CN113980900A - 一种nk细胞无动物源培养基以及nk细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法，涉及细胞培养领域。该NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI‑1640为基础培养基、坚果提取液、单细胞藻类提取液、白介素‑2、白蛋白和抗生素，以每升所述RPMI‑1640基础培养基加入坚果提取液40～80ml、单细胞藻类提取液20～60ml、白介素‑2 30～80μg、白蛋白35～45g和抗生素8×105～106U。通过选取坚果和藻类进行提取，并将提取液加入基础培养基中，实现微量元素的供给，该方式微量元素的添加简单快捷。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。
体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。
但是血清、血浆中的成分复杂，同时存在代谢产生废弃物。专利标题为“无血清、无动物源成分、组分明确的培养基及其应用”，专利申请号“CN201910201406.9”，其中微量元素的添加方式为逐一配置，配置过程繁琐，容易配置出错。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法，解决了无动物源培养基微量元素添加繁琐的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基、坚果提取液、单细胞藻类提取液、白介素-2、白蛋白和抗生素，以每升所述RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液40～80ml、单细胞藻类提取液20～60ml、白介素-2 30～80μg、白蛋白35～45g和抗生素8×105～106U。
优选的，所述抗生素是青霉素或者链霉素中的一种。
优选的，所述坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比。
优选的，所述单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比。
优选的，所述坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，每3～5h进行搅拌一次，然后进行过滤，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
优选的，所述单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
优选的，所述培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次。
(三)有益效果
本发明提供了一种NK细胞无动物源培养基以及NK细胞的培养方法。具备以下有益效果：
本发明，从坚果和藻类获得提取液，不仅简化了微量元素的补充的问题，还可以补充了NK细胞增殖其它的营养物质
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明实施例提供一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基，且RPMI-1640采用无血清的类型，坚果提取液、单细胞藻类提取液，在细胞的增殖中需要到种类不同的微量元素，且微量元素的种类多，并且需要量小，微量元素的配置麻烦，且易于配置发生错误，故坚果提取液和单细胞藻类提取液，用于补充培养基中微量元素，同时操作简单，白介素-2，用于诱导NK细胞活性和增殖，白蛋白，提供类似血清的场景，抗生素，降低培养过程中，杂菌的滋生，以每升RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液40ml、单细胞藻类提取液60ml、白介素-2 30μg、白蛋白30g和抗生素8×105U。
抗生素是青霉素或者链霉素中的一种，坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比，坚果中的果仁中存储有植物生长的丰富的微量元素，单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比，藻类中也富含微量元素，同时也向培养基中补充组成细胞膜所需的磷酸酯，同时所选用的藻类均为对人体细胞无害。
坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，粉末状态的坚果，利于微量元素的浸出，每3～5h进行搅拌一次，促进微量元素的扩散，然后进行过滤，过滤的过程中，也需要去除其中的油脂，坚果中富含油脂，且该类油脂为大分子物质，不利于NK细胞的增殖，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，即在0.5～0.6个大气压下去除上清液中多余的水分，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，尽可能将藻类自身代谢物除去，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，所得的上清液澄清透明，无叶绿素的存在，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养，培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
实施例二：
本发明实施例提供一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基，且RPMI-1640采用无血清的类型，坚果提取液、单细胞藻类提取液，在细胞的增殖中需要到种类不同的微量元素，且微量元素的种类多，并且需要量小，微量元素的配置麻烦，且易于配置发生错误，故坚果提取液和单细胞藻类提取液，用于补充培养基中微量元素，同时操作简单，白介素-2，用于诱导NK细胞活性和增殖，白蛋白，提供类似血清的场景，抗生素，降低培养过程中，杂菌的滋生，以每升RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液60ml、单细胞藻类提取液40ml、白介素-2 65μg、白蛋白40g和抗生素9×105U。
抗生素是青霉素或者链霉素中的一种，坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比，坚果中的果仁中存储有植物生长的丰富的微量元素，单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比，藻类中也富含微量元素，同时也向培养基中补充组成细胞膜所需的磷酸酯，同时所选用的藻类均为对人体细胞无害。
坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，粉末状态的坚果，利于微量元素的浸出，每3～5h进行搅拌一次，促进微量元素的扩散，然后进行过滤，过滤的过程中，也需要去除其中的油脂，坚果中富含油脂，且该类油脂为大分子物质，不利于NK细胞的增殖，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，即在0.5～0.6个大气压下去除上清液中多余的水分，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，尽可能将藻类自身代谢物除去，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，所得的上清液澄清透明，无叶绿素的存在，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养，培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
实施例三：
本发明实施例提供一种NK细胞无动物源培养基，包括以RPMI-1640为基础培养基，且RPMI-1640采用无血清的类型，坚果提取液、单细胞藻类提取液，在细胞的增殖中需要到种类不同的微量元素，且微量元素的种类多，并且需要量小，微量元素的配置麻烦，且易于配置发生错误，故坚果提取液和单细胞藻类提取液，用于补充培养基中微量元素，同时操作简单，白介素-2，用于诱导NK细胞活性和增殖，白蛋白，提供类似血清的场景，抗生素，降低培养过程中，杂菌的滋生，以每升RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液80ml、单细胞藻类提取液20ml、白介素-2 80μg、白蛋白45g和抗生素106U。
抗生素是青霉素或者链霉素中的一种，坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比，坚果中的果仁中存储有植物生长的丰富的微量元素，单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比，藻类中也富含微量元素，同时也向培养基中补充组成细胞膜所需的磷酸酯，同时所选用的藻类均为对人体细胞无害。
坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，粉末状态的坚果，利于微量元素的浸出，每3～5h进行搅拌一次，促进微量元素的扩散，然后进行过滤，过滤的过程中，也需要去除其中的油脂，坚果中富含油脂，且该类油脂为大分子物质，不利于NK细胞的增殖，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，即在0.5～0.6个大气压下去除上清液中多余的水分，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，尽可能将藻类自身代谢物除去，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，所得的上清液澄清透明，无叶绿素的存在，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
根据一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养，培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
实施例四：
对实施例一至实施例三所制备的培养基进行培养，并设置对比组，对比组中的组分为将原先的坚果提取液、单细胞藻类提取液等量替换成胎牛血清，具体实验结果如下表：
从上表得出，施例一至实施例三所制备的培养基培养NK细胞，培养效果并不落于对比组，且有一定程度优于对比组。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于，包括以RPMI-1640为基础培养基、坚果提取液、单细胞藻类提取液、白介素-2、白蛋白和抗生素，以每升所述RPMI-1640基础培养基加入坚果提取液40～80ml、单细胞藻类提取液20～60ml、白介素-2 30～80μg、白蛋白35～45g和抗生素8×105～106U。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述抗生素是青霉素或者链霉素中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述坚果提取液采用的坚果为核桃、杏仁、松仁、板栗、葵花子中的一种或多种，且任意质量配比。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述单细胞藻类提取液所用的藻类为蓝藻、绿藻、金藻、裸藻中的一种或多种，且任意质量配比。
5.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述坚果提取液的制备方法为：选取50g坚果研磨成粉末，并使用200目筛网筛分，接着以200ml的去离子水常温浸泡24～36h，每3～5h进行搅拌一次，然后进行过滤，将所获得的滤液加入去离子水增容至300ml，再采用3000r/min及以上的转速离心处理10min，并获取150ml的上清液，然后进行常温低压的方式浓缩至100ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
6.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基，其特征在于：所述单细胞藻类提取液的制备方法为：将藻类置于生理盐水中，外源生理盐水以50ml/min匀速注入藻类所在的生理盐水进行更新，持续30～60min，过滤获得沥水湿重藻类15g，接着将15g藻类转移至250ml的去离子水，等待藻类吸水涨破后，进行过滤，所得滤液经过4000r/min及以上的转速离心处理15min，并获取上清液80ml，最后密封浓缩液在120℃、1.2个大气压下灭菌20min，自然冷却后备用。
7.根据权利要求1所述的一种NK细胞无动物源培养基提出的NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下内容：
步骤一：采用自体外周血并离心分离，获得NK细胞；
步骤二：转移NK细胞至20ml培养基中，在培养箱中培养；
步骤三：从培养的第三天起，每天加入2T-1ml培养基，T为培养的天数。
8.根据权利要求7所述的NK细胞的培养方法，其特征在于：所述培养箱中的温度控制36.5℃，气氛组成为20％的氧气、5％的二氧化碳和75％的氮气，每一天更新一次。
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