CN113929599B - 一种精确嵌段聚合物纳米组装体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种精确嵌段聚合物纳米组装体及其制备方法。本发明采用式Ⅰ所示结构的精确两亲性嵌段聚合物为基体，通过调整疏水链段的长度及序列结构，配合其它操作及条件控制，能够形成可控纳米组装体‑‑球状胶束和/或棒状胶束结构；且所得纳米组装体分散度低、稳定性好，均一性和重复性好，分子量单一，便于用质谱定量该聚合物对应的纳米粒子在活体内的生物分布。本发明提供的制备方法简单易行，且使产物重复性好。

Description

一种精确嵌段聚合物纳米组装体及其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米生物材料领域，特别涉及一种精确嵌段聚合物纳米组装体及其制备方法。
背景技术
自纳米技术问世以来，大量的工作致力于纳米材料的制备及其应用的研究。其中一个重要的应用方面就是纳米生物材料，通过不同的方法构筑特定物理性质(如刚性，尺寸和形状等)的纳米材料来研究其在生物体内的代谢及分布情况，或赋予其特定的功能应用于疾病的诊断或治疗。
纳米材料的构筑方法主要有“自上而下(top-down)”和“自下而上(bottom-up)”两种方法。两种方法的区别在于创建纳米尺寸结构的过程，在自下而上的方法中，纳米级材料是由原子或分子的前体构成的，它们可以反应并按尺寸生长，或者自组装成更复杂的结构；相比之下，自上向下方法是通过控制从较大固体中去除材料的方式来雕刻纳米级结构。在过去的几十年中，目睹了自上而下的方法在在纳米级结构制造中特别是微电子工业中的广泛使用，但是其中也存在不足，比如需要巨大的设备投资，操作流程复杂，高能耗，在制备100nm以下的粒子方面存在挑战等。而与自上而下技术相反，自下而上方法制备合成纳米结构已经被广泛应用于生物材料领域，制备不同结构的组装体如脂质体囊泡，聚合物球状，棒状胶束，囊泡等。
嵌段共聚物能够组装形成多功能、结构可控的诸多纳米结构，使其能够应用于很多领域如药物递送及纳米光刻。通过改变嵌段聚合物结构单元化学组成及链段长度，可设计出具有新特性和可调结构的新材料。嵌段聚合物通过性质相差较大嵌段的不混溶推动本体相分离可形成具有长周期结构，或者在选择性溶剂中由于其中一部分链段与溶剂分子的不利相互作用促进形成胶体纳米结构。在生物医学应用中，精确控制纳米材料的形状，大小及稳定性至关重要。但由于嵌段聚合物的多分散特性，导致其组装结构具有不可控，大小不均一，重复性差等特点，因此消除嵌段共聚物的多分散性，发展单分子的嵌段共聚物的组装十分重要。
近来，研究人员逐渐发现粒子形状和大小可以影响很多生物过程，例如粒子在生物体的器官分布和血液循环，粒子与细胞的相互作用等。最近的报导表明蠕虫状纳米胶束能够增加在肿瘤中的富集效率(Nat.Biotechnol.2015,33(9),941-951)。另外，盘状纳米粒子相对于球形粒子具有更长的血液循环时间和更高的组织特异性(Biomaterials 2005,26:3759-3769)。此外，比较研究棒状纳米粒子发现，高纵横比的棒状纳米粒子进细胞比纵横比小的粒子快(Proc.Natl Acad.Sci.USA 2008,105:11613-11618)。一些嵌段聚合物组装得到的长度达细胞直径的蠕虫状纳米粒子比球形粒子具有更长的血液循环时间(NatureNanotechnology 2007,2:249-255)。而且，在生物医学领域，非球形粒子与一些球形纳米粒子，还具有很多意想不到的优异功能。通过精确嵌段聚合物结构精确可调的特点，理论上可实现对纳米组装体的物理及化学性质的确切调控，对于纳米材料在生物医学中的发展有很大的推动作用。
但是对于嵌段聚合物纳米组装体的获得以及达到好的制备效果(如重复性好、大小均一等)，并不容易实现，与嵌段聚合物的种类、制备方法等密切相关，但还没有成熟的技术规律，因此，如何较好的制备纳米组装体成为业内广泛关注的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种精确嵌段聚合物纳米组装体及其制备方法。本发明提供的精确嵌段聚合物纳米组装体均一性和稳定性好。本发明提供的制备方法简单易行，且使产物重复性好。
本发明提供了一种精确嵌段聚合物纳米组装体，所述嵌段聚合物具有式Ⅰ所示结构：
Figure BDA0002575040060000021
Figure BDA0002575040060000031
其中，
n为选自1～12的整数；
R＝R1＝H、F或Cl；
或
R＝H，R1＝NO2、CnH2n+1、F、Cl、Br或I；
所述纳米组装体为纳米球和/或纳米棒。
优选的，
n为选自1～6的整数，R＝R1＝H，所述纳米组装体为纳米球；
或
n为选自8～12的整数；R＝R1＝H，或R＝H、R1＝CH3；所述纳米组装体为纳米棒；
或
n为选自8～12的整数；R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存；所述纳米组装体为纳米棒，或为纳米棒与纳米球的混合纳米粒子。
优选的，所述纳米球的粒子直径为8～30nm；
所述纳米棒的粒子长度为10～2000nm，直径为8～12nm。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的精确嵌段聚合物纳米组装体的制备方法，包括以下步骤：
a)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b)将所述溶解液与水混合后，透析除去有机溶剂，形成纳米组装体。
优选的，所述有机溶剂选自1,4-二氧六环、DMSO、DMF和四氢呋喃中的一种或几种。
优选的，所述方法具体包括以下步骤：
a1)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b1)将所述溶解液加入快速搅拌的水中后，透析除去有机溶剂，形成纳米球；
或包括以下步骤：
a2)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b2)在搅拌条件下，将水缓慢滴加进所述溶解液中后，透析除去有机溶剂，形成纳米球。
优选的，所述式Ⅰ嵌段聚合物中，n为选自1～6的整数，R＝R1＝H；
所述式Ⅰ嵌段聚合物在有机溶剂的中的浓度为0.1～5mg/mL；
所述水与有机溶剂的体积比为4～50；
所述步骤b1)中，所述搅拌的速率为800～1500rpm；
所述步骤b2)中，所述水的滴加速度为0.5～2mL/h；所述搅拌的速度为200～800rpm。
优选的，所述方法具体包括以下步骤：
a3)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b3)在搅拌条件下，将水缓慢滴加进所述溶解液中后，透析除去有机溶剂，形成纳米棒或纳米棒与纳米球的混合纳米粒子；
所述式Ⅰ嵌段聚合物为：
n为选自8～12的整数，R＝R1＝H；
或为n为选自8～12的整数，R＝H、R1＝CH3；
或为：
n为选自8～12的整数，R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存。
优选的，所述步骤a3)中，所述嵌段聚合物在有机溶剂的中的浓度为0.1～5mg/mL；
所述有机溶剂为1,4-二氧六环；
所述步骤b3)中，所述水的滴加速度为0.5～2mL/h；所述搅拌的速度为200～800rpm；
所述水与有机溶剂的体积比为4～50。
优选的，在所述步骤b3)后还包括：
c3)对所述纳米棒进行退火处理，得到长度增加的纳米棒；
所述退火处理包括：
将所述纳米棒的水溶液与有机溶剂混合后，进行退火；
所述退火的条件为：
加热的温度为80～100℃；保温时间为0.5～3h；降温速率为0.15～0.3℃/min。
本发明提供了一种精确嵌段聚合物纳米组装体及其制备方法。本发明采用式Ⅰ所示结构的两亲性嵌段聚合物为基体，其亲水段为树枝状甘醇结构，疏水段为连接有碳链的自降解聚合物，其链段长度及序列可调；***亲水树枝状甘醇结构及结晶性强的内核使得纳米组装体在水溶液中有很好的稳定性。通过调整疏水链段的长度及序列结构，配合其它操作及条件控制，能够形成纳米组装体--球状胶束和/或棒状胶束结构；且所得纳米组装体分散度低、稳定性好，均一性和重复性好，分子量单一，便于定量该聚合物对应的纳米粒子在活体内的生物分布，可以以该类精确的聚合物对应的不同组装体及大分子质谱定量活体中组装体的分布的技术作为平台，研究不同形状的纳米粒子在活体内的分布及代谢情况来指导纳米药物的设计。
试验结果表明，本发明制得的纳米组装体的分布系数在1.2以下，均一性较好；且重复多次制备，都得到相同类型的纳米粒子，且纳米粒子尺寸类似，具有较好的重复性；同时，储存超多两个月，仍无沉淀，表现出较好的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1所得T-A4-dPEG的球状纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图2为实施例2所得T-A6-dPEG的球状纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图3为实施例3所得T-ABABABAB-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图4为实施例4所得T-A8-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图5为实施例5所得T-B8-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图6为实施例6所得T-ABAABABB-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图7为实施例7所得T-A4B4-dPEG的球状和棒状混合纳米粒子的冷冻透射电镜图；
图8为实施例8中嵌段聚合物质谱峰面积与浓度的标准曲线；
图9为实施例9中嵌段聚合物纳米粒子的药代动力学曲线图；
图10为实施例9中嵌段聚合物纳米粒子的血液循环半衰期测试图；
图11为实施例10中静脉注射1小时后各器官中纳米组装体的含量。
具体实施方式
本发明提供了一种精确嵌段聚合物纳米组装体，所述嵌段聚合物具有式Ⅰ所示结构：
Figure BDA0002575040060000061
其中，
n为选自1～12的整数；
R＝R1＝H、F或Cl；
或
R＝H，R1＝NO2、CnH2n+1、F、Cl、Br或I；
所述纳米组装体为纳米球或纳米棒。Phy和R＇中，单键末端未显示基团为甲基。
在本发明的一些优选实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自1～6的整数，R＝R1＝H，所形成的纳米组装体为纳米球。其中，在本发明的一些具体实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n＝4、6或8；R＝R1＝H，R＇为前文所述两个链段中的支化链段。
在本发明的另一些优选实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自8～12的整数；R＝R1＝H，或R＝H、R1＝CH3；所形成的纳米组装体为纳米棒。当R＝R1＝H时，中间疏水段重复单元记为A，当R＝H、R1＝CH3时，中间疏水段重复单元记为B；式Ⅰ中左端带有-NO2及两条直烷链的端部结构记为T；R＇为前文所述两个链段中的支化链段时，式Ⅰ中右端的端部结构记为dPEG。那么，在本发明的一些具体实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：T-ABABABAB-dPEG、T-A8-dPEG、T-B8-dPEG或T-ABAABABB-dPEG。
在本发明的另一些优选实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自8～12的整数；R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存；所形成的纳米组装体为纳米棒。其中，在本发明的一些具体实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：T-ABABABAB-dPEG或T-ABAABABB-dPEG。
在本发明的另一些优选实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自8～12的整数；R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存；所形成的纳米组装体为纳米棒和纳米球的混合纳米粒子。其中，在本发明的一些具体实施例中，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：T-A4B4-dPEG。
本发明中，所述纳米球的直径优选为8～30nm。在本发明的一些实施例中，所述纳米球的直径为10～30nm。本发明中，所述纳米棒的长度优选为10～2000nm，直径优选为8～12nm。在本发明的一些实施例中，所述纳米棒的长度为28nm、直径为8～12nm；或长度为45nm、直径为8～12nm；或长度为78nm、直径为8～12nm；或长度为245nm、直径为8～12nm。在本发明的一些实施例中，所述纳米组装体为纳米球和纳米棒的混合纳米粒子，其中，纳米球的直径为20nm，纳米棒的长度为40nm、直径为8～12nm。
本发明提供的纳米组装体中，使用的式Ⅰ嵌段聚合物是精确分子量的分子(即聚合物链段长度一致)，这就导致在组装过程中结果重复性很好，不会像传统聚合物(有一定的分布，聚合物链长度不均一，即是各种长度链的聚合物的混合物)受制备批次影响(传统聚合物不能保证制备的每一批次中所有链段的长度及数目都相同的，具有分布系数，这会对组装形貌有很大影响)。而且，传统聚合物制备的纳米组装体大小难以控制，均一性很差，而本发明使用的聚合物消除了传统聚合物固有的分布系数的影响，使所得纳米组装体有很好的均一性。
本发明中，以T-A8-dPEG为例，所述式Ⅰ所示嵌段聚合物可通过以下制备方法制得：
S1、式II所示化合物与式III所示化合物进行迭代反应，得到式IV所示疏水化合物；
S2、所述疏水化合物与式Ⅴ所示化合物进行偶联反应，得到式Ⅰ所示两亲性嵌段聚合物T-A8-dPEG；
Figure BDA0002575040060000081
上述制备过程合成从式II分子为起始，此时n＝0，其与式III逐步迭代反应得到聚合度为8的疏水段化合物式IV。然后从式Ⅴ出发将亲水段与式IV疏水段进行偶联，形成式Ⅰ所示结构。
在一个具体实施例中，式Ⅰ所示嵌段聚合物T-A8-dPEG的制备过程如下：
取式III(709mg,1.61mmol,1.2equiv.)，式II(1g,1.34mmol,1equiv.)，催化当量的DBTL(即二月桂酸二丁基锡)于干燥的圆底烧瓶中，然后再加入甲苯10mL共沸除水三次，然后再加入超干甲基四氢呋喃5mL作为溶剂，氮气保护下加热到80℃反应4小时后将体系温度降为室温；之后加入1mL甲醇，再加入一水合对甲苯磺酸(127.3mg,0.67mmol,0.5equiv.)反应2小时之后，加入乙酸乙酯20mL，用饱和食盐水洗三遍，分液得到有机相，无水硫酸镁干燥后，过滤得到滤液。减压旋转蒸发除去溶剂，柱层析石油醚-乙酸乙酯作为淋洗剂柱层析分离产物1.26g，产率：90％，将得到的中间体产物命名为T-A2-OH。
然后在T-A2-OH的基础上按照上述相同的步骤重复三次即可得到式IV化合物T-A8-OH。式Ⅴ(262mg,0.2mmol,2equiv.)加入到干燥的圆底烧瓶1中，溶解于超干甲苯中，在氮气保护的条件下加热到85℃反应2小时后恢复室温，然后减压将甲苯除去。干燥无水的T-A8-OH(194mg,0.1mmol,1equiv.)和催化剂当量的DBTL加入圆底烧瓶2中，用超干的甲基四氢呋喃2mL溶解，然后转移到烧瓶1中，反应过夜即可得到T-A8-dPEG。
本发明中，对于式Ⅰ所示嵌段聚合物其它具体结构，同样按照上述合成路线进行制备，仅将原料进行相应替换即可，如对于含有B单元的聚合物T-ABABABAB-dPEG等，在进行步骤S1的迭代反应时，将上述式II所示化合物和下述式Ⅵ所示化合物依次进行迭代反应即可。
Figure BDA0002575040060000091
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的嵌段聚合物纳米组装体的制备方法，包括以下步骤：
a)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b)将所述溶解液与水混合后，透析除去有机溶剂，形成纳米组装体。
本发明中，对于制备纳米球，具体有两种制备方式，第一种制备方式包括以下步骤：
a1)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b1)将所述溶解液加入快速搅拌的水中后，透析除去有机溶剂，形成纳米球。
关于步骤a1)：
所述式Ⅰ嵌段聚合物优选为：n为选自1～6的整数，R＝R1＝H。所述有机溶剂为1,4-二氧六环、DMSO(即二甲基亚砜)、DMF(即N,N-二甲基甲酰胺)和四氢呋喃中的一种或几种；采用上述特定有机溶剂才能够在上述制备方法下获得球状组装体，若将有机溶剂替换为其它有机溶剂(如乙酸乙酯等)，则得不到规则的组装体，产生宏观沉淀。所述式Ⅰ嵌段聚合物在有机溶剂的中的浓度优选为0.1～5mg/mL；在本发明的一些实施例中，所述浓度为1mg/mL。所述溶解的温度没有特殊限制，室温下进行即可，具体可为20～30℃。经溶解后，形成溶解液。
关于步骤b1)：
将所述溶解液加入水中时，采用快速加入，具体为：用注射器将聚合物溶解液一次性注入快速搅拌的水中。本发明中，所述水处于持续快速搅拌状态，所述搅拌的转速优选为800～1500rpm，更优选为1000rpm；若搅拌速度过低，则式Ⅰ嵌段聚合物易析出产生沉淀，若搅拌速度过高则组装体的粒径难以较好的控制。本发明中，将聚合物的溶解液与水混合后，优选以同样的速度继续搅拌1～3h；在本发明的一些实施例中，继续搅拌2h。本发明中，所述水与有机溶剂的体积比优选为4～50倍；在本发明的一些实施例中，所述体积比为9。
本发明中，在进行完上述混料后，将溶液转移到透析膜对水透析以透析除去有机溶剂，从而形成纳米球；具体的，透析除去有机溶液得到的是纳米组装体的水溶液，纳米粒子稳定分散于水中。
对于制备纳米球，第二种制备方式包括以下步骤：
a2)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b2)将水缓慢滴加进所述溶解液中后，透析除去有机溶剂，形成纳米球。
关于步骤a2)：
所述式Ⅰ嵌段聚合物的种类、有机溶剂的种类、物质用量及操作条件等均与上述步骤a1)中一致，在此不再一一赘述。
关于步骤b2)：
所述水的滴加速度优选为0.5～2mL/h，更优选为1mL/h。在加水过程中，所述溶解液处于持续搅拌状态，所述搅拌的速度优选为200～800rpm，更优选为500rpm。本发明中，将聚合物的溶解液与水混合后，优选以同样的速度继续搅拌1～3h；在本发明的一些实施例中，继续搅拌2h。本发明中，所述水与有机溶剂的体积比优选为4～50倍；在本发明的一些实施例中，所述体积比为9。
本发明中，在进行完上述混料后，将溶液转移到透析膜对水透析以透析除去有机溶剂，从而形成纳米球；具体的，透析除去有机溶液得到的是纳米组状体的水溶液，纳米粒子稳定分散于水中。
本发明中，所述纳米球的直径优选为8～30nm。在本发明的一些实施例中，所述纳米球的直径为10～20nm。
本发明中，对于制备纳米棒，或纳米棒与纳米球的混合纳米粒子，制备方法具体包括以下步骤：
a3)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b3)将水缓慢滴加进所述溶解液中后，透析除去有机溶剂，形成纳米棒或纳米棒与纳米球的混合纳米粒子。
关于步骤a3)：
所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自8～12的整数，R＝R1＝H；对应纳米组装体为纳米棒。或者，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自8～12的整数，R＝H、R1＝CH3；对应纳米组装体为纳米棒。或者，所述式Ⅰ嵌段聚合物为：n为选自8～12的整数，R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存；对应纳米组装体为纳米棒，或纳米棒与纳米球的混合纳米粒子。
所述有机溶剂优选为1,4-二氧六环。所述式Ⅰ嵌段聚合物在有机溶剂的中的浓度优选为0.1～5mg/mL；在本发明的一些实施例中，所述浓度为1mg/mL。所述溶解的温度没有特殊限制，室温下进行即可，具体可为20～30℃。经溶解后，形成溶解液。
关于步骤b3)：
所述水的滴加速度优选为0.5～2mL/h，更优选为1mL/h。在加水过程中，所述溶解液处于持续搅拌状态，所述搅拌的速度优选为200～800rpm，更优选为500rpm。本发明中，将聚合物的溶解液与水混合后，优选以同样的速度继续搅拌1～3h；在本发明的一些实施例中，继续搅拌2h。本发明中，所述水与有机溶剂的体积比优选为4～50倍；在本发明的一些实施例中，所述体积比为9。
本发明中，在进行完上述混料后，将溶液转移到透析膜对水透析以透析除去有机溶剂，从而形成纳米棒，或纳米棒与纳米球的混合纳米粒子；具体的，透析除去有机溶液得到的是纳米组装体的水溶液，纳米粒子稳定分散于水中。
本发明中，所述纳米棒的长度优选为10～2000nm，直径优选为8～12nm。在本发明的一些实施例中，所述纳米棒的长度为28nm、直径为8～12nm；或长度为45nm、直径为8～12nm；或长度为78nm、直径为8～12nm；或长度为245nm、直径为8～12nm。在本发明的一些实施例中，所述纳米组装体为纳米球和纳米棒的混合纳米粒子，其中，纳米球的直径为10～20nm，纳米棒的长度为40nm、直径为8～12nm。
本发明中，在所述步骤b3)后优选还包括：c3)对所述纳米棒进行退火处理，得到长度增加的纳米棒。所述退火处理包括：将所述纳米棒的水溶液与有机溶剂混合后，进行退火。
其中，所述纳米棒的水溶液即为前序制备方法中透析除去有机溶剂后形成的纳米组装体的水溶液。所述有机溶剂优选为1,4-二氧六环，乙腈，二甲亚砜和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种。所述有机溶剂的用量与所述纳米棒的水溶液的质量比优选为(0.1～0.3)∶1。
其中，所述退火的条件优选为：加热的温度为80～100℃；更优选为80℃。加热的方式为将物料直接放于以升温至目标温度的设备中，而不是随设备升温。保温的时间为0.5～3h；更优选为1h。降温的速率为0.15～0.3℃/min，降至室温即可。
本发明中嵌段聚合物组装得到的纳米棒在上述条件下退火，能够有效增加纳米棒的长度，使长度增加50nm～5μm。
本发明提供的上述各种纳米组装体的制备方法中，选择特定的式Ⅰ嵌段聚合物，利用溶液中分子自组装的调控技术，在没有任何添加剂或模板剂存在的条件下，通过调整疏水链段的长度及序列结构，配合其它操作及条件控制，能够形成多种均匀、稳定、重复性好的纳米组装体--球状胶束和/或棒状胶束结构。而且式Ⅰ两亲性嵌段聚合物的疏水段的长度及序列结构可以按照本发明中的合成方法精确调节，因此可以精确可控地得到不同结构的纳米组装体。这些结构可用于生物医学领域，研究纳米材料结构对于其在体内代谢与分布的影响，或探究不同纳米结构的纳米材料与细胞的相互作用。以该类精确的聚合物对应的不同组装体及大分子质谱定量活体中组装体的分布的技术作为平台，研究不同形状的纳米粒子在活体内的分布及代谢情况来指导纳米药物的设计。
本发明还提供了一种利用大分子质谱测定纳米组装体的生物分布的方法；所述纳米组装体为上述技术方案中所述的纳米组装体或按照上述技术方案中所述的制备方法制得的纳米组装体。
所述测定的方法具体如下：
K1、活体静脉注射纳米组装体水溶液后，在不同时间处死动物，取出主要器官，进行研磨、冻干和萃取浓缩，得到待分析样本；
或
将细胞与纳米组装体水溶液共培养不同时间后，利用缓冲液洗涤，再经消化离心得到细胞，进行裂解、冻干和萃取浓缩，得到待分析样本；
K2、向所述待分析样本中加入确定浓度的标样后，进行质谱分析，通过标准曲线定量出样本中各种式Ⅰ嵌段聚合物的含量。
传统的聚合物质谱信号是一个在一个分子量范围的区间中有多组峰，两峰的差值为一个重复单元的分子量，导致当两种聚合物分子量相差不大时，同时用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定两种聚合物时，质谱峰会有重叠，不能确切清晰地判断出聚合物的种类。本发明中的式Ⅰ精确聚合物利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析时，其质谱峰为单一的一个峰因此可以同时高通量检测不同分子量的聚合物；并且本发明中聚合物分子量单一，可利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱直接定量该类精确聚合物对应的纳米粒子在活体内的生物分布。因此，可以以该类精确的聚合物对应的不同组装体及大分子质谱定量活体中组装体的分布的技术作为平台，研究不同形状的纳米粒子在活体内的分布及代谢情况来指导纳米药物的设计。
通过上述测试发现，上述由式Ⅰ嵌段聚合物形成的球状、不同长度的纳米棒状的纳米粒子，在活体内主要富集在肝脏、脾脏和肺部。另外，不同长度的棒状胶束的血液循环时间存在差异，随着棒状结构长度的增加，纳米粒子的血液循环时间增加。另外，球状纳米粒子、棒状纳米粒子与细胞共培养时，二者的细胞内吞量存在差异。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
以下实施例中，当R＝R1＝H时，中间疏水段重复单元记为A，当R＝H、R1＝CH3时，中间疏水段重复单元记为B；式Ⅰ中左端带有-NO2及两条直烷链的端部结构记为T；R＇为前文所述两个链段中的支化链段时，式Ⅰ中右端的端部结构记为dPEG。以下实施例中，组装纳米粒子的过程中采用的透析膜为截留分子量30000Da。式Ⅰ嵌段聚合物通过前文所述的制备方法获得。
实施例1制备式Ⅰ嵌段聚合物T-A4-dPEG的球状纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-A4-dPEG溶解在二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在1000rpm的搅拌条件下，将1mL上述溶解液一次性快速注入9mL水中，继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图1所示，图1为实施例1所得T-A4-dPEG的球状纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为球状纳米粒子，纳米球的平均直径约为20nm。
对所得纳米组装体进行性能测试：
(1)对图1所示冷冻电镜图像上的球状纳米粒子进行统计，结果显示，其数均直径Dn＝18.2nm，重均直径Dw＝19.5nm，分布系数Dw/Dn＝1.07，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)对嵌段聚合物T-A4-dPEG按照上述方法重复多次(3次以上)组装，得到的组装体均为球状纳米粒子，且纳米粒子的直径为18.2±4.8nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)将所得组装体水溶液于室温下静置保存，结果显示，放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例2制备式Ⅰ嵌段聚合物T-A6-dPEG的球状纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-A6-dPEG溶解在1,4-二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在500rpm的搅拌条件下，采用注射泵以1mL/h的加水速度将9mL水加入含1mL溶剂的上述溶解液中，再继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图2所示，图2为实施例2所得T-A6-dPEG的球状纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为球状纳米粒子，纳米球的平均直径约为21nm。
按照实施例1的测试方法进行各项性能测试，结果显示：
(1)其数均直径Dn＝20.8nm，重均直径Dw＝21.3nm，分布系数Dw/Dn＝1.02，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)重复多次试验，得到的组装体均为球状纳米粒子，且纳米粒子的直径为20.8±2.9nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)所得组装体水溶液放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例3制备式Ⅰ嵌段聚合物T-ABABABAB-dPEG的棒状纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-ABABABAB-dPEG溶解在1,4-二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在500rpm的搅拌条件下，采用注射泵以1mL/h的加水速度将9mL水加入含1mL溶剂的上述溶解液中，再继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图3所示，图3为实施例3所得T-ABABABAB-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为棒状纳米粒子，纳米棒的平均长度为28nm，直径为8～12nm。
按照实施例1的测试方法进行各项性能测试，结果显示：
(1)纳米棒数均长度Ln＝28.0nm,，重均长度Lw＝30.0nm，分布系数Lw/Ln＝1.07，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)重复多次试验，得到的组装体均为棒状纳米粒子，且纳米粒子的长度为28±7.4nm，直径为9.9±0.3nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)所得组装体水溶液放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例4制备式Ⅰ嵌段聚合物T-A8-dPEG的棒状纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-A8-dPEG溶解在1,4-二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在500rpm的搅拌条件下，采用注射泵以1mL/h的加水速度将9mL水加入含1mL溶剂的上述溶解液中，再继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图4所示，图4为实施例4所得T-A8-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为棒状纳米粒子，纳米棒的平均长度为45nm，直径为8～12nm。
按照实施例1的测试方法进行各项性能测试，结果显示：
(1)纳米棒数均长度Ln＝45.1nm,，重均长度Lw＝48.7nm，分布系数Lw/Ln＝1.08，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)重复多次试验，得到的组装体均为棒状纳米粒子，且纳米粒子的长度为45±12.8nm，直径为9.9±0.2nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)所得组装体水溶液放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例5制备式Ⅰ嵌段聚合物T-B8-dPEG的棒状纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-B8-dPEG溶解在1,4-二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在500rpm的搅拌条件下，采用注射泵以1mL/h的加水速度将9mL水加入含1mL溶剂的上述溶解液中，再继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图5所示，图5为实施例5所得T-B8-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为棒状纳米粒子，纳米棒的平均长度为77.6nm≈78nm，直径为8～12nm。
按照实施例1的测试方法进行各项性能测试，结果显示：
(1)纳米棒数均长度Ln＝78.6nm,，重均长度Lw＝80.7nm，分布系数Lw/Ln＝1.04，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)重复多次试验，得到的组装体均为棒状纳米粒子，且纳米粒子的长度为77.6±15.5nm，直径为9.9±0.2nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)所得组装体水溶液放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例6制备式Ⅰ嵌段聚合物T-ABAABABB-dPEG的棒状纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-ABAABABB-dPEG溶解在1,4-二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在500rpm的搅拌条件下，采用注射泵以1mL/h的加水速度将9mL水加入含1mL溶剂的上述溶解液中，再继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图6所示，图6为实施例6所得T-ABAABABB-dPEG的棒状纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为棒状纳米粒子，纳米棒的平均长度为244.8nm≈245nm，直径为8～12nm。
按照实施例1的测试方法进行各项性能测试，结果显示：
(1)纳米棒数均长度Ln＝244.8nm,，重均长度Lw＝254.9nm，分布系数Lw/Ln＝1.04，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)重复多次试验，得到的组装体均为棒状纳米粒子，且纳米粒子的长度为244.8±49.0nm，直径为9.9±0.4nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)所得组装体水溶液放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例7制备式Ⅰ嵌段聚合物T-A4B4-dPEG的球状和棒状混合纳米粒子
1.1制备
将嵌段聚合物T-A4B4-dPEG溶解在1,4-二氧六环中(1mg/mL)，得到溶解液。在500rpm的搅拌条件下，采用注射泵以1mL/h的加水速度将9mL水加入含1mL溶剂的上述溶解液中，再继续搅拌2h。然后，将溶液转移到透析膜对水透析除去有机溶剂，对纯水透析并多次换水，得到纳米组装体的水溶液。
1.2表征及测试
冷冻电镜测试图如图7所示，图7为实施例7所得T-A4B4-dPEG的球状和棒状混合纳米粒子的冷冻透射电镜图。可以看出，所得组装体为球状和棒状纳米粒子的混合粒子，其中，纳米球的平均直径为20nm；纳米棒的平均长度为40nm，直径为8～12nm。
按照实施例1的测试方法进行各项性能测试，结果显示：
(1)对于球状纳米粒子，其数均直径Dn＝20.3nm，重均直径Dw＝22.3nm，分布系数Dw/Dn＝1.1；对于棒状纳米粒子，其数均长度Ln＝40.7nm,，重均长度Lw＝44.0nm，分布系数Lw/Ln＝1.08，分布系数好，具有很好的均一性。
(2)重复多次试验，得到的组装体均为球状和棒状纳米粒子的混合粒子，且球状纳米粒子的直径为20.3±6.4nm；棒状纳米粒子的长度为40.7±11.5nm，直径为9.9±0.3nm。证明，本发明提供的嵌段聚合物通过上述方法重复性好。
(3)所得组装体水溶液放置时间超过两个月后，仍物沉淀析出，证明其具有很好的稳定性。
实施例8式Ⅰ嵌段聚合物质谱峰面积与浓度的标准曲线
以T-ABABAB-dPEG为标样，四氢呋喃为溶剂，恒定标样溶液的浓度为1mg/mL。对于T-A6-dPEG，以四氢呋喃为溶剂制备浓度为1mg/mL的样品溶液，以该样品溶液为基础，配制5份待测样溶液，具体分别为：取20μL上述样品溶液，氮气缓慢吹干，再加入标样溶液200μL；取20μL上述样品溶液，氮气缓慢吹干，再加入标样溶液100μL；取150μL上述样品溶液，氮气缓慢吹干，再加入标样溶液100μL；取150μL上述样品溶液，氮气缓慢吹干，再加入标样溶液50μL；取200μL上述样品溶液，氮气缓慢吹干，再加入标样溶液100μL；保证在每个待测样中标样浓度固定，形成的待测样溶液浓度梯度为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL。
对于样品T-A8-dPEG、T-ABAABABB-dPEG、T-B8-dPEG，同样按照上述方法分别配制待测样溶液。
每种序列结构样品的5组待测样溶液分别进行质谱测试，计算所测试质谱峰面积，将峰面积比值与浓度做拟合即可得到该序列结构样品质谱峰面积与浓度的标准曲线。所得标准曲线如图8所示，图8为实施例8中嵌段聚合物质谱峰面积与浓度的标准曲线(图中，图线1～4分别对应上述4种序列结构的样品)。以该标准曲线为基础，可利用大分子质谱测定纳米组装体的生物分布。
实施例9活体内不同形貌纳米组装体的药代动力学实验
健康磁性大鼠(约300g，10周)购自安徽医科大学动物实验中心。动物实验遵从《实验动物和使用指南》规定，并获得中国科学技术大学动物护理和使用委员会批准。将以上实施例中由T-A6-dPEG制备的球状纳米粒子，T-A8-dPEG制备的45nm的棒状纳米粒子，T-B8-dPEG制备的78nm的棒状纳米粒子，T-ABAABABB-dPEG制备的245nm的棒状纳米粒子等量混合(2mL，总浓度为1mg/mL，溶剂为纯水)后，从尾静脉注入。在实验设定的取血时间点，从老鼠尾静脉取血0.2mL，转移到含有肝素钠的试管中4℃保存。采集完所有数据点后，处死实验鼠。然后将血液冻干，加入5mL的四氢呋喃溶液萃取，重复三遍，最后浓缩加入标样溶液做大分子质谱分析。血液循环半衰期(t1/2)采用已知的药代动力学二阶衰减拟合方法得到。每个实验条件下平行采集三只老鼠数据并计算标准偏差。实验结果参见图9，图9为实施例9中嵌段聚合物纳米粒子的药代动力学曲线图。对于长度为45nm左右的棒状结构其血液循环半衰期为5.2h，对于长度为78nm左右的棒状结构，其血液循环半衰期为7.02h，对于长度为245nm左右的棒状胶束，其血液循环的半衰期为7.07小时左右。表明对于棒状结构的组装体，长度越长，血液循环半衰期越大。实验结果参见图10，图10为实施例9中嵌段聚合物纳米粒子的血液循环半衰期测试图。
实施例10不同形貌纳米组装体在活体内的生物分布
健康磁性大鼠(约300g，10周)购自安徽医科大学动物实验中心。动物实验遵从《实验动物和使用指南》规定，并获得中国科学技术大学动物护理和使用委员会批准。将以上实施例中由T-A6-dPEG制备的球状纳米粒子，T-A8-dPEG制备的45nm的棒状纳米粒子，T-B8-dPEG制备的78nm的棒状纳米粒子，T-ABAABABB-dPEG制备的245nm的棒状纳米粒子等量混合(2mL，总浓度为1mg/mL，水为溶剂)后，从尾静脉注入。在实验设定的时间点将老鼠处死，解剖得到老鼠的主要器官(如心脏、肝脏、脾脏、肺、肠道、肾脏)。然后，将这些器官称重、剪碎、研磨后得到匀浆，再冻干、萃取浓缩后得到各个器官对应待分析的样本。向每个样本中加入一定量的标样溶液后即可进行质谱分析。计算出各信号峰相对于标峰面积，从而根据标准曲线计算出该器官中所含组装体的量。实验结果如图11所示，图11为实施例10中静脉注射1小时后各器官中纳米组装体的含量；图中，n.d.表示没有检测到信号。可以看出，纳米粒子水溶液静脉注入小鼠体内1小时后，主要富集在肝脏、脾脏及肺部，在脾脏中富集最多。并且，由图中可以看出，45nm纳米棒及78nm纳米棒更易于在脾脏中富集。证明，本发明提供的上述纳米组装体，采用质谱分析即可确定纳米粒子的生物分布。
现有技术中，大部分测定生物纳米粒子生物分布的方法是利用组装体包覆染料分子或者在聚合物上共价接上染料分子，利用测定荧光的方式来定量组装体在活体器官中的生物分布，是间接定量的方式。这种方法的缺点在于组装体中包覆的染料容易泄露导致定量不准确，共价标记荧光染料的方法已经改变聚合物结构，且荧光定量的方式影响因素较多。本发明中是直接用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定组成组装体的精确聚合物，是一种直接定量的方式，更为准确。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种精确嵌段聚合物纳米组装体，其特征在于，所述嵌段聚合物具有式Ⅰ所示结构：
Figure FDA0002575040050000011
Figure FDA0002575040050000012
其中，
n为选自1～12的整数；
R＝R1＝H、F或Cl；
或
R＝H，R1＝NO2、CnH2n+1、F、Cl、Br或I；
所述纳米组装体为纳米球和/或纳米棒。
2.根据权利要求1所述的纳米组装体，其特征在于，
n为选自1～6的整数，R＝R1＝H，所述纳米组装体为纳米球；
或
n为选自8～12的整数；R＝R1＝H，或R＝H、R1＝CH3；所述纳米组装体为纳米棒；
或
n为选自8～12的整数；R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存；所述纳米组装体为纳米棒，或为纳米棒与纳米球的混合纳米粒子。
3.根据权利要求1或2所述的纳米组装体，其特征在于，所述纳米球的粒子直径为8～30nm；
所述纳米棒的粒子长度为10～2000nm，直径为8～12nm。
4.一种权利要求1～3中任一项所述的精确嵌段聚合物纳米组装体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b)将所述溶解液与水混合后，透析除去有机溶剂，形成纳米组装体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自1,4-二氧六环、DMSO、DMF和四氢呋喃中的一种或几种。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
a1)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b1)将所述溶解液加入快速搅拌的水中后，透析除去有机溶剂，形成纳米球；
或包括以下步骤：
a2)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b2)在搅拌条件下，将水缓慢滴加进所述溶解液中后，透析除去有机溶剂，形成纳米球。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述式Ⅰ嵌段聚合物中，n为选自1～6的整数，R＝R1＝H；
所述式Ⅰ嵌段聚合物在有机溶剂中的浓度为0.1～5mg/mL；
所述水与有机溶剂的体积比为4～50；
所述步骤b1)中，所述搅拌的速率为800～1500rpm；
所述步骤b2)中，所述水的滴加速度为0.5～2mL/h；所述搅拌的速度为200～800rpm。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
a3)将式Ⅰ嵌段聚合物溶解于有机溶剂中，得到溶解液；
b3)在搅拌条件下，将水缓慢滴加进所述溶解液中后，透析除去有机溶剂，形成纳米棒或纳米棒与纳米球的混合纳米粒子；
所述式Ⅰ嵌段聚合物为：
n为选自8～12的整数，R＝R1＝H；
或n为选自8～12的整数，R＝H、R1＝CH3；
或：
n为选自8～12的整数，R＝R1＝H的片段与R＝H、R1＝CH3的片段共存。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a3)中，所述嵌段聚合物在有机溶剂中的浓度为0.1～5mg/mL；
所述有机溶剂为1,4-二氧六环；
所述步骤b3)中，所述水的滴加速度为0.5～2mL/h；所述搅拌的速度为200～800rpm；
所述水与有机溶剂的体积比为4～50。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤b3)后还包括：
c3)对所述纳米棒进行退火处理，得到长度增加的纳米棒；
所述退火处理包括：
将所述纳米棒的水溶液与有机溶剂混合后，进行退火；
所述退火的条件为：
加热的温度为80～100℃；保温时间为0.5～3h；降温速率为0.15～0.3℃/min。
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