CN113956490A - 一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球及其制备方法与应用 - Google Patents

一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球及其制备方法与应用。该方法为：将AIE分子、助稳定剂溶于羧基功能单体和疏水单体的混合液中，得到油相溶液；将乳化剂水溶液加至油相溶液中，加入水溶性引发剂，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球；将AIE荧光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基；将活化后的荧光微球，加入碱性缓冲液和链霉亲和素，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到聚合物微球。本发明基于AIE分子的聚集诱导发光现象，满足生物医药各场景的应用；制备方法简便，通过调节微球、碳二亚胺和链霉亲和素比例，可以实现大规模工业化生产。

Description

一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球及其制备方法与应用。
背景技术
链霉亲和素和生物素的结合具有高度特异性和稳定性，两者的亲和常数比抗原-抗体免疫反应高10-100万倍，是目前已知强度最高的非共价作用，这使得它成为蛋白质生物化学中的一个非常好的工具。链霉亲和素修饰的荧光微球结合生物素化的抗体、多肽、核酸适配体和靶向蛋白质，可以作为荧光免疫试剂，广泛地应用于体外诊断领域、荧光示踪、细胞成像领域中。
目前，荧光微球的制备过程中，传统的聚集诱导猝灭（ACQ）荧光分子在聚集过程中会发生荧光减弱甚至荧光猝灭现象，ACQ现象会降低荧光微球产品的线性度和灵敏度，一定程度上限制了其应用。2001年唐本忠课题组发现聚集诱导发光（AIE）材料，由于分子内旋转受限机理，AIE荧光微球会发出强烈的荧光，AIE材料的发现为荧光免疫试剂提供新的解决方案。
现阶段，荧光微球的制备方法包括溶胀吸附法、包覆法和化学键合法。其中最常用的方法是溶胀吸附法，溶胀吸附法通过微球在有机溶剂中溶胀，用微球表面之间的强疏水作用将荧光材料（有机小分子染料或量子点）溶胀在微球中形成荧光微球，溶胀吸附法操作简便，具有一定普适性，但是荧光分子利用效率低，负载的荧光分子控制难度大。包覆法是将荧光分子均匀分散在介质中，利用聚合反应、微胶囊化方法或自组装方法制备出荧光微球，荧光分子负载率高，适合工业大规模的生产。其中细乳液聚合是一种高效制备纳米级荧光微球的包覆方法，由于细乳液聚合的液滴成核机理，使它特别适用于通过引入第二组分制备聚合物微球。
近期，曹志海课题组首先通过1-烯丙基-1-甲基-2,3,4,5-四苯基甲硅烷（AMTPS）和苯乙烯的细乳液共聚合制备AIE荧光微球，AIE的负载量高达20 wt％，但是AIE分子需要修饰可聚合的双键，增加AIE荧光微球的使用成本【Polymer Chemistry, 2016, 7(35):5571-5578.】。后面使用细乳液聚合技术制备多肽修饰的AIE荧光微球，可以特异性进入细胞，显示出在细胞成像领域潜在的应用价值【Polymer Chemistry, 2019, 10(30): 4220-4228.】。近期李万万课题组使用聚苯乙烯共聚物制备AIE荧光微球液滴【CN108587609A.】，再通过溶剂挥发制备出单分散的AIE荧光微球，虽然SPG膜乳化-乳液溶剂挥发法可以有效地制备单分散的聚合物微球，但是无法避免使用有机溶剂，增加环境成本。现阶段，绿色环保的细乳液聚合技术制备链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的文献或专利鲜有报道，限制了在体外诊断领域中的应用。因此，开发出荧光强度高、水分散性好、均一性好、链霉亲和素修饰密度高并且可工业化生产的AIE荧光微球是十分必要的。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种基于细乳液聚合技术制备链霉亲和素修饰AIE荧光微球的新方法。
本发明采用的技术方案是：
一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）将乳化剂溶解于水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
（2）将AIE分子、助稳定剂溶于羧基功能单体和疏水单体的混合液中，得到油相溶液；
（3）将步骤（1）所述的乳化剂水溶液加至步骤（2）所述的油相溶液中，通过超声处理得到单体细乳液，升高温度，加入水溶性引发剂，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球；
（4）将步骤（3）制得的AIE荧光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，离心去上清，得活化后的荧光微球；
（5）将步骤（4）活化后的荧光微球，加入碱性缓冲液和链霉亲和素，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球。
用免疫层析试纸条测试链霉亲和素修饰AIE荧光微球的效果，试纸条包括底板，样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫端部与吸水垫端部之间外露的硝酸纤维素膜上包被有与底板端面平行的检测线，检测线包被抗链霉亲和素抗体，在样品垫滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值。
优选的，步骤（1）中，所述乳化剂的质量用量为水质量用量的0.01%~20%；
进一步优选的，所述的水溶性乳化剂质量用量为水质量用量的0.1%~5%。
优选的，步骤（1）中，所述水为超纯水；
优选的，所述乳化剂选自下列至少一种：十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、吐温20、十二烷基苯磺酸钠。
优选的，步骤（2）中，所述AIE分子质量用量为单体总质量的0.05%~20%；所述助稳定剂的质量用量为单体总质量的0.01%~8%；所述羧基功能单体的质量用量为单体总质量用量的5%~50%；所述疏水单体的质量用量为单体总质量用量的50%~95%；
所述的单体总质量是指羧基功能单体和疏水单体的总质量。
优选的，步骤（2）所述的AIE分子选自式（I）、式（II）和式（III）的至少一种：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE003
优选的，所述助稳定剂选自下列至少一种：C14~C22的脂肪烃、C14~C22的脂肪醇；
优选的，所述羧基功能单体为式（IV）所示的丙烯酸、甲基丙烯酸的至少一种；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE004
式（IV）中，R1为H或 CH3；
优选的，所述的疏水单体选自下列至少一种：式（V）苯乙烯、式（VI）所示的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体化合物；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE005
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE006
式（VI）中，R7为H或甲基；R8为C1~C5的烷基。
进一步优选的，步骤（2）中，考虑到制备的AIE荧光微球在细胞成像中的应用，优选红色式（III）AIE分子为荧光组分，AIE分子的质量用量优选为单体总质量用量的0.1%~4%；
进一步优选的，步骤（2）中，考虑到胶体颗粒的熟化现象，助稳定剂优选正十六烷，助稳定剂的质量用量优选为单体质量用量的1%~6%；
关于本发明，经过本人深入研究，单体油水比例、表面活性剂类型及其用量对AIE荧光微球的粒径和稳定性起着重要作用，表面活性剂和单体油水比例可以精确调控AIE荧光微球的粒径，在聚合反应过程中，增加表面活性剂用量或者减小单体油水比例，会降低微球的粒径，调控区间范围为50nm~500nm。因此，需要根据不同粒径需求选择合适的表面活性剂和单体油水比例。
进一步优选的，步骤（2）中，考虑到为后续生物素化的大分子修饰提供足够的反应位点，并且保证荧光微球具有优异的窄分布，羧基功能单体优选甲基丙烯酸，羧基功能单体的质量用量优选为单体质量用量的10%~30%；
进一步优选的，步骤（2）中，考虑到AIE荧光微球主要用于荧光免疫诊断试剂中，疏水单体优选为苯乙烯，疏水单体的质量用量优选为单体总质量用量的70%~90%。
优选的，步骤（3）中，所述超声处理的功率为100W~500W，超声处理的时间为0.5min~60min；所述反应的温度为50℃~90℃，反应的时间为2h~48h；
优选的，步骤（3）中，所述水溶性引发剂的质量用量为单体总质量的0.05%~10%；
所述的单体总质量是羧基功能单体和疏水单体的总质量；
优选的，步骤（3）中，所述的水溶性引发剂选自下列至少一种：过硫酸盐类；水溶性偶氮类；氧化剂与还原剂构成的氧化还原体系。考虑到聚合反应体系的稳定性，水溶性引发剂优选为过硫酸钾；
优选的，步骤（4）中，所述碳二亚胺缩合试剂选自N, N’-二环己基碳二亚胺、N, N’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；
优选的，步骤（4）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液；所述酸性缓冲液pH值为6.0~6.5；所述碳二亚胺缩合试剂的质量用量为羧基功能单体用量的100%~400%，所述活化的时间为5 min~3 h；为了最大化提高缩合反应效率，酸性的缓冲液优选pH值在6.0~6.5范围内的2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液，碳二亚胺缩合剂优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
优选的，所述离心时间为10-60min，转速为8000-16000rpm，离心次数为三次以上。进一步优选的，所述离心时间为30min，转速为12000rpm
优选的，步骤（5）中，所述链霉亲和素的质量用量为羧基功能单体用量的10%~200%；
优选的，步骤（5）中，所述碱性缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲盐（PBS）溶液；所述碱性缓冲液pH值为7.0~8.0；为了最大化提高缩合反应效率，碱性缓冲液优选pH值在7.0~8.0范围内的硼酸缓冲液。
优选的，步骤（5）中，考虑到活化后活性酯没有被完全反应，需要对活性酯进行封闭，所述的封闭液优选为牛血清白蛋白（BSA）和甘氨酸，更优选为BSA。
上述的制备方法制备的链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球。
上述的链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球在体外诊断领域中的应用。
关于本发明，经过发明人深入研究，碳二亚胺作为缩合剂的同时，也可以作为絮凝剂，为了保证胶体稳定性，碳二亚胺应根据链霉亲和素修饰密度选择合适的用量。同时为了防止缩合反应表面羧基和氨基质子化，羧基活化时应选用pH=6的MES缓冲液，偶联链霉亲和素时应选用pH=8的硼酸缓冲液。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
提出了一种结合细乳液聚合技术和碳二亚胺反应高效制备链霉亲和素修饰的AIE聚合物荧光微球的新方法，通过免疫层析方式检测微球的效果，验证了链霉亲和素修饰的AIE荧光微球在体外诊断中潜在的应用价值。将AIE分子嵌入在聚合物基体中，通过羧基单体和疏水单体的共聚合制备表面羧基修饰的AIE荧光微球。利用碳二亚胺反应高效制备链霉亲和素修饰的AIE荧光微球，最后加入封闭液和保存液，得到链霉亲和素修饰的AIE荧光微球。
该方法的优点是：
（1）一步法制备羧基修饰的聚苯乙烯AIE荧光微球，并且通过调节碳二亚胺缩合剂和链霉亲和素比例，可以调控AIE荧光微球的链霉亲和素的修饰密度，高效地制备链霉亲和素修饰的AIE荧光微球。
（2）相比较传统的ACQ分子，由于AIE分子的聚集诱导发光现象，AIE分子在微球中能发出强烈的荧光，并且AIE荧光微球的发光波长可以覆盖红、蓝、绿等多个波段，满足生物医药各场景的应用。
（3）本发明制备方法简便，通过调节微球、碳二亚胺和链霉亲和素比例，可以实现大规模工业化生产。
附图说明
图1为实施例1所制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球的扫描电镜图。
图2为实施例1所制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球乳液荧光发射光谱图。
图3为实施例1、对比例1、对比例2所制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球的试纸条效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明用免疫层析试纸条测试链霉亲和素修饰AIE荧光微球的效果，试纸条包括底板，样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫端部与吸水垫端部之间外露的硝酸纤维素膜上包被有与底板端面平行的检测线，检测线包被抗链霉亲和素抗体，在样品垫滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值。
实施例1
称取0.4g十二烷基硫酸钠完全溶解于12.5 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.05 g式（1）AIE分子和0.06g正十六烷溶于0.1g甲基丙烯酸和1g苯乙烯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用300W的功率超声8min，得到单体细乳液，升高温度到70 ℃，加入0.02g过硫酸钾，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入200gMES缓冲液（pH=6），超声分散后加入0.19g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5min。使用12000rpm转速离心去上清得活化AIE荧光微球，加入60g硼酸缓冲液（pH=8）和0.05g链霉亲和素，放入混合仪孵育，转速300 rpm，时间5min，使用12000rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为400nm，发射波长为525nm，在365nm紫外灯激发下呈现绿色的荧光（如图2）。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为200nm（如图1）。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的绿色荧光（如图3A），使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为12901。
对比例1
采用与实施例1相同的配方和制备条件，制得羧基修饰的AIE聚合物荧光微球。
将AIE荧光微球加入200 gMES缓冲液（pH=6），超声分散后加入0.19 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5min。使用12000 rpm转速离心去上清得活化AIE荧光微球，加入60 g硼酸缓冲液（pH=8）和0.05 g牛血清白蛋白，放入混合仪孵育，转速300 rpm，时间5min，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试牛血清白蛋白修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为400nm，发射波长为525nm，在365 nm紫外灯激发下呈现绿色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链牛血清白蛋白修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为200 nm。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制牛血清白蛋白修饰的AIE荧光微球，由于牛血清白蛋白和抗链霉亲和素抗体无特异性结合，检测线显示出弱的绿色荧光（如图3B），使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为2519。
对比例2
采用与实施例1相同的配方和制备条件，制得羧基修饰的AIE聚合物荧光微球。
将AIE荧光微球加入200 gMES缓冲液（pH=6），超声分散后加入0.19 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5min。使用12000 rpm转速离心去上清得活化AIE荧光微球，加入60 g硼酸缓冲液（pH=4）和0.05 g链霉亲和素，放入混合仪孵育，转速300 rpm，时间5min，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为400nm，发射波长为525nm，在365 nm紫外灯激发下呈现绿色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为200 nm。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰的AIE荧光微球，由于偶联反应体系pH过低，导致链霉亲和素修饰AIE荧光微球失败，检测线显示出弱的绿色荧光（如图3C），使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为3519。
实施例2
称取0.15g吐温20完全溶解于60 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.1 g式（II）AIE分子和0.2g正十六烷溶于0.5g甲基丙烯酸和2.5 g甲基丙烯酸甲酯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用500 W的功率超声10min，得到单体细乳液，升高温度到70 ℃，加入0.05g偶氮二异丁基脒盐酸盐，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000 rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入250gMES缓冲液（pH=6），超声分散后加入0.55g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基。使用12000rpm转速离心活化AIE荧光微球，加入100 g硼酸缓冲液（pH=8）和0.06g链霉亲和素，放入混合仪孵育，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为365nm，发射波长为415nm，在365 nm紫外灯激发下呈现深蓝色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为300 nm。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的深蓝色荧光，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为13407。
实施例3
称取2.5g十二烷基苯磺酸钠完全溶解于125 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.3g式（III）AIE分子和0.6g助稳定剂溶于2g亚甲基丁二酸和12g甲基丙烯酸甲酯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用600 W的功率超声20min，得到单体细乳液，升高温度到72 ℃，加入0.1 g过硫酸钾，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000 rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入300 g甘氨酸-盐酸缓冲液（pH=6），超声分散后加入2.4g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基。使用12000 rpm转速离心活化AIE荧光微球，加入120 g硼酸-硼砂缓冲液（pH=8）和0.08g链霉亲和素，放入混合仪孵育，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为510nm，发射波长为610nm，在365 nm紫外灯激发下呈现红色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为400 nm。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的红色荧光，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为12709。
实施例4
称取5g十二烷基硫酸钠完全溶解于250 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.4g式（I）AIE分子和1.5g正十六烷溶于5g甲基丙烯酸和30g甲基丙烯酸甲酯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用300 W的功率超声9min，得到单体细乳液，升高温度到70 ℃，加入0.15g过硫酸钾，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000 rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入400 g邻苯二甲酸-盐酸缓冲液（pH=6），超声分散后加入3.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基。使用12000rpm转速离心活化AIE荧光微球，加入135g硼酸缓冲液（pH=8）和0.09g链霉亲和素，放入混合仪孵育，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为365 nm，发射波长为415 nm，在365 nm紫外灯激发下呈现深蓝色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为500nm。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的深蓝色荧光，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为11007。
实施例5
称取7.5g聚乙烯醇完全溶解于125 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.2g式（II）AIE分子和0.3g正十六烷溶于10g甲基丙烯酸和125g甲基丙烯酸甲酯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用400 W的功率超声15min，得到单体细乳液，升高温度到70 ℃，加入0.25g偶氮二异丁脒盐酸盐，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000 rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入100 g磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=6），超声分散后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基。使用12000rpm转速离心活化AIE荧光微球，加入100 g硼酸缓冲液（pH=8）和0.12g链霉亲和素，放入混合仪孵育，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为400nm，发射波长为525nm，在365 nm紫外灯激发下呈现绿色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为300 nm。通过等温量热滴定法实验结构显示，链霉亲和素被成功修饰到AIE荧光微球表面。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的绿色荧光，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为13098。
实施例6
称取4.8g十二烷基硫酸钠完全溶解于125 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.15g式（III）AIE分子和0.5g正十六烷溶于3.5g甲基丙烯酸和15g甲基丙烯酸甲酯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用400 W的功率超声30min，得到单体细乳液，升高温度到65 ℃，加入0.1g偶氮二异丁脒盐酸盐，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000 rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入150gMES缓冲液（pH=6），超声分散后加入5.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基。使用12000rpm转速离心活化AIE荧光微球，加入100g硼酸缓冲液（pH=8）和0.14g链霉亲和素，放入混合仪孵育，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为510nm，发射波长为610nm，在365 nm紫外灯激发下呈现红色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为100 nm。通过等温量热滴定法实验结构显示，链霉亲和素被成功修饰到AIE荧光微球表面。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的绿色荧光，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为14097。
实施例7
称取4g十二烷基苯磺酸钠完全溶解于125 g超纯水中，用作连续相的水相溶液。称取0.2g式（II）AIE分子和0.4g正十六烷溶于4g甲基丙烯酸和40g苯乙烯酯，得到油相溶液。
把水相溶液加入油相溶液搅拌混合，用400 W的功率超声10min，得到单体细乳液，升高温度到70 ℃，加入0.1g过硫酸钾，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球乳液。使用12000 rpm转速离心AIE荧光微球，再重悬于水中，循环三次，得到纯净的羧基修饰AIE荧光微球。
将AIE荧光微球加入150gMES缓冲液（pH=6），超声分散后加入4.5g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基。使用12000rpm转速离心活化AIE荧光微球，加入100 g硼酸缓冲液（pH=8）和0.35g链霉亲和素，放入混合仪孵育，使用12000 rpm转速离心30min取上清，加入封闭液牛血清白蛋白和保存液，超声分散，2-8 ℃保存。
使用酶标仪测试链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的光谱，其激发波长为400nm，发射波长为525nm，在365 nm紫外灯激发下呈现绿色的荧光。使用场发射扫描电镜显微镜观察链霉亲和素修饰的AIE荧光微球的形貌，微球形貌呈球形结构，统计粒径为50nm。通过等温量热滴定法实验结构显示，链霉亲和素被成功修饰到AIE荧光微球表面。抗链霉亲和素抗体试纸条作为检测模型，滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，检测线显示出明亮的绿色荧光，使用干式荧光免疫仪检测荧光信号值，结果为12309。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能限制本发明，在于本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将乳化剂溶解于水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
（2）将AIE分子、助稳定剂溶于羧基功能单体和疏水单体的混合液中，得到油相溶液；
（3）将步骤（1）所述的乳化剂水溶液加至步骤（2）所述的油相溶液中，通过超声处理得到单体细乳液，升高温度，加入水溶性引发剂，反应制得表面羧基修饰的AIE荧光微球；
（4）将步骤（3）制得的AIE荧光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，离心去上清，得活化后的荧光微球；
（5）将步骤（4）活化后的荧光微球，加入碱性缓冲液和链霉亲和素，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述乳化剂的质量用量为水质量用量的0.01%~20%；所述乳化剂选自下列至少一种：十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、吐温20、十二烷基苯磺酸钠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述AIE分子质量用量为单体总质量的0.05%~20%；所述助稳定剂的质量用量为单体总质量的0.01%~8%；所述羧基功能单体的质量用量为单体总质量用量的5%~50%；所述疏水单体的质量用量为单体总质量用量的50%~95%；
所述的单体总质量是指羧基功能单体和疏水单体的总质量。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的AIE分子选自式（I）、式（II）和式（III）的至少一种：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
所述助稳定剂选自下列至少一种：C14~C22的脂肪烃、C14~C22的脂肪醇；
所述羧基功能单体为式（IV）所示的丙烯酸、甲基丙烯酸的至少一种；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式（IV）中，R1为H或 CH3；
所述的疏水单体选自下列至少一种：式（V）苯乙烯、式（VI）所示的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体化合物；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure DEST_PATH_IMAGE006
式（VI）中，R7为H或甲基；R8为C1~C5的烷基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述AIE分子的质量用量为单体总质量用量的0.1%~4%；
所述助稳定剂的质量用量为单体总质量用量的1%~6%；
所述羧基功能单体的质量用量为单体总质量用量的10%~30%；
所述疏水单体的质量用量为单体总质量用量的70%~90%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述超声处理的功率为100W~500W，超声处理的时间为0.5min~60min；所述反应的温度为50℃~90℃，反应的时间为2h~48h；
步骤（3）中，所述水溶性引发剂的质量用量为单体总质量的0.05%~10%；
所述的单体总质量是羧基功能单体和疏水单体的总质量；
步骤（3）中，所述的水溶性引发剂选自下列至少一种：过硫酸盐类；水溶性偶氮类；氧化剂与还原剂构成的氧化还原体系。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述碳二亚胺缩合试剂选自N, N’-二环己基碳二亚胺、N, N’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；
步骤（4）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、2-(N-***啉)乙磺酸缓冲液；所述酸性缓冲液pH值为6.0~6.5；所述碳二亚胺缩合试剂的质量用量为羧基功能单体用量的100%~400%，所述活化的时间为5 min~3h；
所述离心时间为10-60min，转速为8000-16000rpm，离心次数为三次以上。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述链霉亲和素的质量用量为羧基功能单体用量的10%~200%；
步骤（5）中，所述碱性缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲盐溶液；所述碱性缓冲液pH值为7.0~8.0；
步骤（5）中，所述的封闭液为牛血清白蛋白或甘氨酸。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备的链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球。
10.权利要求9所述的链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球在体外诊断领域中的应用。
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