CN113933277B - 一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法，包括：第一激光器、荧光信号产生单元、分束单元、第一信号通道单元、第二信号通道单元、探测器以及控制终端；其中，第一信号通道单元包括第一柱透镜，第二信号通道单元包括第二柱透镜，第一柱透镜和第二柱透镜的取向相互正交；分束单元用于将荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；第一信号通道单元和第二信号通道单元用于分别将两束荧光信号投射至探测器进行成像；控制终端用于根据正反向像散点扩散函数图像对进行三维定位以及超分辨成像。本发明的***在无需牺牲原有成像深度的前提下提高离焦荧光分子的三维定位精度，三维定位准确率高，有效探测范围大。

Description

一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法

技术领域

本发明属于光学显微技术领域，尤其涉及一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法。

背景技术

近十几年来，以随机光学重建显微(Stochastic Optical ReconstructionMicroscopy，STORM)和光激活定位显微(Photoactivated Localization Microscopy,PALM)为代表的单分子定位超分辨显微成像技术绕过了光学衍射极限对成像分辨率的限制，实现了纳米级空间分辨率，已被应用于生命科学研究并推动了相关领域的发展。单分子定位技术通过控制荧光分子的闪烁，将空间上原本相互重叠的像斑(也称点扩散函数，Point Spread Function，PSF)在时间上进行分离，进而通过对稀疏PSF的探测和定位来重构超分辨图像，因此获得一幅超分辨图像通常需要采集数万帧原始图像，时间分辨率很低。

采用高密度成像方法可显著提高单分子定位超分辨显微成像的时间分辨率，高密度三维单分子定位超分辨成像技术为基于高密度成像方法的单分子定位超分辨显微成像技术的一种，然而现有三维高密度单分子定位超分辨成像技术存在定位精度随离焦程度增大而急剧降低，有效探测范围小的问题。

因此，现有技术有待于进一步的改进。

发明内容

鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法，克服现有高密度三维单分子定位超分辨成像技术存在定位精度随离焦程度增大而急剧降低，有效探测范围小的缺陷。

本发明所公开的第一实施例为一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，包括：第一激光器、荧光信号产生单元、分束单元、第一信号通道单元、第二信号通道单元、探测器以及控制终端；其中，所述第一信号通道单元包括第一柱透镜，所述第二信号通道单元包括第二柱透镜，所述第一柱透镜和所述第二柱透镜的取向相互正交；

所述荧光信号产生单元用于将所述第一激光器产生的第一激光光束投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；

所述分束单元用于接收所述荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；

所述第一信号通道单元用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器的第一区域进行成像；

所述第二信号通道单元用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器的第二区域进行成像；

所述探测器用于采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；

所述控制终端用于根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息进行图像重构，得到样品的超分辨图像。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，所述荧光信号产生单元包括：第一透镜组、第一提升镜组、管镜、第一二向色镜以及显微物镜；

所述第一透镜组用于接收所述第一激光器产生的第一激光光束，并对所述第一激光光束进行扩束准直；

所述第一提升镜组用于接收扩束准直后的第一激光光束，并将所述第一激光光束的高度提升后反射至所述管镜；

所述管镜和所述第一二向色镜用于将所述第一提升镜组反射的第一激光光束投射至所述显微物镜；

所述显微物镜用于接收所述管镜和所述第一二向色镜投射的第一激光光束，并将所述第一激光光束以平行光的形式投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，所述荧光信号产生单元还包括第一衰减片，所述第一衰减片设置于所述第一激光器和所述第一透镜组之间；

所述第一衰减片用于接收所述第一激光器产生的第一激光光束，并对所述第一激光光束的功率进行调节。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，所述***还包括：第二激光器；所述荧光信号产生单元还包括：第一反射镜和第二二向色镜；所述第二二向色镜设置于所述第一衰减片和所述第一透镜组之间；

所述第二激光器用于产生第二激光光束；

所述第一反射镜用于接收所述第二激光光束，并将所述第二激光光束反射至所述第二二向色镜；

所述第二二向色镜用于接收所述第一反射镜反射的第二激光光束，并将所述第二激光光束与所述第一激光光束合束后投射至所述样品面，以使所述样品中处于暗态的荧光分子进入闪烁状态。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，所述荧光信号产生单元还包括：第二衰减片；所述第二衰减片设置于所述第二激光器与所述第一反射镜之间；

所述第二衰减片用于接收所述第二激光器产生的第二激光光束，并对所述第二激光光束的功率进行调节。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，所述分束单元包括：荧光滤光片、第二反射镜、第一成像透镜、可调光阑、准直透镜以及分束棱镜；

所述荧光滤光片用于接收所述荧光信号，并对所述荧光信号中的串扰信号进行滤除；

所述第二反射镜用于接收滤除串扰信号后的荧光信号，并将所述荧光信号反射至所述第一成像透镜；

所述第一成像透镜用于接收所述第二反射镜反射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦至可调光阑；

所述可调光阑用于接收所述第一成像透镜聚焦的荧光信号，并对所述荧光信号的视场进行调节；

所述准直透镜用于接收调节视场后的荧光信号，并将所述荧光信号准直投射至所述分束棱镜；

所述分束棱镜用于接收所述准直透镜准直投射的荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其中，所述第一信号通道单元还包括：第二透镜组；所述第二信号通道单元还包括：第三透镜组；

所述第二透镜组用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并对所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号的成像视场进行调节；

所述第三透镜组用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并对所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号的成像视场进行调节。

本发明所公开的第二实施例为一种所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的成像方法，其中，包括：

将所述第一激光器产生的第一激光光束投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；

将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；

通过第一信号通道单元将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器的第一区域进行成像，以及通过第二信号通道单元将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器的第二区域进行成像；

采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；

根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息进行图像重构，得到样品的超分辨图像。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像方法，其中，所述根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息的步骤包括：

根据预先确定的正交像散校准曲线，构造观测矩阵；

根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及预先构建的损失函数，确定所述荧光分子的三维定位信息。

所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像方法，其中，所述根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及预先构建的损失函数，确定所述荧光分子的三维定位信息的步骤包括：

获取已定位荧光分子对应的三维定位信息集，根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集，确定剩余图像；

将所述剩余图像中各像素的强度值与预设阈值进行比较，当所述剩余图像中各像素的强度值不是均小于所述阈值时，根据所述剩余图像和预先构建的损失函数确定下一个未定位荧光分子对应的三维定位信息，将所述三维定位信息加入所述三维定位信息集，并继续执行根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集确定剩余图像的步骤，直至所述剩余图像中各像素的强度值均小于所述阈值；

将所述三维定位信息集中各三维定位信息确定为所述荧光分子的三维定位信息。

有益效果，本发明提供了一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法，通过包含取向相互正交的第一柱透镜和第二柱透镜的第一信号通道单元和第二信号通道单元分别将分束单元分出的两束荧光信号投射至探测器的不同区域进行成像，由两个正交柱透镜产生的一对正反向像散点扩散函数图像具有最大程度的形状差异，三维定位准确率高，且离焦程度越大，两个像散点扩散函数图像的形状差异越大，同时由于两个信号通道单元无需相互错开，有效探测范围大，在无需牺牲原有成像深度的前提下提高离焦荧光分子的三维定位精度，两个像散点扩散函数图像通过一个探测器同时采集，既节约成本，又保证了两个通道采集参数的一致性。

附图说明

图1是本发明实施例中提供的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的结构示意图；

图2是本发明实施例中提供的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的可调光阑处获得的宽场荧光图像；

图3本发明实施例中提供的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的可调光阑将成像视场限制为原来的1/4时的宽场荧光图像；

图4是本发明实施例中提供的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的探测器采集的双通道宽场荧光图像；

图5是同一荧光分子在不同轴向位置时正反向像散点扩散函数图像对的数值模拟结果图；

图6是本发明实施例提供的高密度三维单分子定位超分辨显微成像方法的具体实施例流程图；

图7是本发明实施例提供的正交像散校准曲线图；

图8是本发明实施例提供的利用正交像散校准曲线图为基础进行模拟实验与分析，得到的正反向像散点扩散函数图像对；

图9是对图8中的正反向像散点扩散函数图像对进行定位，得到的定位结果图；

图10是采用单个柱透镜像散成像并定位，得到的定位结果图；

图11是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同轴向位置的荧光分子定位结果在x方向的RMSE统计结果对比图；

图12是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同轴向位置的荧光分子定位结果在y方向的RMSE统计结果对比图；

图13是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同轴向位置的荧光分子定位结果在xy方向的RMSEE统计结果对比图；

图14是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同轴向位置的荧光分子定位结果在z方向的RMSEE统计结果对比图；

图15是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同轴向位置的定位召回率对比图；

图16是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同轴向位置的错误率对比图；

图17是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同分子密度的荧光分子定位结果在x方向的RMSEE统计结果对比图；

图18是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同分子密度的荧光分子定位结果在y方向的RMSEE统计结果对比图；

图19是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同分子密度的荧光分子定位结果在xy方向的RMSEE统计结果对比图；

图20是本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同分子密度的荧光分子定位结果在z方向的RMSEE统计结果对比图；

图21本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同分子密度的定位召回率对比图；

图22本发明实施例提供的正交柱透镜与单个柱透镜对应的不同分子密度的错误率对比图。

附图中各标记：1、第一激光器；2、荧光信号产生单元；3、分束单元；4、第一信号通道单元；5、第二信号通道单元；6、探测器；7、样品面；8、第二激光器；9、第二成像透镜；21、第一透镜组；22、第一提升镜组；23、管镜；24、第一二向色镜；25、显微物镜；26、第一衰减片；27、第一反射镜；28、第二二向色镜；29、第二衰减片；31、荧光滤光片；32、第二反射镜；33、第一成像透镜；34、可调光阑；35、准直透镜；36、分束棱镜；41、第一柱透镜；42、第一透镜；43、第二透镜；44、第三反射镜；45、第五反射镜；51、第二柱透镜；52、第三透镜；53、第四透镜；54、第四反射镜。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在实施方式和申请专利范围中，除非文中对于冠词有特别限定，否则“一”与“所述”可泛指单一个或复数个。

另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

采用高密度成像方法可显著提高时间分辨率，所谓高密度成像，是指以更高的分子密度记录原始图像，从而减少重构一幅超分辨图像所需的原始图像数量。但这样做同时也增加了单帧图像中像斑(也称点扩散函数，Point Spread Function，PSF)之间的重叠程度，需要借助更复杂的算法来实现单分子定位。例如，多点拟合算法采用多个PSF模型来拟合，从而提高对重叠分子的识别能力和定位精度；压缩感知算法利用分子定位信息满足稀疏性先验条件和探测过程的非自适应线性投影关系，采用最优化方法来重构信号。目前这些方法在二维高密度单分子定位超分辨成像中已经得到了较好的应用。

然而，高密度三维单分子定位超分辨成像至今仍相对困难。这是因为，三维PSF不仅在轴向上变化缓慢并呈现对称性，而且体积的扩展使得彼此间更容易发生重叠，导致轴向定位精度低甚至难以定位。目前也有一些方法可以一定程度上实现高密度三维单分子定位成像。例如，H.Babcock等利用单个柱透镜产生的像散破坏三维PSF的轴向对称性，并采用多点拟合算法进行定位；L.Gu等通过同时采集三维PSF的两个不同焦面，并结合压缩感知算法进行定位；J.Min等则将两种方法进行结合，进一步提高了轴向定位精度；但是，这些方法均存在定位精度随离焦程度增大而急剧降低的问题，通常只能用于对非常薄的样品进行三维单分子定位超分辨成像。J.Huang等采用三个焦面互相错开的柱透镜对同一个PSF产生不同程度的像散，并结合一种快速无偏离连续空间压缩感知算法，很好地解决了轴向定位精度一致性的问题。但三个像散PSF的同时探测不仅需要三个EMCCD探测器，成本很高，而且使得有效探测的轴向范围被限制在一个更小的范围。

为了解决上述问题，本发明提供了一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，如图1所示。本发明的***包括：第一激光器1、荧光信号产生单元2、分束单元3、第一信号通道单元4、第二信号通道单元5、探测器6以及控制终端；其中，所述第一信号通道单元4包括第一柱透镜41，所述第二信号通道单元5包括第二柱透镜51，所述第一柱透镜41和所述第二柱透镜51的取向相互正交；所述荧光信号产生单元2用于将所述第一激光器1产生的第一激光光束投射至样品面7，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；所述分束单元3用于接收所述荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；所述第一信号通道单元4用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器6的第一区域进行成像；所述第二信号通道单元5用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器6的第二区域进行成像；所述探测器6用于采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；所述控制终端用于根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息重构超分辨图像。

具体地，所述第一柱透镜41和所述第二柱透镜51的焦距一般较长，如1000mm，其作用是使荧光分子的像斑(也称点扩散函数，Point Spread Function，PSF)由于两个方向的聚焦能力略有不同而产生像散，从而破坏三维PSF的轴向对称性，便于从采集的三维PSF图像中根据其形状特征获取荧光分子的三维定位信息。所述第一柱透镜41和所述第二柱透镜51的参数相同但取向相互正交，所谓取向相互正交具体是指所述第一柱透镜41和所述第二柱透镜51对所述荧光信号的聚焦方向相互垂直，例如，当所述第一柱透镜41的聚焦方向沿x方向时，所述第二柱透镜51的聚焦方向沿y方向，或者当所述第一柱透镜41的聚焦方向沿y方向时，所述第二柱透镜51的聚焦方向沿x方向。超分辨成像过程中，第一激光器1产生的第一激光光束由荧光信号产生单元2投射至样品面7上，激发样品中的荧光分子进入闪烁状态产生荧光信号，然后由分束单元3将荧光信号均分成传播方向互相垂直的两束，经第一信号通道单元4和第二信号通道单元5分别投射至探测器6的两个不同区域进行成像后，由控制终端根据探测器6采集的正反向像散点扩散函数图像对进行图像重构，得到样品的超分辨图像。本实施例中将荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号后，通过取向相互正交的两个柱透镜将传播方向互相垂直的两束荧光信号分别投射至同一探测器6的不同区域进行成像，由于两个正交柱透镜产生的一对正反向像散点扩散函数图像具有最大程度的形状差异，三维定位准确率高，且离焦程度越大，两个像散点扩散函数图像的形状差异越大，同时由于两个信号通道单元无需相互错开，有效探测范围大，在无需牺牲原有成像深度的前提下提高离焦荧光分子的三维定位精度，两个像散点扩散函数图像通过一个探测器6同时采集，既节约成本，又保证了两个通道采集参数的一致性。

在一具体实施方式中，所述荧光信号产生单元2包括：沿光路依次设置的第一透镜组21、第一提升镜组22、管镜23、第一二向色镜24以及显微物镜25；所述第一透镜组21用于接收所述第一激光器1产生的第一激光光束，并对所述第一激光光束进行扩束准直；所述第一提升镜组22用于接收扩束准直后的第一激光光束，并将所述第一激光光束的高度提升后反射至所述管镜23；所述管镜23和所述第一二向色镜24用于将所述第一提升镜组22反射的第一激光光束投射至所述显微物镜25；所述显微物镜25用于接收所述管镜23和所述第一二向色镜24投射的第一激光光束，并将所述第一激光光束以平行光的形式投射至样品面7，激发样品中的荧光分子产生荧光信号。具体成像过程中，第一激光器1产生的第一激光光束由第一透镜组21扩束准直后，经第一提升镜组22、管镜23和第一二向色镜24聚焦于显微物镜25后焦面，由显微物镜25将第一激光光束以平行光的形式投射至样品面7，激发样品中的荧光分子进入闪烁状态产生荧光信号。

进一步地，本实施例中使用的荧光分子尺寸较小且具有比较高的光子效率，同时还需要具备光开关特性或称“闪烁”特性，即荧光分子在相同激发条件下，具有开/关两个状态，并可以与样品特定结构进行特异性结合。所述第一激光器1产生的第一激光光束用于使样品中具有闪烁特性的荧光分子迅速光漂白并在成像缓冲液的辅助下产生光致闪烁，实现稀疏发光，因此所述第一激光光束的波长需满足波长与荧光分子吸收波长对应且功率较高，如以Cy5染料作为荧光分子时，常采用波长640nm左右且功率不小于200mW的激光激发荧光分子。

具体实施时，荧光分子被激发后，分子从基态跃迁到激发态，当分子从激发态回到基态时产生荧光，处于激发的荧光分子有可能发生系间穿越，从单线态到三线态，由于荧光分子在三线态的停留时间内不再参与荧光发射，此时的荧光分子就处于非荧光态即暗态。为了使处于暗态的荧光分子被激发重新进入闪烁状态，本实施例中所述***还包括：第二激光器8；所述荧光信号产生单元2还包括：第一反射镜27和第二二向色镜28；所述第二二向色镜28设置于所述第一衰减片26和所述第一透镜组21之间；所述第二激光器8用于产生第二激光光束，其中，所述第二激光光束为紫外波段的激活光，如405nm的激活光；所述第一反射镜27用于接收所述第二激光光束，并将所述第二激光光束反射至所述第二二向色镜28；所述第二二向色镜28用于接收所述第一反射镜27反射的第二激光光束，并将所述第二激光光束与所述第一激光光束合束后投射至所述样品面7，以使所述样品中处于暗态的荧光分子进入闪烁状态。具体成像过程中，所述第二激光器8产生的第二激光光束经过45°角放置的第一反射镜27反射后，入射到同样45°角放置的第二二向色镜28上，由第二激光器8产生的第二激光光束与第一激光光束经过第二二向色镜28合束后投射至样品面7，使样品中处于暗态荧光分子进入闪烁状态，从而有利于长时间的荧光数据采集。

在一具体实施方式中，所述荧光信号产生单元2还包括：第一衰减片26和第二衰减片29，所述第一衰减片26设置于所述第一激光器1和所述第一透镜组21之间，所述第二衰减片29设置于所述第二激光器8与所述第一反射镜27之间；所述第一衰减片26用于接收所述第一激光器1产生的第一激光光束，并对所述第一激光光束的功率进行调节；所述第二衰减片29用于接收所述第二激光器8产生的第二激光光束，并对所述第二激光光束的功率进行调节。

对于样品中有多种荧光探针标记的情形，第一激光器1可扩展为多色激光器或多种激光器的组合，组合方式与第一激光器1和第二激光器8的组合方式相同。此外，也可以在第二二向色镜28和第一透镜组21之间设置声光可调滤波器(Acousto-optic TunableFilter，AOTF)等光电器件，通过声光可调滤波器等光电器件对合束后的激光束进行波长切换和功率调节，此时第一衰减片26和第二衰减片29可省略。

在一具体实施方式中，所述第一提升镜组22和所述管镜23固定于可移动的平移台上，通过横向(如图1箭头所示)移动平移台，可以调节从显微物镜25出射的平行光方向，当移动平移台使显微物镜25后焦面上的聚焦光斑刚好位于显微物镜25光轴上时，出射平行光垂直于显微物镜25表面出射(落式照明方式)，当移动平移台使显微物镜25后焦面上的聚焦光斑平移到物镜后孔径边缘某处时，可使出射平行光完全消失(全内反射照明方式)，当移动平移台使显微物镜25后焦面上的聚焦光斑介于显微物镜25光轴和物镜后孔径边缘某处之间时，出射平行光为斜入射照明方式。采用不同的照明方式时样品中被激发的荧光分子层厚度不同，所得图像信噪比也不同，可根据实际实验样品的特点和实验需求进行选择。

在一具体实施方式中，所述分束单元3包括：沿光路依次设置的荧光滤光片31、第二反射镜32、第一成像透镜33、可调光阑34、准直透镜35以及分束棱镜36；所述荧光滤光片31用于接收所述荧光信号，并对所述荧光信号中的串扰信号进行滤除；所述第二反射镜32用于接收滤除串扰信号后的荧光信号，并将所述荧光信号反射至所述第一成像透镜33；所述第一成像透镜33用于接收所述第二反射镜32反射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦至可调光阑34；所述可调光阑34用于接收所述第一成像透镜33聚焦的荧光信号，并对所述荧光信号的视场进行调节；所述准直透镜35用于接收调节视场后的荧光信号，并将所述荧光信号准直投射至所述分束棱镜36；所述分束棱镜36用于接收所述准直透镜35准直投射的荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号。其中，可调光阑34为两个方向独立可调的矩形光阑，位于第一成像透镜33的后焦面，准直透镜35的前焦面与第一成像透镜33的后焦面重合，如图2所示为可调光阑34处获得的宽场荧光图，其代表未使用信号通道单元时的结果图，图3为采用可调光阑34将成像视场限制为原来的1/4时的成像效果图。具体成像过程中，样品中荧光分子进入闪烁状态产生的荧光信号由显微物镜25收集后，依次经过第一二向色镜24、荧光滤光片31、第二反射镜32、第一成像透镜33、可调光阑34以及准直透镜35后，被5/5分束棱镜36均分成传播方向互相垂直的两束。

在一具体实施方式中，所述第一信号通道单元4除包括所述第一柱透镜41外，还包括第二透镜组，所述第二透镜组设置于所述分束单元3和所述第一柱透镜41之间，所述第二透镜组用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并对所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号的成像视场进行调节，防止视场中偏离中心较远的荧光分子发出的荧光信号在较远距离的传输过程中被阻挡，改善成像视场的大小和均匀性。所述第二透镜组包括第一透镜42和第二透镜43，所述第一透镜42的前焦面与所述第二透镜43的后焦面重合，所述第一透镜42与所述第二透镜43之间设置有第三反射镜44，所述第三反射镜44用于接收所述第一透镜42投射的荧光信号，并将所述荧光信号反射至所述第二透镜43。

在一具体实施方式中，所述第二信号通道单元5除包括所述第二柱透镜51外，还包括第三透镜组，所述第三透镜组设置于所述分束单元3和所述第二柱透镜51之间，所述第三透镜组用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并对所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号的成像视场进行调节，防止视场中偏离中心较远的荧光分子发出的荧光信号在较远距离的传输过程中被阻挡，改善成像视场的大小和均匀性。所述第三透镜组包括第三透镜52和第四透镜53，所述第三透镜52的前焦面与所述第四透镜53的后焦面重合，所述第三透镜52与所述第四透镜53之间设置有第四反射镜54，所述第四反射镜54用于接收所述第三透镜52投射的荧光信号，并将所述荧光信号反射至所述第四透镜53。

在一具体实施方式中，所述第二信号通道单元5与所述探测器6之间设置有第二成像透镜9，所述第二成像透镜9用于接收所述第二信号通道单元5投射的所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器6的第二区域进行成像。

在一具体实施方式中，入射至所述第一信号通道单元4的荧光信号与入射至所述分束棱镜36的荧光信号的传播方向相同，为了使入射至所述第一信号通道单元4的荧光信号能够顺利投射至所述探测器6的第一区域进行成像，所述第一信号通道单元4还包括：第五反射镜45，所述第五反射镜45设置于所述第二成像透镜9和所述第一柱透镜41之间，所述第五反射镜45用于接收所述第一柱透镜41投射的所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号反射至所述第二成像透镜9，所述第二成像透镜9还用于接收所述第五反射镜45反射的所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器6的第一区域进行成像，如图4所示为探测器6在没有荧光分子闪烁的情况下，采集的双通道宽场荧光图像。

具体地，在进行高密度三维单分子定位超分辨显微成像之前，所述第一信号通道单元4和所述第二信号通道单元5需要先严格校准，实际过程中可通过调整第三反射镜44和第四反射镜54的俯仰调节旋钮来进行校准，校准程度可通过计算正反向像散点扩散函数图像对的结构相似性进行验证。

图5为使用本发明实施例提供的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***获得的同一荧光分子在不同轴向位置(即深度)时正反向像散点扩散函数图像对的数值模拟结果。由图5可以看出，每一个荧光分子有两个二维点扩散函数图像与其相对应，且离焦程度越大，这两个二维点扩散函数图像的形状特征差异性越大。这样，在后续求解荧光分子的三维定位信息时，两个形状特征差异大的点扩散函数图像同时参与最优化计算，可显著提高定位的准确性。

在一具体实施方式中，本发明还提供一种上述所述高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的成像方法，如图6所示，所述方法包括步骤：

S1、将所述第一激光器产生的第一激光光束投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；

S2、将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；

S3、通过第一信号通道单元将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器的第一区域进行成像，以及通过第二信号通道单元将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器的第二区域进行成像；

S4、采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；

S5、根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息进行图像重构，得到样品的超分辨图像。

具体超分辨成像过程中，第一激光器产生的第一激光光束由荧光信号产生单元投射至样品面上，激发样品中的荧光分子进入闪烁状态产生荧光信号，然后由分束单元将所述荧光光束均分成传播方向互相垂直的两束荧光信号，接着由第一信号通道单元和第二信号通道单元分别将传播方向互相垂直的两束荧光信号投射至探测器的第一区域和第二区域分别进行成像，得到正反向像散点扩散函数图像对，最后由控制终端根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息进行图像重构，得到样品的超分辨图像。本实施例中由于第一信号通道单元和第二信号通道单元中分别包括取向相互正交的第一柱透镜和第二柱透镜，而两个正交柱透镜产生的一对正反向像散点扩散函数图像具有最大程度的形状差异，三维定位准确率高，且离焦程度越大，两个像散点扩散函数图像的形状差异越大，同时由于两个信号通道单元无需相互错开，有效探测范围大，在无需牺牲原有成像深度的前提下提高离焦荧光分子的三维定位精度，两个像散点扩散函数图像通过一个探测器同时采集，既节约成本，又保证了两个通道采集参数的一致性。

对样品进行超分辨成像之前，需要先确定感兴趣区域，所述感兴趣区域指轴向深度范围内有明显变化的样品区域，即能够凸显样品三维信息的区域，确定感兴趣区域的方法具体为：利用第一激光器自带的调节功能或采用衰减片或AOTF等将第一激光器的功率调低，然后利用探测器连续采集待测样品的双通道宽场荧光图像，通过移动载物台寻找感兴趣区域，并将感兴趣区域中样品轴向变化的较中间位置确定为焦面，以便使轴向范围成像完整。选择好区域和焦面后，将激光功率调高，使样品中的荧光分子快速漂白进入暗态后开始随机闪烁，利用探测器连续采集样品中处于亮态的荧光分子的正反向像散点扩散函数图像对，直到采集帧数达到一定要求或闪烁现象不再明显为止。对于常用的荧光分子，激光功率应控制在使激发功率密度处于3-5kW/cm²的范围为宜，由于成像时间较长，为防止***的轴向漂移，可开启***的防漂移功能。

在一具体实施方式中，步骤S5具体包括：

S51、根据预先确定的正交像散校准曲线，构造观测矩阵；

S52、根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及预先构建的损失函数，确定所述荧光分子的三维定位信息。

具体地，正交柱透镜像散成像得到的正反向像散点扩散函数图像对可以看成样品面上代表不同位置和强度荧光分子的δ函数的组合(称为“源信号”，记为X)与两组PSF分别卷积的结果，用矩阵的形式可以写成：y_k＝Φ_kX，其中k＝1,2分别对应第一信号通道单元和第二信号通道单元，Φ_k为第一信号通道单元和第二信号通道单元对应的观测矩阵。因此，本实施例在确定荧光分子的三维定位信息时，首先根据预先确定的正交像散校准曲线，构造观测矩阵；然后根据正反向像散点扩散函数图像对、观测矩阵以及预先构建的损失函数，确定荧光分子的三维定位信息。

在一具体实施方式中，所述正交像散校准曲线的确定方法包括：将平铺于盖玻片上的荧光珠作为待测样品放置于载物台上，荧光珠的浓度以每个成像通道视场中的荧光珠数量不少于10个且互不重叠为宜，仔细调整第一柱透镜和第二柱透镜的角度，使两个通道椭圆PSF的长轴分别在x和y方向上。然后利用LabVIEW编制的程序控制电动纳米位移台使显微物镜轴向移动，采集不同轴向位置处的双通道图像，即各荧光珠的正反向像散PSF图像对，然后根据各荧光珠的正反向像散PSF图像对确定正交像散校准曲线。例如：先微调显微物镜位置找到荧光珠所在平面(简称为焦面，其轴向位置记为z＝0)，此时两个通道得到的PSF均(近似)为圆形，然后控制显微物镜从焦面以下600纳米(记为z＝-600nm)开始，每移动10纳米采集5张图像，直到焦面以上600纳米(记为z＝600nm)处结束。最后利用Mathematica或Matlab编制的程序，将这一系列图像的PSF进行二维非对称高斯拟合，以获取各PSF在不同轴向位置时其x和y方向的宽度(即wx1、wy1和wx2、wy2)，并通过与对应的已知轴向位置(z)进行多项式拟合，得到4条校准曲线即正交像散校准曲线，如图7所示，所述正交像散校准曲线用于后续数据处理时对待测细胞样品图像进行轴向定位。

为了使定位更加精确，本实施例在根据正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定荧光分子的三维定位信息之前，先使用预先确定的图像配准参数对正反向像散点扩散函数图像对进行配准，再根据配准后的正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定荧光分子的三维定位信息。其中，所述图像配准参数的确定方法为：在第一信号通道单元和第二信号通道单元分别未包含第一柱透镜和第二柱透镜的情况下，采集平铺于盖玻片上的荧光珠的正反向像散点扩散函数图像对，并根据荧光珠的正反向像散点扩散函数图像对计算图像配准参数。

考虑到探测器对较弱的单分子荧光的探测过程存在涨落且满足泊松统计分布，本实施例中使用的损失函数采用泊松噪声模型构建，将对应通道k的泊松损失函数L(y_k|X)定义为源信号X根据探测器采集的正反向像散点扩散函数图像对y_1,2的负对数似然函数，即：

其中，(u,v)为图像的像素坐标，P代表概率，μ_k＝Φ_kX，即μ_k(u,v|X)为通道k中根据观测矩阵Φ_k得到的源信号X在像素(u,v)处的理想图像，β为与源信号无关的常数项。

在一具体实施方式中，步骤S52具体包括：

S521、获取已定位荧光分子对应的三维定位信息集，根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集，确定剩余图像；

S522、将所述剩余图像中各像素的强度值与预设阈值进行比较，当所述剩余图像中各像素的强度值不是均小于所述阈值时，根据所述剩余图像和预先构建的损失函数确定下一个未定位荧光分子对应的三维定位信息，将所述三维定位信息加入所述三维定位信息集，并继续执行根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集确定剩余图像的步骤，直至所述剩余图像中各像素的强度值均小于所述阈值；

S523、将所述三维定位信息集中各三维定位信息确定为所述荧光分子的三维定位信息。

所述三维定位信息集中包括若干已定位荧光分子对应的三维定位信息，所述三维定位信息包括坐标信息和强度值信息，本实施例在确定荧光分子的三维定位信息时，首先获取已定位荧光分子对应的三维定位信息集，即已定位荧光分子对应的坐标信息和强度值信息，根据已定位荧光分子对应的三维定位信息集和观测矩阵生成双通道无噪声理想图像(即μ_1,2)，并将正反向像散点扩散函数图像对与对应的双通道无噪声理想图像相减，得到剩余图像，其中，所述剩余图像对应的源信号为剩下的尚未被定位的荧光分子，记为

进一步地，确定剩余图像后，将剩余图像中各像素的强度值与预设阈值进行比较，当剩余图像中各像素的强度值不是均小于所述阈值时，根据剩余图像和预先构建的损失函数确定下一个未定位荧光分子对应的三维定位信息。其中，下一个未定位荧光分子对应的三维定位信息包括坐标信息和强度信息，坐标信息θ_L＝(θ_x,θ_y,θ_z)的计算公式为强度值θ_I的计算公式为/>其中，S为双通道图像的图像尺寸，为剩余图像上的强度值。

确定下一个未定位荧光分子对应的三维定位信息后，将所述三维定位信息加入所述三维定位信息集，并继续执行根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集确定剩余图像的步骤，直至所述剩余图像中各像素的强度值均小于所述阈值，并将所述三维定位信息集中各三维定位信息确定为所述荧光分子的三维定位信息。其中，所述荧光分子的三维定位信息包括位置信息和强度值信息，获取到三维定位信息后，将位置信息和强度值信息进行重构，即得到样品的超分辨图像。

为了加快荧光分子的三维定位信息，本实施例在迭代收敛过程中，分别计算双通道图像的泊松损失函数在x,y,z和强度I四个方向的偏导数，即：其中，j＝x,y,z,I。然后，通过将两个通道得到的偏导数叠加，确定减小损失函数的方向，并利用回溯搜索来确定步长。

为了定量评估本发明所提高密度三维单分子定位超分辨显微成像***和方法的性能，这里以获得的正交像散校准曲线为基础进行模拟实验和分析。在模拟实验过程中，利用正交像散校准曲线产生一系列位置随机的PSF以模拟本发明所提高密度三维单分子定位超分辨显微成像***中探测器采集的正反向像散点扩散函数图像对，然后利用本发明提出的算法进行定位。图8给出了模拟实验产生的单帧正反向像散点扩散函数图像对，其中黑色小叉表示随机生成的“分子”的横向位置，纵向位置则体现在PSF的形状上，其三维位置坐标均是已知的。图9给出了利用本发明提出的算法进行定位的结果，其中黑色小叉与图8中的相同，仍代表模拟图像中“分子”的真实横向位置；虚线的黑色椭圆代表根据已知的纵向位置和校准曲线得到的PSF形状；白色小圆圈的中心代表定位得到的横向位置，其与黑色小叉中心错开的程度直观展示了横向定位的准确性；实线的白色椭圆代表根据定位结果的纵向位置与校准曲线得到的PSF形状，其与黑色椭圆的差异程度直观展示了横向和纵向定位的准确性。从图中可以明显看出，定位的结果非常准确，定位得到的PSF位置和形状均与两个通道的“真实”PSF吻合得很好。

作为对比，图10给出了采用单个柱透镜像散成像并利用相同算法获得的定位结果。对比图9和图10可以明显看出，采用正交柱透镜像散方法可显著提高定位准确性，尤其是在两个PSF中心距离较近，或PSF椭圆度较高的情况下(如图10中白色箭头所指)，准确定位的优势都要更加明显，说明本发明所提技术和方法适用于处理较高密度数据，且对于离焦较远的分子会有更好的定位效果。

为定量分析定位性能，可产生若干帧模拟闪烁图像并重复上述定位过程，计算各“分子”的定位坐标与真实坐标之间的均方根误差(RMSE)，以定量描述定位的准确性(通常称为“准确度”或“定位精度”)。图11～图14给出了不同轴向位置的“分子”其定位结果在各个方向(即x方向、y方向、xy方向和z方向)的RMSE统计结果，并与单个柱透镜的结果进行对比。模拟实验中同一帧闪烁图像不同“分子”的横向位置设置为随机。但轴向位置设置为相同(如200nm),激发密度固定为1/μm²，每个数据点(对应一个轴向位置)累计定位1000个“分子”。从图中可以明显看出，采用本发明所提的正交柱透镜方法，相比单个柱透镜的方法，离焦“分子”在三个方向的定位准确性均有显著提高，进一步验证了前面提到的该方法对于离焦较远的分子会有更好的定位效果的结论。除了RMSE，图15和图16还分别给出了定位召回率和错误率的比较结果，同时可以看到本发明所提超分辨显微成像***要明显优于单个柱透镜的方法。图17～图22则给出了不同“分子”密度数据的定位性能比较情况，可以定量地看到，本发明所提超分辨显微成像***和方法在高密度数据中的定位性能也有显著提高，说明本发明所提超分辨显微成像***和方法适用于高密度数据的处理。

综上所述，本发明提供了一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***及方法，包括：第一激光器、荧光信号产生单元、分束单元、第一信号通道单元、第二信号通道单元、探测器以及控制终端；其中，所述第一信号通道单元包括第一柱透镜，所述第二信号通道单元包括第二柱透镜，所述第一柱透镜和所述第二柱透镜的取向相互正交；所述荧光信号产生单元用于将所述第一激光器产生的第一激光光束投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；所述分束单元用于接收所述荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；所述第一信号通道单元用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器的第一区域进行成像；所述第二信号通道单元用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器的第二区域进行成像；所述探测器用于采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；所述控制终端用于根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息重构超分辨图像。本发明将荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号后，通过取向相互正交的两个柱透镜将传播方向互相垂直的两束荧光信号分别投射至同一探测器的不同区域进行成像，三维定位准确率高，有效探测范围大。

应当理解的是，本发明的***应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其特征在于，包括：第一激光器、荧光信号产生单元、分束单元、第一信号通道单元、第二信号通道单元、探测器以及控制终端；其中，所述第一信号通道单元包括第一柱透镜，所述第二信号通道单元包括第二柱透镜，所述第一柱透镜和所述第二柱透镜的取向相互正交；

所述荧光信号产生单元用于将所述第一激光器产生的第一激光光束投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；

所述分束单元用于接收所述荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；

所述第一信号通道单元用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器的第一区域进行成像；

所述第二信号通道单元用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器的第二区域进行成像；

所述探测器用于采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；

所述控制终端用于根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息进行图像重构，得到样品的超分辨图像；

所述荧光信号产生单元包括：第一透镜组、第一提升镜组、管镜、第一二向色镜以及显微物镜；

所述第一透镜组用于接收所述第一激光器产生的第一激光光束，并对所述第一激光光束进行扩束准直；

所述第一提升镜组用于接收扩束准直后的第一激光光束，并将所述第一激光光束的高度提升后反射至所述管镜；

所述管镜和所述第一二向色镜用于将所述第一提升镜组反射的第一激光光束投射至所述显微物镜；

所述显微物镜用于接收所述管镜和所述第一二向色镜投射的第一激光光束，并将所述第一激光光束以平行光的形式投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；

所述分束单元包括：荧光滤光片、第二反射镜、第一成像透镜、可调光阑、准直透镜以及分束棱镜；

所述荧光滤光片用于接收所述荧光信号，并对所述荧光信号中的串扰信号进行滤除；

所述第二反射镜用于接收滤除串扰信号后的荧光信号，并将所述荧光信号反射至所述第一成像透镜；

所述第一成像透镜用于接收所述第二反射镜反射的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦至可调光阑；

所述可调光阑用于接收所述第一成像透镜聚焦的荧光信号，并对所述荧光信号的视场进行调节；

所述准直透镜用于接收调节视场后的荧光信号，并将所述荧光信号准直投射至所述分束棱镜；

所述分束棱镜用于接收所述准直透镜准直投射的荧光信号，并将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号。

2.根据权利要求1所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其特征在于，所述荧光信号产生单元还包括第一衰减片，所述第一衰减片设置于所述第一激光器和所述第一透镜组之间；

所述第一衰减片用于接收所述第一激光器产生的第一激光光束，并对所述第一激光光束的功率进行调节。

3.根据权利要求2所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其特征在于，所述***还包括：第二激光器；所述荧光信号产生单元还包括：第一反射镜和第二二向色镜；所述第二二向色镜设置于所述第一衰减片和所述第一透镜组之间；

所述第二激光器用于产生第二激光光束；

所述第一反射镜用于接收所述第二激光光束，并将所述第二激光光束反射至所述第二二向色镜；

所述第二二向色镜用于接收所述第一反射镜反射的第二激光光束，并将所述第二激光光束与所述第一激光光束合束后投射至所述样品面，以使所述样品中处于暗态的荧光分子进入闪烁状态。

4.根据权利要求3所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其特征在于，所述荧光信号产生单元还包括：第二衰减片；所述第二衰减片设置于所述第二激光器与所述第一反射镜之间；

所述第二衰减片用于接收所述第二激光器产生的第二激光光束，并对所述第二激光光束的功率进行调节。

5.根据权利要求1所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***，其特征在于，所述第一信号通道单元还包括：第二透镜组；所述第二信号通道单元还包括：第三透镜组；

所述第二透镜组用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号，并对所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号的成像视场进行调节；

所述第三透镜组用于接收所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号，并对所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号的成像视场进行调节。

6.一种如权利要求1～5任一项所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像***的成像方法，其特征在于，包括：

将所述第一激光器产生的第一激光光束投射至样品面，激发样品中的荧光分子产生荧光信号；

将所述荧光信号分成传播方向互相垂直的两束荧光信号；

通过第一信号通道单元将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的一束荧光信号投射至所述探测器的第一区域进行成像，以及通过第二信号通道单元将所述传播方向互相垂直的两束荧光信号中的另一束荧光信号投射至所述探测器的第二区域进行成像；

采集所述传播方向互相垂直的两束荧光信号，生成正反向像散点扩散函数图像对；

根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息，并根据所述三维定位信息进行图像重构，得到样品的超分辨图像。

7.根据权利要求6所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像方法，其特征在于，所述根据所述正反向像散点扩散函数图像对以及预先确定的正交像散校准曲线确定所述荧光分子的三维定位信息的步骤包括：

根据预先确定的正交像散校准曲线，构造观测矩阵；

根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及预先构建的损失函数，确定所述荧光分子的三维定位信息。

8.根据权利要求7所述的高密度三维单分子定位超分辨显微成像方法，其特征在于，所述根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及预先构建的损失函数，确定所述荧光分子的三维定位信息的步骤包括：

获取已定位荧光分子对应的三维定位信息集，根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集，确定剩余图像；

将所述剩余图像中各像素的强度值与预设阈值进行比较，当所述剩余图像中各像素的强度值不是均小于所述阈值时，根据所述剩余图像和预先构建的损失函数确定下一个未定位荧光分子对应的三维定位信息，将所述三维定位信息加入所述三维定位信息集，并继续执行根据所述正反向像散点扩散函数图像对、所述观测矩阵以及所述三维定位信息集确定剩余图像的步骤，直至所述剩余图像中各像素的强度值均小于所述阈值；

将所述三维定位信息集中各三维定位信息确定为所述荧光分子的三维定位信息。