CN113957021B - 一种具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌grx401及其应用 - Google Patents
一种具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌grx401及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌grx401及其应用,植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)grx401已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC NO.23544。本发明所述植物乳杆菌grx401可用于制备含有耐消化应激及高肠道黏附乳酸菌的发酵乳、发酵乳饮料及乳酸菌固体饮料。本发明菌株来源于广西巴马长寿人群肠道,探究了菌株的耐消化应激及黏附肠道黏蛋白和肠上皮Caco‑2细胞的能力,并研究了菌株的耐药性及其在唾液‑胃液‑肠液应激下黏附能力的变化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌grx401及其应用。
背景技术
乳酸菌作为人体肠道中的重要益生菌,不仅能够调节机体肠道的微生态平衡,还具有提高免疫、抗氧化以等益生功能。而乳酸菌以大于106CFU/mL的活菌数到达并黏附于肠道是其发挥益生作用的前提;乳酸菌在到达肠道前,需经过口腔、胃及肠道等一系列的消化应激,口腔中的溶菌酶能够通过水解N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸来破坏乳酸菌菌体的细胞壁结构,胃中的酸性环境(pH 2.0-5.0)、胃蛋白酶等会导致菌体细胞中维持正常生理功能的蛋白发生变性,而肠道中的胆盐(0.1%-0.3%)、胰酶(0.1%)等也会导致菌体的损伤甚至死亡。
乳酸菌在肠道上的黏附有助于延长其在肠道中的停留时间,加强其与肠上皮细胞间的信息交流,促进菌株通过调节肠道微生物群及其代谢产物来改善机体的健康。而口腔、胃及肠道等一系列的不良环境同样会对菌株的肠道黏附能力产生较大的影响。因此,在依次经过唾液-胃液-肠液后具有较强的耐消化应激以及良好的肠道黏附能力是筛选益生乳酸菌的重要标准。
发明内容
本发明目的是针对上述问题,提供一种具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌grx401及其应用。
本发明的目的是这样实现的:一株具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)grx401,已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC NO.23544。
一株具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)grx401,耐药性较低,且肠道黏附能力在经过消化应激后无显著性变化。
一株具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)grx401在发酵乳、发酵乳饮料及乳酸菌固体饮料食品生产的应用。
通过本发明,提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),具有耐消化应激及高肠道黏附能力,已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC NO.23544。本发明的植物乳杆菌grx401通过以下步骤获得:
通过培养基从广西巴马长寿人群肠道中分离出乳酸菌;
通过对分离株依次经过模拟唾液-胃液-肠液的耐受性试验,获得耐消化应激的菌株;
对分离株黏附肠道黏蛋白和肠上皮Caco-2细胞的能力进行试验,获得具有良好肠道粘附能力的菌株;
对分离株进行抗生素的耐药性研究,获得耐药性较低的菌株即grx401;
研究grx401在经过唾液-胃液-肠液应激后的肠道黏附能力的变化。
本发明所述植物乳杆菌grx401可用于制备含有耐消化应激及高肠道黏附乳酸菌的发酵乳、发酵乳饮料及乳酸菌固体饮料。本发明菌株来源于广西巴马长寿人群肠道,探究了菌株的耐消化应激及黏附肠道黏蛋白和肠上皮Caco-2细胞的能力,并研究了菌株的耐药性及其在唾液-胃液-肠液应激下黏附能力的变化。
附图说明
图1为本发明菌株的形态图;
图2为本发明菌株的16S rDNA PCR扩增产物电泳图;
具体实施方式
本研究采用模拟体内的离子环境以及消化酶的存在部位制备模拟唾液-胃液-肠液,筛选出耐受消化应激的乳酸菌,然后通过肠道黏蛋白及肠上皮Caco-2细胞试验筛选出具有高肠道黏附能力的乳酸菌,研究其耐药性及经过消化应激后的肠道黏附能力的变化。
相关试剂及培养基配方
(1)模拟唾液的配置:用去离子水配置含有0.75mmol/L CaCl2、3.70mmol/LKH2PO4、0.15mmol/L MgCl2(H2O)6、15.10mmol/L KCl、0.06mmol/L(NH4)2CO3、13.60mmol/LNaHCO3的溶液,加入溶菌酶至终浓度为100mg/L,用1mol/L的HCl调节pH至7.0,经0.22μm滤膜过滤除菌,现用现配。
(2)模拟胃液的配置:用去离子水配置含有0.075mmol/L CaCl2、0.90mmol/LKH2PO4、0.1 0mmol/L MgCl2(H2O)6、6.9 0mmol/L KCl、0.50mmol/L(NH4)2CO3、25mmol/LNaHCO3、47.20mmol/L NaCl的溶液,加入胃蛋白酶至终浓度为3.0g/L,用1mol/L的HCl调节pH至3.0,经0.22μm滤膜过滤除菌,现用现配。
(3)模拟肠液的配置:用PBS配置含0.30mmol/L CaCl2、0.80mmol/L KH2PO4、0.33mmol/L MgCl2(H2O)6、6.90mmol/L KCl、0.50mmol/L(NH4)2CO3、85mmol/L NaHCO3、38.40mmol/L NaCl的溶液,加入胰蛋白酶和胆盐至终浓度分别为0.1%和0.3%,用1mol/L的HCl调节pH至8.0,经0.22μm滤膜过滤除菌,现用现配。
(4)MRS液体培养基:蛋白胨10.0g、葡萄糖20.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、吐温-80 1mL、C2H3NaO2 5.0g、K2HPO4 7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g,加去离子水至1000mL,121℃灭菌15min放置室温冷却后使用。配制MRS固体培养基即加入15.0g琼脂。
肠道黏附模型的建立
黏蛋白模型的建立:称取一定量的黏蛋白溶于PBS中,配置成1mg/mL的黏蛋白溶液,经0.22μm滤膜过滤除菌后,取0.5mL至24孔细胞培养板中,37℃培养1h后于4℃过夜培养,然后加入等体积的黏蛋白继续在37℃培养2h以弥补空白位点后,用PBS(pH 7.2)洗涤2次。
Caco-2细胞单层模型的建立:从液氮中取出Caco-2细胞冻存管,迅速置于37℃水浴解冻,融化后用75%酒精擦拭冻存管外部。将细胞悬液转移至15mL离心管中,加入3mL的MEM完全培养基(20%优质胎牛血清、1%MEM非必需氨基酸溶液、1%Gluta MAX谷氨酰胺添加剂、1%丙酮酸钠溶液),于1000×g离心5min,离心后弃掉上清液,加入1mL MEM完全培养液重悬细胞,转入25cm2细胞培养瓶,再加入9mL MEM完全培养液置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞生长至80%-90%融合时,用0.25%胰酶细胞消化液进行消化,按1:3传代培养。当细胞代数在22-30代之间可用于后续实验。Caco-2细胞消化后调节悬液至2×105cell/mL,吸取0.5mL接种于24孔细胞培养板,于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养,每天换液1次培养直至单层。
具体实施方法
1.样品采集;
分别采集一星期内未服用抗生素的广西巴马长寿人群粪便样品和泡菜、奶酪、酸菜等云南传统发酵食品,粪便样品中加入1mL灭菌液体石蜡油密封,与传统发酵食品一起置于4℃条件下保存,并尽快分离其中的乳酸菌。
2.乳酸菌的分离;
将采集的样品捣成糊状,然后用漩涡振荡器制成匀浆,在无菌操作台上用无菌样品稀释液稀释至相应梯度后,取适量分别接种于MRS、LBS等固体培养基中,置于厌氧罐中37℃培养48h,挑取平板上的典型菌落后划线分离得到纯菌落。将纯菌落接种于MRS液体培养基中,37℃厌氧培养至对数期后冻干保藏备用。
3.乳酸菌的生理生化试验;
对分离到的菌株进行革兰氏染色,并进行过氧化氢酶、接触酶、硝酸盐还原及吲哚等生理生化试验。
从采集的样品中分离获得46株菌株,37株菌革兰氏染色为阳性,形状为杆状或球状,在15℃及45℃环境下均能生长,氧化氢酶、接触酶、硝酸盐还原及吲哚试验均为阴性,所以将37株菌初步鉴定为乳酸菌。
4.乳酸菌的耐受消化应激试验;
将MRS活化后的乳酸菌于8000×g离心10min,收集菌体PBS洗涤后重悬于模拟唾液中,37℃摇床培养(200rpm)5min后8000×g离心10min;收集菌体重悬于模拟胃液中,37℃摇床培养(200rpm)3h,8000×g离心10min;收集菌体分别重悬于模拟肠液中,37℃摇床培养(200rpm)2h。每一次应激后均选取合适的稀释梯度,利用平板菌落计数法测定活菌数,根据公式(1)计算其存活率(%)。
存活率(%)=应激后活菌数/初始活菌数×100% (1)
37株乳酸菌耐消化应激的能力见表1。
表1乳酸菌耐受消化应激能力
注:同一列不同大小写字母表示数据具有显著性差异(p<0.05),下同。
由表1可知,菌株在不同消化应激阶段的耐受能力不同,37株乳酸菌中,30株菌株在口腔中的耐受性较强,存活率均大于70%;有16株菌株在经过模拟唾液-胃液的应激后,存活率大于50%;而在依次经过模拟唾液-胃液-肠液的应激后,菌株L73、L167、e113、grx401及L160的耐受能力较强,存活率均大于46%,显著高于其他菌株(p<0.05)。
5.乳酸菌对肠道黏蛋白和肠上皮Caco-2细胞的黏附能力;
活化后的乳酸菌于8000×g离心10min,收集菌体重悬于PBS中,并调整活菌数为108CFU/mL,取0.5mL加入黏蛋白模型中,37℃培养2h,然后用PBS洗涤3次去除未黏附的乳酸菌,加入0.5mL 5mL/L Triton-100溶液于37℃培养30min以解除已黏附的乳酸菌。之后用枪头轻轻刮取,10倍梯度稀释,利用平板菌落计数法检测活菌数,根据公式(2)计算乳酸菌的黏附率。
取0.5mL 2×105cell/mL Caco-2细胞接种于24孔细胞培养板,培养至单层,PBS洗涤2次后加入0.5mL 108CFU/mL乳酸菌悬液于37℃培养2h,PBS洗涤3次已除去未黏附的乳酸菌,加入0.15mL胰酶细胞消化液,待细胞完全脱落后加入0.35mL完全细胞培养液终止消化,10倍梯度稀释,采用平板菌落计数法检测活菌数。并根据公式(2)计算乳酸菌的黏附率。
黏附率(%)=黏附的乳酸菌活菌数/初始乳酸菌活菌数×100% (2)
表2乳酸菌对肠道的黏附能力
由表2可知,菌株grx401和L73对黏蛋白的黏附率均大于2.78%,显著高于其他菌株(p<0.05),同时,对Caco-2细胞的黏附率也显著高于其他菌株(p<0.05),均大于10%;菌株grx401对黏蛋白和Caco-2细胞的黏附率分别为22.89%和37.55%,显著高其余4株乳酸菌(p<0.05)。
6.乳酸菌对抗生素的敏感性;
使用药敏纸片法研究乳酸菌对抗生素的敏感性。将活化后的乳酸菌悬浮于无菌生理盐水中,调整菌体浓度至1×108CFU/mL,吸取1.0mL至融化后的MRS固体培养基中,混匀后迅速倾注到灭菌后平皿中,凝固后贴放标准药物纸片,在37℃恒温培养箱中倒置培养,48h后测量并记录抑菌圈直径,根据CLSI制定的《抗菌药物敏感性试验执行标准》(2019版)判定乳酸菌对抗生素的耐药性。
表3乳酸菌对抗生素的耐药性
注:“S”表示菌株对抗生素敏感,“I”表示菌株对抗生素中度敏感,“R”表示菌株
对抗生素耐药。
由表3可知,5株乳酸菌对环丙沙星和万古霉素具有较强的耐药性,对利福平、青霉素、头孢唑啉(先锋)、头孢唑啉及克拉霉素的耐药性较低;菌株grx401对试验的7种抗生素均为敏感,其耐药性低于其余的4株乳酸菌。
7.消化应激对乳酸菌黏附能力的影响;
用PBS悬浮经唾液-胃液-肠液应激后的菌株grx401,按照步骤5的方法研究消化应激后的菌株对肠道黏蛋白和肠上皮Caco-2细胞的黏附率。
表4消化应激对菌株grx401肠道黏附能力的影响
由表4可知,与未经消化应激的相比,菌株grx401在依次经过唾液-胃液-肠液应激后对黏蛋白和Caco-2细胞的黏附能力无显著性变化(p>0.05),表明菌株grx401的肠道黏附能力对消化应激具有较强的耐受性。
8.乳酸菌的鉴定;
(1)菌株API鉴定;
参照API 50CHL系列鉴定试剂条的操作说明对菌株grx401进行鉴定,结果见表5及表6。
表5 API 50CHL***鉴定结果
注:“+”表示阳性;“-”表示阴性
表6 API比对结果
由表5和表6可知,本发明菌株grx401为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),鉴定率为99%。
(2)菌株16S rDNA测序鉴定;
以菌株grx401的基因组DNA作为PCR的扩增模板,采用通用的16S rDNA引物进行PCR扩增;电泳检测扩增产物后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序得到的序列提交BLAST进行比对分析,结果见表7。
表7 16S rDNA比对结果
由表7可知,菌株grx401为植物乳杆菌(L.plantarum),同源性为99%;结合API50CHL比对结果及16S rDNA序列比对结果,将本发明菌株grx401鉴定为植物乳杆菌(L.plantarum)。
应用实施例
1含本发明菌株的发酵乳制作方法;
将全脂乳(11%-13%)经标准化后,加入6%-7%的糖,预热至60-65℃,15-20Mpa压力均质,95℃热处理5-8min后,冷却至42℃,按3%的接种量接种植物乳杆菌grx401。42℃发酵pH至4.2-4.5,冷却,然后置于4℃贮藏,即为含有耐消化应激及高肠道黏附乳酸菌的发酵乳。
2含本发明菌株的发酵乳饮料制作方法;
取应用实施例1制备好的发酵乳,以25%-45%的比例与杀菌冷却后的水、糖浆及复配乳化稳定剂(0.4%-0.6%)混合溶解,20MPa 60℃均质,冷却后无菌灌装,制成含活性植物乳杆菌grx401的发酵乳饮料。
3含本发明菌株的固体饮料制作方法;
制备菌株的冻干保护剂,主要含有30%-60%的脱脂乳、3.5%-6.5%的蔗糖、3%-7.5%的菊粉、3%-6.5%的谷氨酸钠、3.5%-7%的麦芽糊精、4.5%-8.5%的甘油、0.05%-0.25%的明胶,加入离子水至1Kg;将本发明菌株高密度培养后离心获得菌体,将菌体与保护剂以1:1的质量比混匀,经真空冷冻干燥后获得含水量不高于3%的冻干粉,将冻干粉与麦芽糊精、低聚木糖按一定比例在无菌条件下混匀,即为植物乳杆菌grx401固体饮料。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种具有耐消化应激及高肠道黏附能力的植物乳杆菌grx401及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1477
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 1
cccgtggggg ggtgccctat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga ttggtgcttg 60
catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg aaacctgccc 120
agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact tggaccgcat 180
ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg gcgtattagc 240
tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 300
ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360
ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 420
taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta ttgacggtat 480
ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540
cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt ctgatgtgaa 600
agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga 660
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720
aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag ggtttccgcc 840
cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc gcaaaggctg 900
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960
ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga ttagacgttt 1020
cccttcgggg acatggatac aggtggtgca tggattgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat taagttgggc 1140
actctggtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1200
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggatg gtacaacgag ttgcgaactc 1260
gcgagagtaa gctaatctct taaagccatt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc 1320
tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaag tcggtggggt 1440
aaccttttag gaaccagccg cctaaggtgg atcaggt 1477
Claims (4)
1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)grx401,其特征是:已于2021年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC NO.23544。
2.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)grx401在发酵乳中的应用。
3.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在发酵乳饮料中的应用。
4.如权利要求1所述的一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)在乳酸菌固体饮料中的应用。
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