管挑取含分生孢子的木霉菌菌块，接种至PDA固体平板，28℃培养5天；选取PDA固体平板上生长旺盛的单菌落接种茄瓶，选用PDA培养基，28℃培养，菌龄5-10天，至菌丝与分生孢子丰满时收获。使用121℃灭菌20min的0.9%的生理盐水冲洗茄瓶表面，将新鲜孢子洗下后稀释至1×108孢子/mL备用。
（2）深绿木霉微菌核的诱导培养
诱导培养基的配方：KH2PO4 3.0~5.0g/L、CaCl2·2H2O 0.5~1.0g/L、MgSO4·7H2O0.4~0.8g/L、CoCl2·6H2O34~40mg/L、MnSO4·H2O 14~20mg/L、ZnSO4·7H2O 12~16mg/L；FeSO4·7H2O0.1~0.4g/L；葡萄糖15~30g/L；酪素水解物2.0~3.0g/L，去离子水配制；将液体培养液分别以200 mL的量分装到500 mL三角瓶中，调节pH 值为7.5，进行121℃高温高压灭菌30 min，冷却后接种。
液体发酵培养条件：将前述制备的深绿木霉分生孢子悬液按照1%的接种量接种到诱导培养基中，在24~28℃，150~180rpm条件下进行摇床培养，接种后每天观察诱导培养基中的微菌核产生状况。接种后振荡培养16 h后，深绿木霉分生孢子萌发形成菌丝，24~48 h后形成大量微型菌丝球，菌液颜色未见变化，如图1所示；培养72 h后菌悬液中的菌丝量继续增加，菌丝球继续增大并变致密，在光学显微镜下观察未见微菌核产生；培养120 h后，菌丝球变得更为致密，部分菌丝球边褐色，取样在显微镜下观察，可见部分微菌核休眠结构。微菌核呈灰褐色，边缘光滑，中间紧密，如图2所示；培养144h后，微菌核数量大量增加，其中少量的微菌核周围开始萌发菌丝，168 h后微菌核数量不再明显增加，部分微菌核四周形成细长的菌丝，如图3 所示。
实施例2液体发酵液中微菌核的计量
使用剪去头部的枪头（避免菌丝堵塞）从摇瓶中吸取1ml液体发酵样品测定微菌核浓度，进行两次1:10的连续稀释，得到1:100的稀释液，将100 μL稀释液液置于显微镜玻璃载玻片上，用特大的盖玻片（24×50 mm）盖上，用低倍（40×）光显微镜计数盖片下所有致密的微菌核，并计算它们每毫升的浓度。
深绿木霉微菌核的收获
按照实施例1方法液体发酵7天后培养基中产生大量形态良好的紧密菌丝的微菌核后，即可收获。收获时向诱导培养基中添加2.5% (w/v)硅藻土，并彻底混匀；然后将混合物倒在80或120目筛网上，流水冲洗，去除发酵液和菌丝成分，直到微菌核成为筛网上主要残留物。然后在布赫纳漏斗中放置1号Whatman定性滤纸，用去离子水湿润过滤器，然后抽真空，将微菌核-硅藻土混合物倒入布赫纳漏斗中，去除残留培养基。
培养基去除完毕后，取出滤饼(含水量约为75%)，手工或用食品加工机捣碎滤饼，在通风柜或干燥室中室温条件下干燥微菌核-硅藻土混合物过夜，当微菌核-硅藻土混合物的水分小于5%时，包装并在4℃下保存。
实施例3深绿木霉微菌核产孢能力测定
将实施例2中干燥处理的微菌核-硅藻土混合物10mg加无菌水100μL稀释后均匀涂布至水琼脂平板上，3个重复，25℃下静置培养，持续培养7 天后计数，向平板上加入含0.1％SDS的无菌水反复冲洗将分生孢子微菌核-硅藻土混合物上洗脱下来，并用移液器吸取每个平板上的所有液体，记录液体体积，振荡均匀后血球计数板显微计数测定洗脱液中分生孢子的浓度。分生孢子浓度乘以收集的液体体积，除以0.01，等于每克微菌核-硅藻土混合物产生的分生孢子量。结果显示深绿木霉微菌核-硅藻土混合物每毫克能够产生4.3×105个孢子。
实施例4 深绿木霉微菌核耐热能力测定
称取12份实施例2中干燥处理的微菌核-硅藻土混合物，每份0.1克，分别放入装有50 mL灭菌水的试管中，共12管，分成四组，每组3管，每组分别放入40℃、45℃、50℃、55℃的水浴锅中，每隔10min从试管中取出500μL的微菌核稀释溶液，均匀涂布在水琼脂平板上，共取4次，并以深绿木霉分生孢子作为对照。在25℃条件下恒温培养，在24 h时低倍（40×）光学显微镜下计数100个微菌核，测定每个处理的微菌核的萌发率。对照分生孢子则在高倍（400×）光学显微镜计数100个分生孢子，记录并计算孢子萌发率。
结果发现微菌核和分生孢子在40℃处理的萌发率与未进行热处理的萌发率无显著差异，均在85％以上。而微菌核在55℃处理的20 min后萌发率显著下降，为72.59％，40min处理后的微菌核萌发率在45.56％，而分生孢子则在10min处理时即表现出萌发率显著下降，为62.54％，40min处理的分生孢子萌发率仅为16.99％。说明微菌核具有比分生孢子更好的耐热性。
实施例5 深绿木霉微菌核抗紫外线能力测定
称取实施例2中干燥处理的微菌核-硅藻土混合物1 g，放入装有100 mL灭菌水的试管中，从中取出500μL微菌核稀释液均匀的涂布在水琼脂平板上，在UV-B紫外灯下50 cm处，照射0、1、2、3 h。紫外照射后的平板放置于25℃培养箱中避光培养24 h，并在低倍（40×）光学显微镜下计数100个微菌核，测定每个处理的微菌核的萌发率。实验重复3次，并以深绿木霉分生孢子作为对照。结果显示随着紫外线照射时间的增加，萌发率逐步降低，紫外照射1 h后，分生孢子的萌发率降为73.66％，而微菌核的萌发率为81.37％； 3h照射后，分生孢子的萌发率锐减为22.98％，而微菌核的萌发率为58.27％，说明了微菌核抗紫外能力优于分生孢子。
实施例6 深绿木霉微菌核室温贮存能力测定
将实施例2中干燥处理的微菌核-硅藻土混合物培养的微菌核密封放置在室温条件下，每隔三个月从中取部分微菌核-硅藻土混合物测定萌发率，具体步骤：将 10 mg干燥的木霉微菌核-硅藻土混合物加无菌水100μL稀释后均匀涂布至水琼脂平板上，每处理用3个水琼脂平板，25℃下培养48 h后用低倍（40×）光学显微镜下观察平板上100个左右木霉微菌核-硅藻土混合物的菌丝复苏情况。结果显示6个月的微菌核萌发率为90.46％，而放置1年的微菌核在48 h时萌发率为83.53％，可见深绿木霉微菌核具有较好的贮存效果。
实施例7 深绿木霉微菌核制剂的制备方法
将实施例2中收获的深绿木霉微菌核发酵液放入50 L塑料桶，加入2.5% (w/v)硅藻土，搅拌混匀，过滤除去发酵液，过滤获得的固体部分添加2~3倍质量的麦饭石混匀后加入流化床，在35℃条件下热风干燥至含水量≦5％，然后再加入5~8份载体，并加入0.1%~0.5%的黄原胶即获得干制深绿木霉微菌核制剂，最后分装为袋装产品。
实施例8深绿木霉微菌核制剂贮存与产孢能力
称取深绿木霉微菌核制剂10 g放入500mL三角瓶中（含100 mL无菌水和灭菌玻璃珠），摇床中振荡5 min，取100μL的稀释液液置于显微镜玻璃载玻片上，用特大的24×50 mm盖玻片盖上，用低倍（40×）光显微镜计数盖片下所有致密的微菌核，计算微菌核制剂中微菌核数量作为初始值。然后每隔一个月测定室温保藏的微菌核制剂中微菌核数量及萌发率（参考实施例4测定方法）和产孢能力，结果显示，在室温条件下，深绿木霉微菌核制剂保藏1年48 h萌发率大于80%，在复水条件下（参考实施例3方法）每克制剂能够产生7.2×105个孢子。
实施例9 深绿木霉微菌核制剂在土壤中的产孢能力
采用水琼脂平板测定自然条件土壤和无菌处理土壤中深绿木霉微菌核制剂的生存力和分生孢子产量。微菌核制剂和土壤按质量百分比100:1混合，按照实施例3方法测定产孢能力，将含有微菌核制剂的土壤样品在水琼脂培养基上培养7 天，每天观察菌丝突出或菌丝萌发情况。对无菌和非无菌土壤，菌丝分别在培养后3 天和5 天就开始生长，到第7天开始产分生孢子。其中接种在无菌土壤样品中微菌核制剂每克土壤可产8.9×105个分生孢子，而接种在非无菌(自然)土壤上的微菌核制剂每克土壤可产9.2×104个分生孢子。
实施例10深绿木霉微菌核制剂对小麦茎基腐病的防治试验
试验地位于德州市陵城区，试验地前茬为玉米，近年茎基腐病发生严重。采用本发明实施例7制备的深绿木霉微菌核制剂，播种前使用，菌剂用量按照每亩地2kg使用，将菌剂拌土至10kg均匀撒施于田块中，设置空白对照，为了消除其他因素影响，种植过程中处理组和空白对照组均不使用拌种剂处理和化学药剂。试验小区长8m，宽1.5m，面积12m2，每组处理3个重复。选择小麦品种为济麦22，为山东省主要栽培品种。
小麦茎基腐病调查方法参照Moya-Elizondo, E. A等病害分级标准。在播种后180天根据小麦第一个节间处褐变程度进行分级，0级无褐变，1级节间褐变占比0%~25%，2 级节间褐变占比25%~50%，3级节间褐变占比50%~75%和4级节间褐变占比75%~100%。病害严重程度(病情指数)=Σ（各级病株数×该病级代表数值）/（最高病级代表数值×调查总株数）×100%。
播种后220 天调查各小区白穗数，并根据白穗率计数微菌核制剂处理和对照的防治效果，具体结果如表1所示。防治效果计算方法：防治效果（%）＝［空白对照区病情指数（白穗率）－处理区病情指数（白穗率）］／空白对照区病情指数（白穗率）×100%。
表1-深绿木霉微菌核制剂对小麦茎基腐病的防治效果
Figure 8465DEST_PATH_IMAGE001
通过以上实例可以发现，本发明的深绿木霉微菌核可以使用液体深层发酵生产，便于规模化；同时获得微菌核具有良好的耐贮存性能，在室温条件下可以保存1年以上；微菌核干粉复水后萌发率高，能大量产分生孢子，在此基础上制备的微菌核制剂可以防治小麦茎基腐病，说明微菌核制剂具有良好的防病能力，可以用于生物有机肥料和微生物菌剂的生产应用。
尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种深绿木霉微菌核的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）深绿木霉分生孢子悬液的制备；
（2）深绿木霉液体深层培养诱导产生微菌核：将步骤（1）制备的分生孢子悬液接种到诱导培养基中，25~30℃，200rpm震荡培养7~9天，得到深绿木霉微菌核发酵液；
（3）震荡培养完成后向微菌核发酵液中加入助滤剂，混匀后抽滤弃去上清，得到深绿木霉微菌核，暂存。
2.如权利要求1所述的一种深绿木霉微菌核的制备方法，其特征在于，深绿木霉为HB20111（Trichoderma atroviride），保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间为2018年12月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.16963。
3.如权利要求1所述的一种深绿木霉微菌核的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，分生孢子接种量为每100mL诱导培养基中接种106个孢子。
4.如权利要求1所述的一种深绿木霉微菌核的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导培养基成分为：KH2PO4 3.0~5.0g/L、CaCl2·2H2O 0.5~1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.4~0.8g/L、CoCl2·6H2O34~40mg/L、MnSO4·H2O 14~20mg/L、ZnSO4·7H2O 12~16mg/L；FeSO4·7H2O0.1~0.4g/L；葡萄糖15~30g/L；酪素水解物2.0~3.0g/L。
5.如权利要求1所述的一种深绿木霉微菌核的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，助滤剂为硅藻土，添加量为1%~5%(w/v)。
6.一种深绿木霉微菌核制剂的制备方法，其特征在于，所述深绿木霉微菌核由权利要求1的制备方法制得，具体包括以下步骤：取抽滤后获得的微菌核与载体混合后低温干燥处理，得到干燥的微菌核-载体混合物，然后再添加助剂均匀混合后即得到深绿木霉微菌核干粉制剂。
7.如权利要求6所述的一种深绿木霉微菌核制剂的制备方法，其特征在于，所述载体为硅藻土、麦饭石、高岭土、淀粉和玉米皮粉中一种或几种组合；抽滤后的微菌核与载体的质量百分比为1：（10~20）。
8.如权利要求6所述的一种深绿木霉微菌核制剂的制备方法，其特征在于，所述助剂为羧甲基纤维素钠、黄原胶、海藻酸钠中的一种或几种的组合，干燥的微菌核-载体混合物与助剂的质量百分比为1000:1~200:1。
9.如权利要求6所述的一种深绿木霉微菌核制剂的制备方法，其特征在于，所述低温干燥采用沸腾干燥流化床，干燥温度为35~40℃，干燥至水份含量至5%以下，然后分装为袋装产品。
10.一种深绿木霉微菌核制剂在防治小麦茎基腐病中的应用，其特征在于，所述深绿木霉微菌核制剂由权利要求6的制备方法制得。
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