CN110694076B - 一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，是由亲水性聚乙二醇单甲醚和疏水性的羟基氯喹聚合物构成，羟基氯喹聚合物通过可断裂化学键键合在聚乙二醇单甲醚上，所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体可在水中自组装成粒径为20‑300nm的纳米颗粒，改善了游离羟基氯喹的药代动力学行为，使其具有显著的长循环特性，同时，该羟基氯喹两亲性聚合物药物前体纳米颗粒可负载多种疏水性药物，包括喜树碱及其衍生物、紫杉醇、阿霉素、硼替佐米，以及各类带负电的药物分子，具有广泛的应用价值。

Description

一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于药物前体及其制备领域，具体是涉及一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体及其制备方法和应用。
背景技术
羟基氯喹(如式A所示)是一种4-氨基喹啉类抗疟药，可用于治疗***性红斑狼疮、类风湿性关节炎及其他免疫疾病。羟基氯喹在临床上用药为口服型硫酸羟基氯喹，其药理和作用机制与氯喹类似，但其毒性比氯喹低。羟基氯喹和氯喹的结构差别在于，氯喹的侧链末端的N-乙基被羟基化，因此命名为羟基氯喹。
Figure BDA0002195473770000011
近年来，越来越多的研究发现羟基氯喹和氯喹具有各种各样的生物和药理活性，除了抗疟、抗炎外，还具备调节免疫、抗凝血、抗感染、抗肿瘤、防血栓、降血脂等作用。在抗肿瘤领域，羟基氯喹和氯喹作为自噬抑制剂，可增敏抗癌药物对癌细胞的杀伤作用，同时还可提高放疗、光动力治疗等的治疗效果(Combined autophagy and proteasomeinhibition:A phase 1trial of hydroxychloroquine and bortezomib in patientswith relapsed/refractory myeloma.Autophagy 2014；10:1380-90；Combined MTOR andautophagy inhibition:Phase I trial of hydroxychloroquine and temsirolimus inpatients with advanced solid tumors and melanoma.Autophagy 2014；10:1391-402；Phase I trial of hydroxychloroquine with dose-intense temozolomide inpatients with advanced solid tumors and melanoma.Autophagy,2014；10:1369-79)。目前已有多个临床前和临床试验正在开展因此，羟基氯喹和氯喹在临床上具有越来越广泛的应用价值。
由于羟基氯喹类药物在体内的分布没有选择性，仅仅为了增强疗效而使用高剂量时会造成机体***性毒性，如引起视网膜变化、角膜变化、皮肤病、胃肠道不良反应等，为了缓解羟基氯喹类药物对身体的不利影响，利用生物纳米技术将药物分子与纳米载体复合形成纳米药物，可改善药物的药动学和组织分布，从而提高疗效和降低毒副作用。紫杉醇-白蛋白纳米粒ABRAXANE、阿霉素脂质体DOXIL等经典纳米剂型已进入临床应用，还有多项纳米药物正处于临床试验阶段，因此，人们希望能通过纳米技术改善羟基氯喹的药理，扩大该类药物的应用范围。
公开号为CN107375199A公开了一种聚合氯喹的纳米凝胶递送***，该纳米递送体系以聚多糖为骨架，由聚合氯喹和包裹于微粒内的抗肿瘤药构成，该纳米体系可同时抑制肿瘤生长和抑制转移，有效治疗恶性肿瘤。
公开号为CN105924641A公开了一种硫酸羟基氯喹聚谷氨酸聚合物的制备方法，该聚合物通过羟基氯喹与聚谷氨酸发生酯化反应形成，能够提高药物的缓释作用，减少服药频次，同时能够将药物输送到病灶部位，提高羟基氯喹在治疗盘状红斑狼疮及***性红斑狼疮中的疗效。
目前，解决这类问题主要是将羟基氯喹通过化学反应连到聚谷氨酸或聚多糖上，但是由于该类反应的反应时间长，且载药量不易控制，同时当羟基氯喹含量过高时，还会导致整个体系水溶性变差。
发明内容
本发明提供了一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，该药物前体可自组装成纳米颗粒(或称胶束或囊泡)，由于疏水内核羟基氯喹的存在，可负载多种疏水性药物，实现体内长循环，降低羟基氯喹与红细胞的结合能力，充分发挥羟基氯喹的药理作用，极大地改善了羟基氯喹的药代动力学行为。
所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，包括由聚合羟基氯喹构成的疏水端，由聚乙二醇单甲醚构成的亲水端，所述的亲水端与疏水端之间可通过活性自由基聚合形成可降解化学键的方式实现分子间聚合，所述的聚乙二醇单甲醚的数均分子量为1000-50000；羟基氯喹聚合物数均分子量为500-50000。
所述的活性自由基聚合方式为可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)、原子转移自由基聚合(ATRP)、溶液聚合、开环易位聚合(ROMP)中的一种或多种。
所述的可降解化学键为酯键、碳酸酯键、二硫键、硫醚键、脲键、腙键、氨基甲酸酯键等可实现体内外多种响应性释放的可降解化学键中的一种。
作为优选，所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体(简称PHCQ)，为如下式I所示结构的化合物：
Figure BDA0002195473770000031
式I中，n＝22～1136；m＝1～100；X为式II，III所示的结构式。
所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，可自组装形成纳米颗粒，由于疏水内核羟基氯喹的存在，可负载多种疏水性药物，同时由于聚乙二醇单甲醚的引入，使其水溶性增大，并降低对于正常组织毒性。
本发明还提供了一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体的制备方法，产率高，方法简单，适合工业化生产。
所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体的制备方法，包括：
(1)将丙烯酰氯类化合物、丙烯酸酐类化合物或丙烯酸羟乙酯类化合物与游离羟基氯喹溶解于有机溶剂中，在缩合试剂以及酰化催化剂的协同作用下，得到式II、III所示的羟基氯喹类化合物单体结构：
Figure BDA0002195473770000032
含有酯基或脂基的羟基氯喹类化合物单体式II；
Figure BDA0002195473770000033
含有二硫基的羟基氯喹类化合物单体式III；
(2)将聚乙二醇单甲醚与小分子链转移剂PETTC溶解到有机溶剂中，在缩合试剂以及酰化催化剂的协同作用下，反应得到聚乙二醇单甲醚-链转移剂的大分子链转移剂(PEG-PETTC)，为如下式IV所示结构的化合物：
Figure BDA0002195473770000041
n＝22～1136；
(3)将步骤(1)所得到的羟基氯喹类化合物单体(式II，或式III)与聚乙二醇单甲醚-链转移剂的大分子链转移剂(式IV)，在引发剂的作用下通过活性自由基聚合生成式I所示的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，聚合温度为60～80℃。
步骤(1)或(2)中，所述的缩合试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)中的一种或多种。
步骤(1)或(2)中，所述的酰化催化剂为4-N,N-二甲基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、吡啶、三乙胺中的一种或多种。
步骤(3)中，所述的引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、4,4′-偶氮二(4-氰基戊酸)(V501)、1,1’-偶氮双(1-环己烷甲腈)(ACCN)中的一种。
步骤(2)中，由于聚乙二醇单甲醚的位阻较大，作为优选，反应时长为48～72小时。
步骤(1)或(2)中，所述的有机溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二氯甲烷(DCM)、二氧六环、甲醇、乙醇、四氢呋喃、环己烷、甲苯、苯甲醚中的一种或多种。
本发明还提供了羟基氯喹两亲性聚合物药物前体制备纳米颗粒(PHCQ-NP)的方法，包括透析法、溶剂挥发法、薄膜水化法，共沉淀法。
优选地，为透析法，将羟基氯喹两亲性聚合物药物前体溶于有机溶剂中，并缓慢滴加到1～10倍体积的去离子水中，搅拌10-20分钟，利用半透膜透析除去有机溶剂，得到羟基氯喹两亲性聚合物药物前体纳米颗粒溶液。
所述的有机溶剂包括N,N’-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧六环中的一种，为了使制备得到的纳米颗粒的粒径分布、实验可重复性、操作性，进一步优选为二甲基亚砜。
所述的纳米颗粒粒径范围在20-300nm之间，粒径分布均一，载药率可达50％-80％。
所述的纳米颗粒的粒径可通过有机溶剂的种类、聚合物浓度、滴加速度来控制。
区别于现有技术，本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体中，由于羟基氯喹聚合物的疏水性很强，通过引入亲水性分子聚乙二醇单甲醚，所制备的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体与游离的羟基氯喹相比具有显著的长循环作用，提高药物的水溶性，极大地改善了羟基氯喹的药代动力学行为，并且降低了羟基氯喹与红细胞的结合能力，减少对正常细胞的毒副作用，充分发挥了羟基氯喹的药理作用。
(2)本发明所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体纳米颗粒，由于疏水内核羟基氯喹的存在，可负载多种疏水性药物，包括喜树碱及其衍生物、紫杉醇、阿霉素、硼替佐米，以及各类带负电的药物分子，使得羟基氯喹类药物在临床上具有广泛的治疗效果，尤其在肿瘤治疗上，常与各类抗癌药、免疫调节剂联合用于协同治疗，同时，由于羟基氯喹具有微正电性，可负载负电性的核酸，包括DNA，mRNA，siRNA等，用于基因输送和协同治疗。
附图说明
图1为聚乙二醇单甲醚链转移剂PEG-PETTC的核磁共振氢谱图；
图2为中间产物DTMA的核磁共振氢谱图；
图3为羟基氯喹单体DTMAHCQ的核磁共振氢谱图；
图4为PHCQ的核磁共振氢谱图；
图5为PHCQ的凝胶渗透色谱表征图；
图6为PHCQ-NP的的动态光散射图；
图7为PHCQ-NP的透射电镜图；
图8为PHCQ-NP的体外释放图；
图9为PHCQ-NP在血液中的药-时曲线和药代动力学参数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例：
羟基氯喹两亲性聚合物药物前体的合成：
本实施例合成了具备二硫键键合的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，分子量大约为10000，具有均一的分子量分布，其中聚乙二醇单甲醚分子量为5000。
1、聚乙二醇单甲醚链转移剂(PEG-PETTC)的合成：
取4g聚乙二醇单甲醚(分子量5000，0.8mmol)甲苯回流除水，旋干后加入100mL二氯甲烷溶解，加入5当量的4-氰基-4-(2-苯基乙烷硫烷基硫羰基)硫烷基戊酸(PETTC)及0.5当量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在冰浴条件下滴加5当量的二环己基碳二亚胺(DCC)二氯甲烷(DCM)溶液，滴加结束后撤掉冰浴，室温搅拌48小时。反应物减压浓缩，用冰无水乙醇沉淀三次，真空干燥得到产物(3.6g，产率90％)。聚乙二醇链转移剂PEG-PETTC的核磁共振氢谱图，如图1所示。
检验PEG-PETTC的核磁共振氢谱图分峰如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36–7.30(m,3H),7.26–7.22(m,2H),4.29–4.24(m,2H),3.65(m,450H),3.38(s,3H),3.04–2.96(m,2H),2.70–2.62(m,2H),2.58–2.48(m,1H),2.44–2.35(m,1H).
2、二硫键键合的羟基氯喹单体DTMAHCQ的合成
中间产物DTMA的合成：取3,3'-二氢氧啉酸(DTDPA)20g(0.095mol)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)13.6g(0.1mol)和4-二甲氨基吡啶1.74g(0.014mol)共混于200mL二氯甲烷，取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐20g溶于200mL二氯甲烷中，冰浴条件下滴加到混合液中，室温搅拌过夜。反应液用水洗三次，1M HCl溶液洗三次，饱和NaCl溶液洗两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得粗产品，粗产品用正己烷/乙酸乙酯洗脱液过柱纯化，得产物，命名为DTMA，DTMA的核磁共振氢谱图，如图2所示。
检验中间产物DTMA的核磁共振氢谱图分峰如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.14(s,1H),5.65–5.58(m,1H),4.37(s,4H),3.00–2.84(m,4H),2.88–2.61(m,4H),1.95(s,3H).
DTMAHCQ的合成：取脱盐的羟基氯喹1.7g(0.05mol)、DTMA1.6 g(0.05mol)和4-二甲氨基吡啶90mg(0.0075mol)溶于50mL二氯甲烷。取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1.4g(0.075mol)溶于20mL二氯甲烷中，冰浴条件下滴加到上述混合液中。室温搅拌过夜。反应液用水洗三次，饱和NaCl溶液洗两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得粗产品。粗产品用二氯甲烷/甲醇洗脱液过柱纯化，产物命名为DTMAHCQ。DTMAHCQ的核磁共振氢谱图，如图3所示。
检验DTMAHCQ的核磁共振氢谱图分峰如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(d,J＝5.5Hz,1H),7.95(d,J＝2.1Hz,1H),7.72(d,J＝9.0Hz,1H),7.35(dd,J＝8.9,2.1Hz,1H),6.43(d,J＝5.5Hz,1H),6.13(s,1H),5.68–5.56(m,1H),5.22(d,J＝7.2Hz,1H),4.35(s,4H),4.17(t,J＝6.2Hz,2H),3.72(dd,J＝12.0,5.5Hz,1H),2.89(td,J＝7.1,3.6Hz,4H),2.73(dt,J＝17.8,6.6Hz,6H),2.61–2.41(m,4H),1.95(s,3H),1.81–1.51(m,4H),1.33(d,J＝6.3Hz,3H),1.01(t,J＝7.1Hz,3H).
3、二硫键键合的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体PHCQ的合成
取聚乙二醇链转移剂PEG-PETTC500 mg(0.1mmol)、羟基氯喹单体DTMAHCQ500 mg(0.78mmol)、偶氮二异丁腈5mg(0.03mmol)溶于5mL二氧六环并置于聚合瓶中。氮气鼓泡30min充分除氧，将聚合瓶封闭，置于70℃的油浴锅中反应24h。反应结束后用液氮终止反应。反应物用冰乙醇沉淀2次，***沉淀2次，真空干燥，得产物665mg(产率66.5％)，命名为PHCQ。聚合物PHCQ的核磁图谱，如图4所示。
检验PHCQ的核磁共振氢谱图分峰如下：1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.35(s,12H),7.75(s,6H),7.40(s,6H),7.25(s,3H),6.90(s,6H),6.45(s,6H),4.37–3.93(m,42H),3.51(s,460H),3.24(s,3H),2.95–2.52(m,70H),2.41(s,24H),1.86(s,6H),1.52(dd,J＝91.7,31.8Hz,30H),1.23(d,J＝27.7Hz,22H),0.82(d,J＝40.3Hz,36H).
上述合成路线如下所示：
Figure BDA0002195473770000081
羟基氯喹两亲性聚合物药物前体PHCQ的凝胶渗透色谱图，如图5所示，相比于聚乙二醇链转移剂PEG-PETTC，羟基氯喹聚合物的出峰时间明显迁移，控制反应条件可得到单分布的聚合物，聚合物的数均分子量Mn为2.58×104，重均分子量Mw为3.03×104，分散系数为1.17，由于采用了聚苯乙烯的聚合物作为标曲，所计算分子量与实际存在一定误差。
4、羟基氯喹两亲性聚合物药物前体纳米颗粒PHCQ-NP的制备
取20mg羟基氯喹两亲性聚合物药物前体溶于2mL二甲基亚砜中，缓慢滴加到4倍体积的去离子水中，搅拌10分钟后，用3500Da的醋酸纤维半透膜透析除去二甲基亚砜，得羟基氯喹两亲性聚合物药物前体纳米颗粒，命名为PHCQ-NP。
如图6所示，通过动态光散射仪测定纳米颗粒的粒径，纳米颗粒PHCQ-NP的平均粒径约为68nm左右。
如图7所示，通过透射电子显微镜表征PHCQ纳米颗粒的形貌特征，透射电镜图显示，纳米颗粒具有明显的双层囊泡结构，粒径分布均匀，约在60～70nm之间。
由于所制备的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体具有二硫键，二硫键具有还原响应的特性，故研究该类药物的体外响应式释放行为。
具体方法为：将一定体积的纳米颗粒置于3500Da的醋酸纤维半透膜，半透膜外是40mL PBS溶液或加10mM二硫苏糖醇(DTT)的PBS溶液，在特定时间取半透膜外的溶液200μL，用高效液相色谱测定其中羟基氯喹浓度，释放行为如图8所示，纳米颗粒在二硫苏糖醇溶液中快速释放羟基氯喹，在8小时释放趋于平衡，而在PBS中释放缓慢，由此得出该纳米颗粒的释放具有显著的还原响应性。
5、羟基氯喹两亲性聚合物药物前体纳米颗粒PHCQ-NP的药代动力学研究取6只6-8周ICR小鼠(体重约为25g)分成两组，每组3只，分别通过尾静脉注射PHCQ-NP和硫酸羟基氯喹，注射药物加入5％的葡萄糖配成等渗溶液，注射量为200μL，给药剂量为羟基氯喹等效剂量40mg/kg，分别在2min、30min,1h、2h、6h、11.5h和24h通过眼眶取血3～4滴，吸取50μL加入到等体积的0.1N NaOH的离心管中，混合均匀。将所取的血液样本放入37℃烘箱孵育48h，保证羟基氯喹从聚合物上完全断裂，孵育结束后，在每个离心管加入400μL乙腈，超声30min。14,800rpm离心10min，取上清液200μL，并加入200μL 0.1N的三氟乙酸水溶液，经0.22μm有机相滤头过滤，用高效液相色谱测定样品中羟基氯喹浓度，测定的药-时曲线如图9a所示，用DAS2.0软件分析药代动力学参数，结果如图9b所示。
纳米药物的特性之一在于，纳米药物能显著延长小分子药物在体内的循环时间，如图9a所示，羟基氯喹聚合物纳米颗粒PHCQ-NP在体内的循环时间明显长于小分子羟基氯喹，在注射后24h后，PHCQ-NP在血液中的浓度甚至高于羟基氯喹注射后3min的浓度。用DAS2.0软件分析药代动力学参数，采用了统计矩方法，如图9b所示，当注射的羟基氯喹等效剂量为40mg/kg时，PHCQ-NP能将药-时曲线中24小时内的曲线下面积(AUC)提高89倍。(注：图9a为药-时曲线。图9b为DAS 2.0软件分析得出的统计矩参数。AUC：曲线下面积，是计算相对生物利用度的重要参数；MRT：平均滞留时间；VRT，滞留时间的方差；Cmax，峰浓度)。
本实施例中的纳米颗粒表面引入了聚乙二醇单甲醚嵌段，聚乙二醇单甲醚具有能够避免纳米药物被网状内皮***识别的能力，且由于羟基氯喹是通过化学键键合在聚合物上，所以，相比起包裹的药物能够更加稳定存在于纳米颗粒的内核，因此本发明中的羟基氯喹聚合物纳米颗粒能够极为显著地延长羟基氯喹的循环时间，改善其药代动力学行为。

Claims (3)

1.一种羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，其特征在于，羟基氯喹聚合物作为疏水端，聚乙二醇单甲醚作为亲水端；所述的亲水端与疏水端之间通过可逆加成-断裂链转移聚合形成可降解化学键方式实现聚合；
所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体的制备方法，包括:
(1)将丙烯酰氯类化合物、丙烯酸酐类化合物或丙烯酸羟乙酯类化合物与游离羟基氯喹加入到有机溶剂中，在缩合试剂以及酰化催化剂的协同作用下，得到的式II、III所示的羟基氯喹类化合物单体结构；
Figure FDA0002820832870000011
(2)将聚乙二醇单甲醚与小分子链转移剂PETTC溶解到有机溶剂中，在缩合试剂、酰化催化剂的协同作用下，反应得到式IV所示结构的聚乙二醇单甲醚-链转移剂的大分子链转移剂：
Figure FDA0002820832870000012
n指聚合度，n＝22～1136；
(3)将步骤(1)所得到的式II、III所示的羟基氯喹类化合物单体与聚乙二醇单甲醚-链转移剂的大分子链转移剂，在引发剂的作用下通过可逆加成-断裂链转移聚合生成所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体，聚合温度为60～80℃；羟基氯喹类化合物单体的聚合度1＜m≤100。
2.根据权利要求1所述的羟基氯喹两亲性聚合物药物前体在去离子水中自组装形成的纳米颗粒，其特征在于，所述的自组装形成纳米颗粒的方法，包括透析法、溶剂挥发法、薄膜水化法或共沉淀法。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述的纳米颗粒的粒径范围为20nm-300nm。
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