CN113929706B

CN113929706B - 一种具有抗癌作用的化合物

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Publication number: CN113929706B
Application number: CN202010606686.4A
Authority: CN
Inventors: 肖友利; 范震; 杰斯·艾美特
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: CN113929706A

Abstract

本发明公开了一种具有抗癌作用的化合物，其分子结构如式I所示，本发明的化合物1可用于制备抗癌药物：

Description

一种具有抗癌作用的化合物

技术领域

本发明属于药物领域，涉及一种具有抗癌作用的化合物，具体涉及一种一叶萩生物碱fluesuffine A、制备方法及其在制备抗癌药物中的用途。

背景技术

一叶萩(学名：Flueggea suffruticosa(Pall.)Baill.)为大戟科叶底珠属植物，在我国分布较为广泛，全国除西北没有发现外，其他各省区均有分布，一叶萩在传统中药用于治疗麻痹症、神经衰弱、嗜睡等多种神经相关疾病。一叶萩中含有丰富的一叶萩生物碱，被认为是一叶萩植物的生物活性成分，一叶萩中主要生物碱成分为一叶萩碱，一叶萩碱是被用来治疗小儿麻痹后遗症的药物，近些年从一叶萩中又分离到一些结构新颖的活性化合物，并且这些新化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和中枢神经等多种活性。对一叶萩中生物碱的研究能够从中发现更多的生物活性成分，对这一中药植物资源更充分的开发利用。

发明内容

我们对一叶萩中的一些生物碱成分进行了提取、分离和鉴定，分离得到一个结构新颖的一叶萩生物碱，具有下述式1所示的分子结构，将其命名为fluesuffine A：

对一叶萩生物碱的生物合成路径研究发现，我们从一叶萩植株中分离出的一种BBE家族的氧化酶FsBBE催化了L-抗坏血酸(L-ascorbic acid，L-AA)或者去氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid，DHA)与别一叶萩碱发生氧化缩合反应，生成了化合物1：

我们还对化合物1的生理活性进行了研究，发现其可以显著抑制肿瘤细胞SF-268、MCF-7、HePG-2、A549和LX-2的增殖，提示该化合物1能够用于抗癌。这些研究发现构成了本发明的基础。具体而言，本发明包括以下技术方案。

一种具有抗癌作用的化合物，其分子结构如式1所示。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述化合物1的方法，主要包括以下步骤：用有机溶剂从一叶萩的枝和/或叶中提取得到。

上述方法例如包括以下步骤：

A.采用乙醇对一叶萩的枝/叶进行抽提，乙醇相蒸馏浓缩后，得乙醇提取物；

B.将乙醇提取物用pH6.0左右的稀盐酸水溶液重悬，用乙酸乙酯萃取；水层用氨水调pH大约为8.0后，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，蒸馏浓缩后得总生物碱；

C.将总生物碱过硅胶柱进行层析分离，收集主要包含化合物1的流分；

D.从步骤C得到的流分中分离出化合物1并纯化。

在一种具体的实施方式中，上述方法包括以下步骤：

A.采用乙醇对烘干后的一叶萩枝/叶粉碎物进行抽提，比如对于1.8kg干重，用5升乙醇反复超声提取4次，乙醇相蒸馏浓缩后，得乙醇提取物；

B.将乙醇提取物用pH6.0左右的稀盐酸水溶液重悬，用等体积乙酸乙酯萃取三次；水层用氨水调pH大约为8.0后，再用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，蒸馏浓缩后得总生物碱；

C.用CH₂Cl₂:MeOH混合溶剂作为流动相将总生物碱过硅胶柱进行层析分离，收集主要包含化合物1的流分；

D.从步骤C得到的流分中分离出化合物1并纯化。

作为另一种实施方式，制备化合物1的方法包括以下步骤：

以L-抗坏血酸或者去氢抗坏血酸和别一叶萩碱为底物原料，在一叶萩来源的BBE家族的氧化酶FsBBE催化下通过氧化缩合反应来制备一化合物1。

优选地，上述氧化酶FsBBE的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MNPLKHSSSTPLVFVLLTVCSCATSVTIPELFFQCLSNTTTTSTSIFNVLYTPRNTSYTSILESRIQNLRFNTTDTPKPLAIVTPLDASHIQATIICARKHNLQIRIRSGGHDYEGLSYVSPLPFVVLDLINLRNITVDVENRVAWVGCGATLGEFYYRIAEKTRTLAFPAGACPTVGVGGHFSGGGYGYLLRKFGLAADNILDASLVDVNGRILDRASMGEDLFWAIRGGGGNSFGVVIAWKVNLVPVPSTLTSFKVSKSLEQNTMIQLLNKWQYVANKLPDELSMFAVVSKKNSTISVKFYSLYVGGIDSLLPLMEERFPELGLKRADCNEMSWIESAVSFAGYASNTSLDVLLNHTNNYEIASGRFKGKSDFVKEPVPEAALEGLLKWLSDKDITNAAIYMVPLGGKMGEITETSIPFPHRAGNLYLLAYYVKWEGQGTEAAQKPLSWIRKGYKYMAPYVSKNPREAHLNDRDLDIGTNNISGNTSYEQASIWGTKYFKNNFDRLVRVKTSVDPSDFFRNEQSVPPLLS(SEQ IDNO::1)。

在具体操作中，作为生物催化剂的氧化酶FsBBE既可以是粗酶比如一叶萩叶总蛋白，也可以是纯化的氧化酶FsBBE，还可以是用微生物比如大肠杆菌工程菌表达的氧化酶FsBBE。

本发明的另一目的在于提供一种化合物1在制备抗癌药物中的用途。

例如，所述的癌选自神经癌、乳腺癌、肝癌、肺癌。

在上述抗癌药物中，化合物1作为主要活性药物成分。

可选地，上述抗癌药物可以为药物组合物，除了作为药物活性成分的化合物1外，还包含至少一种辅助治疗剂；或者化合物1与至少一种辅助治疗剂联合施用。

上述辅助治疗剂可以选自抗肿瘤药物、免疫调节剂等。

在另一实施方式中，所述联合施用包括共同施用、或序贯施用。

上述抗癌药物的剂型可以选自口服剂、注射剂、静脉注射剂、栓剂、吸入剂、或外用剂。

实验表明，本发明的化合物1能够显著抑制肿瘤细胞SF-268、MCF-7、HePG-2、A549和LX-2的增殖，提示该化合物1能够用于抗癌。本发明的化合物1对神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HePG-2、非小细胞肺癌细胞A549和肝星形细胞LX-2这些肿瘤细胞具有显著的生长抑制活性，为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用中药植物资源提供了科学依据。

附图说明

图1是化合物1的结构与二维核磁分析图；

图2是化合物1的X-ray确定的绝对构型图；

图3是化合物1的¹H-NMR谱；

图4是化合物1的¹³C-NMR谱；

图5是化合物1的DEPT 135谱；

图6是化合物1的HSQC谱；

图7是化合物1的¹H-¹H COSY谱；

图8是化合物1的HMBC谱；

图9是化合物1的NOESY谱；

图10是化合物1的HRESIMS谱。

具体实施方式

为了分析和鉴定一叶萩中的生物碱成分，我们通过有机溶剂比如乙醇、乙酸乙酯对一叶萩的枝和叶进行萃取，所得总生物碱经过硅胶柱层析，并经半制备高效液相进行分离，得到了化合物1。采用波谱分析，包括高分辨电喷雾电离质谱(HRESIMS)、¹H和¹³C-NMR结合二维核磁共振、红外(IR)等，确定了其分子结构，并通过X光衍射确定了其绝对构型。

考虑到近些年从一叶萩中分离到的一些新化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌或者中枢神经等多种活性，我们重点研究了化合物1是否具有抗肿瘤的生理活性，并用抗肿瘤药顺铂作为阳性对照来考察化合物1对数种肿瘤细胞系的生长抑制性。该对比试验显示出化合物1的抗多种肿瘤的活性，从而有潜力开发成抗癌药物。

当用于制备抗癌药物时，化合物1可以是单一组分，也可以与其他物质组成混合物。

本发明的药物可以制成本领域技术人员公知的常规剂型，选择的制备方法取决于预期的给药途径。例如，作为口服给药药物，可以呈片剂、胶囊、微胶囊、丸剂、微丸剂、粉剂、缓释调配物、溶液、悬浮液形式；作为无菌溶液、悬浮液或乳液用于非经肠注射；作为贴剂、软膏或乳霜用于局部(如皮肤)投予或作为栓剂用于直肠投予；本发明剂型还包括眼内用药剂型，如凝胶剂、膏剂；本发明剂型还包括适用于静脉给药、腹腔给药、局部冲洗或灌洗、或颅内给药形式的液体制剂(包括预充针)、粉剂等。在另外一些实施方式中，药物呈适于单次投予准确剂量的单位剂型。

当本发明的抗癌药物为固体药物组合物时，该药物组合物可以包括药学上可接受的载体。其中可接受的载体包括有佐剂、赋形剂、防腐剂、吸收延迟剂、填充剂、粘合剂、吸附剂、pH缓冲剂、崩解剂、增溶剂、香味剂、其它载剂、其它惰性成份、或其组合。这些药学上可接受的载体的具体种类和用量可以由技术人员根据本领域公知常识来筛选、或者通过简单实验来确定。这些药学上可接受的载体不应当影响化合物1的药理活性或者导致药物不良反应。

当药物剂型是为注射剂时，其可以制备成注射用溶液或者冻干粉针剂。当制备成冻干粉针剂时，可以加入冻干保护剂，该冻干保护剂可以选自麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、或者它们两种以上的混合物。

本发明还可以提供含有作为活性成分的本发明化合物的控释/缓释药物制剂，其中控制和调节活性成分的释放的节律和速度以允许较少频率给药或改善给定活性成分的药代动力学或毒性特征。

本发明药物通常为单一剂量单位，即单元剂量，而在其他实施方案中可以存在多个单位剂量，例如特定方案或临床情况下所需的剂量单位的数量。

以下结合具体实施例及附图，对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中，如果对于实验操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(10-30℃)。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指重量百分含量。

本文中在表述数值特征时，术语“约”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。

除非另行定义，本发明所出现的数词范围包含该数词以及该范围中的任意数。

实施例1化合物1的分离和鉴定

1.1一叶萩生物碱的提取与分离

一叶萩茎和叶，2017年9月购买于河南南阳，由中国科学院上海辰山植物科学研究中心严岳鸿研究员鉴定。

一叶萩枝和叶干重共1.8kg，研磨机研碎后，用5升乙醇反复超声提取4次，乙醇相蒸馏浓缩后，得乙醇提取物，乙醇提取物用1L pH 6.0的稀盐酸水溶液重悬，等体积乙酸乙酯萃取三次，水层用氨水调pH为8.0后，再用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，蒸馏浓缩后得总生物碱27.0g，总生物碱以CH₂Cl₂:MeOH＝100:0,30:1,20:1,15:1,10:1,7:1,4:1,2:1,1:1,0:1为流动相过硅胶柱分离，TLC检测，合并相似流分，得8个组分：F1-F8，组分F5再用半制备高效液相进行分离，用Luna C18半制备型色谱柱(250×10mm,5μm)，以流动相：甲醇：0.1％甲酸水＝5:95-25:75，0-10min；25:75-25:75，10-15min；25:75-95:5，15-25min；95:5,25-30min梯度洗脱，分离得化合物1(t_R＝22.5min)。化合物1溶解在氘代氯仿中进行核磁鉴定，在溶剂乙酸乙酯：甲醇＝7:1的条件下，室温缓慢蒸发得到化合物1的单晶，单晶进行X光衍射来确定其绝对构型。

1.2化合物1分离与结构鉴定

分离得到的化合物1为淡黄色固体，HRESIMS(高分辨电喷雾电离质谱)m/z[M+H]⁺390.1183，显示其分子式为C₁₉H₁₉NO₈，不饱和度为11。IR谱显示羟基(3452cm^-1)，羰基(1745cm^-1)和双键的(2943cm^-1、1441cm^-1和1378cm^-1)吸收。¹H和¹³C-NMR结合二维核磁谱图显示(参见表1)，化合物1有两个脂或酰胺羰基(δ_C 171.4,174.3)，1个sp²季碳δ_C 163.7，3个sp²次甲基(δ_C/H 148.8/7.05,122.4/6.57,111.3/5.86)，4个较低场的sp³季碳(δ_C112.3,101.5,93.1,80.4)，4个sp³次甲基(δ_C/H 90.9/5.05,74.4/4.52,56.5/3.92,37.0/2.11)，其中一个位于较低场的次甲基，5个sp³亚甲基(表1.3.1)。将上述数据与报道的一叶萩中分离到的生物碱核磁数据进行比对显示，化合物1中包含allosecurinine或securinine骨架结构的混源二聚体。详细的分析化合物1的二维核磁谱图显示，化合物1的平面结构为式1，化合物1中拥有8个手性碳原子，其中有4个是季碳。经过多次尝试，我们很幸运地得到了能够确定该化合物绝对构型质量的单晶，单晶衍射结果显示该化合物为2R,3R,7S,9S,2’S,3’R,4’R,和6’S构型。我们将化合物1命名为fluesuffine A。

表1、化合物1的¹H谱和¹³C NMR数据

图1显示了化合物1的结构与二维核磁分析图；图2显示了化合物1的X-ray确定的绝对构型图；图3显示了化合物1的¹H-NMR谱；图4显示了化合物1的¹³C-NMR谱；图5显示了化合物1的DEPT 135谱；图6显示了化合物1的HSQC谱；图7显示了化合物1的¹H-¹H COSY谱；图8显示了化合物1的HMBC谱；图9显示了化合物1的NOESY谱；图10显示了化合物1的HRESIMS谱。

实施例2化合物1的抗肿瘤活性测试

采用SRB法(Skehan P.et al.1990)测试化合物1(fluesuffine A)对肿瘤细胞的生长抑制活性。

肿瘤细胞株为神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HePG-2、非小细胞肺癌细胞A549和肝星形细胞LX-2。

实验方法：将化合物1用二甲基亚砜(DMSO)溶解得浓度为10mmol/L的母液，再用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度，阳性对照药物为顺铂。取对数生长期的SF-268、MCF-7、HepG-2、A549和LX-2细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜RPMI-1640培养基调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL一定浓度的化合物溶液，阴性对照加20μL RPMI-1640培养基，以顺铂作阳性对照。置37℃、5％CO₂培养箱中培养72h后，加入50μL 50％冷三氯醋酸固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的浓度为4mg/mL的SRB溶液100μL/孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次。最后加入200μL/孔10mmol/mL的Tris溶液溶解，用酶标仪测定570nm处的吸光值(A)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-A_样品组/A_对照组)×100％。

实验结果：本发明制备的化合物1和阳性对照药物顺铂对肿瘤细胞株SF-268、MCF-7、HePG-2、A549和LX-2的IC₅₀值见表2。

表2、化合物1对肿瘤细胞生长的抑制活性(n＝3)

结果表明：化合物1对多种肿瘤细胞具有显著的生长抑制活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用中药植物资源提供了科学依据。

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种具有抗癌作用的化合物

<130> SHPI2010291

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 532

<212> PRT

<213> Flueggea suffruticosa (Pall.) Baill.

<400> 1

Met Asn Pro Leu Lys His Ser Ser Ser Thr Pro Leu Val Phe Val Leu

1 5 10 15

Leu Thr Val Cys Ser Cys Ala Thr Ser Val Thr Ile Pro Glu Leu Phe

20 25 30

Phe Gln Cys Leu Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ile Phe Asn

35 40 45

Val Leu Tyr Thr Pro Arg Asn Thr Ser Tyr Thr Ser Ile Leu Glu Ser

50 55 60

Arg Ile Gln Asn Leu Arg Phe Asn Thr Thr Asp Thr Pro Lys Pro Leu

65 70 75 80

Ala Ile Val Thr Pro Leu Asp Ala Ser His Ile Gln Ala Thr Ile Ile

85 90 95

Cys Ala Arg Lys His Asn Leu Gln Ile Arg Ile Arg Ser Gly Gly His

100 105 110

Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Val Ser Pro Leu Pro Phe Val Val Leu

115 120 125

Asp Leu Ile Asn Leu Arg Asn Ile Thr Val Asp Val Glu Asn Arg Val

130 135 140

Ala Trp Val Gly Cys Gly Ala Thr Leu Gly Glu Phe Tyr Tyr Arg Ile

145 150 155 160

Ala Glu Lys Thr Arg Thr Leu Ala Phe Pro Ala Gly Ala Cys Pro Thr

165 170 175

Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Tyr Leu Leu

180 185 190

Arg Lys Phe Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile Leu Asp Ala Ser Leu Val

195 200 205

Asp Val Asn Gly Arg Ile Leu Asp Arg Ala Ser Met Gly Glu Asp Leu

210 215 220

Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Asn Ser Phe Gly Val Val Ile

225 230 235 240

Ala Trp Lys Val Asn Leu Val Pro Val Pro Ser Thr Leu Thr Ser Phe

245 250 255

Lys Val Ser Lys Ser Leu Glu Gln Asn Thr Met Ile Gln Leu Leu Asn

260 265 270

Lys Trp Gln Tyr Val Ala Asn Lys Leu Pro Asp Glu Leu Ser Met Phe

275 280 285

Ala Val Val Ser Lys Lys Asn Ser Thr Ile Ser Val Lys Phe Tyr Ser

290 295 300

Leu Tyr Val Gly Gly Ile Asp Ser Leu Leu Pro Leu Met Glu Glu Arg

305 310 315 320

Phe Pro Glu Leu Gly Leu Lys Arg Ala Asp Cys Asn Glu Met Ser Trp

325 330 335

Ile Glu Ser Ala Val Ser Phe Ala Gly Tyr Ala Ser Asn Thr Ser Leu

340 345 350

Asp Val Leu Leu Asn His Thr Asn Asn Tyr Glu Ile Ala Ser Gly Arg

355 360 365

Phe Lys Gly Lys Ser Asp Phe Val Lys Glu Pro Val Pro Glu Ala Ala

370 375 380

Leu Glu Gly Leu Leu Lys Trp Leu Ser Asp Lys Asp Ile Thr Asn Ala

385 390 395 400

Ala Ile Tyr Met Val Pro Leu Gly Gly Lys Met Gly Glu Ile Thr Glu

405 410 415

Thr Ser Ile Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Asn Leu Tyr Leu Leu Ala

420 425 430

Tyr Tyr Val Lys Trp Glu Gly Gln Gly Thr Glu Ala Ala Gln Lys Pro

435 440 445

Leu Ser Trp Ile Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Met Ala Pro Tyr Val Ser

450 455 460

Lys Asn Pro Arg Glu Ala His Leu Asn Asp Arg Asp Leu Asp Ile Gly

465 470 475 480

Thr Asn Asn Ile Ser Gly Asn Thr Ser Tyr Glu Gln Ala Ser Ile Trp

485 490 495

Gly Thr Lys Tyr Phe Lys Asn Asn Phe Asp Arg Leu Val Arg Val Lys

500 505 510

Thr Ser Val Asp Pro Ser Asp Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Val Pro

515 520 525

Pro Leu Leu Ser

530

Claims

1.一种具有抗癌作用的化合物，其分子结构如式1所示：

2.一种制备权利要求1中所述化合物1的方法，其特征在于，用有机溶剂从一叶萩的枝和/或叶中提取得到，包括以下步骤：

B.将乙醇提取物用pH 6.0的稀盐酸水溶液重悬，用乙酸乙酯萃取；水层用氨水调pH为8.0后，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，蒸馏浓缩后得总生物碱；

D.从步骤C得到的流分中分离出化合物1并纯化。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.采用乙醇对烘干后的一叶萩枝/叶粉碎物进行抽提，乙醇相蒸馏浓缩后，得乙醇提取物；

B.将乙醇提取物用pH6.0的稀盐酸水溶液重悬，用等体积乙酸乙酯萃取三次；水层用氨水调pH为8.0后，再用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，蒸馏浓缩后得总生物碱；

D.从步骤C得到的流分中分离出化合物1并纯化。

4.一种制备权利要求1中所述化合物1的方法，包括以下步骤：

以L-抗坏血酸或者去氢抗坏血酸和别一叶萩碱为底物原料，在一叶萩来源的BBE家族的氧化酶FsBBE催化下通过氧化缩合反应来制备化合物1，

所述氧化酶FsBBE的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

5.根据权利要求1所述的化合物1在制备抗癌药物中的用途。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的癌选自神经癌、乳腺癌、肝癌、肺癌。

7.一种抗癌药物，其包含权利要求1中所述的化合物1作为活性药物成分。

8.根据权利要求7所述的抗癌药物，其特征在于，所述抗癌的剂型选自口服剂、注射剂、静脉注射剂、栓剂、吸入剂、或外用剂。