CN113913245B - 一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法及草果精油 - Google Patents

一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法及草果精油 Download PDF

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Abstract

一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法及草果精油，所述提取方法包括以下步骤：取草果成熟果实，粉碎过30～50目筛，得粉末；粉末与水混合后静置2～5h，然后180～260℃下水蒸气蒸馏5～8h。本发明通过水蒸气蒸馏法实现草果精油的高效提取，提取率达到1.7％以上。本发明所得草果精油对热带假丝酵母菌表现出极强的抑制活性。抑菌圈直径达到15mm以上，MIC达到0.195μL/mL以下，MBC达到0.781μL/mL以下。

Description

一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法及草果精油
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法及草果精油。
背景技术
草果(学名：Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)是豆蔻属植物的成熟果实，又名草果子，是我国一种传统的药食两用中药材，主要分布在云南、广西、贵州和四川等地。草果精油具有抗菌、消炎、抗氧化、防腐、抗肿瘤等作用，近年来，对于其功效的研究和探索成为研究热点。
李国林等(李国林,张忠,毕阳,等.八种植物精油体外抑菌效果的比较[J].食品工业科技,2013,34(7):130-133)以水蒸气蒸馏法获得草果等8种植物精油，并验证这8种植物精油对4种真菌(链格孢、粉红单端孢、扩展青霉、黄曲霉)的体外抑菌活性。结果表明：除扩展青霉和黄曲霉外，草果精油总体上对真菌的抑制作用较弱。目前，针对草果精油对不同真菌的抑制作用的相关研究较少。申请人研究发现，草果精油对于热带假丝酵母菌具有明显抑制作用，其抑制效果与精油的提取方法存在联系。
精油通过不同的提取方法进行提取时其化学成分等差别很大，需要根据精油的使用方向去选择适合的提取方法(王瑶等，2017；Bakkali et al，2008)。因此，有必要提供一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足，为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法及草果精油。
本发明方案包括以下内容：
一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法，包括以下步骤：
取草果成熟果实，粉碎过30～50目筛，得粉末；粉末与水混合后静置2～5h，然后180～260℃下水蒸气蒸馏5～8h，水蒸气随着沸腾进入冷凝管冷却，油水分离后将得到草果精油利用微量进样器吸出，并向其中加入无水硫酸钠干燥，吸去精油中含有的水分，装于棕色精油瓶中，置于4℃冰箱中保存。
优选的，所述草果成熟果实含水量低于13％。
优选的，所述草果成熟果实：取采集后的成熟果实，在pH5.0～6.0水中浸泡，然后烘干至含水量低于13％。
优选的，在pH5.0～6.0水中浸泡的时间是3～5h。
优选的，粉末与水的质量比为1:8～10。
优选的，粉末与水混合后调节pH7.0～8.0。
优选的，粉末与水混合后调节pH7.3。
优选的，水蒸气蒸馏的温度是220～260℃。
另一方面，本发明提供一种由本发明方法提取所得的草果精油，该精油对热带假丝酵母菌表现出很好的抑制作用。
本发明所取得的有益效果：
本发明提供了一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法，通过水蒸气蒸馏法实现该草果精油的高效提取，提取率达到1.7％以上。
本发明提取方法，操作简便，不需要使用大量的化学试剂，安全高效。
本发明所得草果精油对热带假丝酵母菌表现出极强的抑制活性。抑菌圈直径达到15mm以上，MIC达到0.195μL/mL以下，MBC达到0.781μL/mL以下。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
所述草果为姜科植物草果Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire的成熟果实，购买于毫州中药材市场。
试验例1粉碎度考察
取草果成熟果实(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，分别粉碎过10、20、30、40、50、60目筛，得不同颗粒大小的粉末；分别称取不同颗粒大小的粉末50g，加入10倍质量的蒸馏水，浸泡2h，220℃下水蒸气蒸馏2h；三次重复试验。按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，测定精油提取率。精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物粉末质量(g)×100％。
结果显示：样品颗粒为30～50目时，提取率较高，达到1.5～1.7％。
试验例2料液比考察
取草果成熟果实(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，粉碎过40目筛，得粉末；称取粉末50g，分别加入5、8、10、12倍质量的蒸馏水，浸泡2h，220℃下水蒸气蒸馏2h；三次重复试验。按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，测定精油提取率。精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物粉末质量(g)×100％。
结果显示：料液比1:5～12时，提取率逐渐升高，料液比1:8～10时，提取率达到1.7％。
试验例3蒸馏时间考察
取草果成熟果实(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，粉碎过40目筛，得粉末；称取粉末50g，并将其浸泡于10倍量的蒸馏水中，浸泡2h，220℃下分别水蒸气蒸馏3、4、5、6、7、8h；三次重复试验。按照2015年版《中国药典》精油测定法“甲法”，测定精油提取率。精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物粉末质量(g)×100％。
结果显示：蒸馏时间在3～8h时，草果精油提取率快速上升。蒸馏时间5～8时，提取率变化不明显，提取率最大达到1.8％。
试验例4蒸馏温度考察
取草果成熟果实(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，粉碎过40目筛，得粉末；称取粉末50g，并将其浸泡于10倍量的蒸馏水中，浸泡2h，分别140、180、220、260、300℃下水蒸气蒸馏5h；三次重复试验。按照2020年版《中国药典》精油测定法“甲法”，测定精油提取率。精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物粉末质量(g)×100％。
结果显示：当蒸馏温度为260℃时果实精油的提取率最高，之后下降。
试验例5浸泡时间考察
取草果成熟果实(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，粉碎过40目筛，得粉末；称取粉末50g，并将其浸泡于10倍量的蒸馏水中，浸泡1、2、3、4、5、6h，220℃下水蒸气蒸馏5h；三次重复试验。按照2015年版《中国药典》精油测定法“甲法”，测定精油提取率。精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物粉末质量(g)×100％。
结果显示：浸泡时间2～5h时，精油的提取率较高，之后随着时间的延长，提取率下降。
试验例6样品预处理考察
分别取草果成熟果实①(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)、草果成熟果实②～②(采集后分别于pH4.0、5.0、6.0、7.0水中浸泡5h后再55℃干燥至含水量＜13％的成熟果实)，粉碎过40目筛，得粉末；称取粉末50g，并将其浸泡于10倍量的蒸馏水中，浸泡2h，220℃下水蒸气蒸馏5h；三次重复试验。按照2015年版《中国药典》精油测定法“甲法”，测定精油提取率。精油提取率(％)＝精油体积(mL)/植物粉末质量(g)×100％。
结果显示：果实①所得精油提取率较高。
经试验，确定以下草果精油提取条件：
取草果成熟果实(采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，粉碎过30～50目筛，得粉末；粉末与水按质量比1:8～10混合后静置2～5h，然后180～280℃下水蒸气蒸馏5～8h。
在该条件下，草果精油的提取率达到1.7％以上。其中粉碎至50目，料液比1:8，浸泡5h，260℃蒸馏6h时，草果精油提取率达到1.9％。
试验例7抑菌活性研究
7.1材料、菌种、试剂
材料：分别取采集后直接烘干至含水量＜13％的成熟果实)，采集后分别于pH4.0、5.0、6.0、7.0水中浸泡5h后55℃干燥至含水量＜13％的成熟果实；粉碎过50目筛，得粉末；称取粉末50g，并将其浸泡于8倍量的蒸馏水中，浸泡5h，220℃下水蒸气蒸馏6h后所得的精油①～精油⑤。精油⑥：取成熟果实采集后于pH5.0水中浸泡5h后55℃干燥至含水量＜13％的成熟果实；粉碎过50目筛，得粉末；称取粉末50g，并将其浸泡于8倍量的蒸馏水中，浸泡5h，260℃下水蒸气蒸馏6h后所得。
菌种：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis ATCC 20962)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillus niger ATCC 16404)购自于北京北纳创联生物技术研究院。
试剂：培养基、两性霉素B等均购自于北京索莱宝科技有限公司
7.2试验方法
7.2.1抑菌圈的测定
采用滤纸片琼脂平板扩散法，在无菌的环境条件下用移液枪取精油或对照20μL滴于无菌滤纸片(d＝6mm)上，待纸片充分吸收后贴在已均匀涂布各菌液(菌液浓度106cfu/ml、涂布量60μL)的培养基平板(PDA，d＝6cm)上，做好标记，每个菌进行3次重复，阴性对照为无菌水，阳性对照为两性霉素B(浓度15ug/m)，真菌培养条件为恒温培养箱28℃中培养48h。培养结束后，观察并记录抑菌圈的有无以及直径大小作为判断敏感度高低的标准，采用十字交叉法量取抑菌圈直径大小，取其平均值作为测定结果。结果标准为：抑菌圈直径大于20mm时为极敏、直径在15～20mm之间时为高敏，在10～15mm之间的为中敏，抑菌圈直径小于10mm的为低敏(兰仕梅等，2018)。
7.2.2最低抑菌浓度(MIC)
在96孔板上采用微量二倍稀释法进行MIC试验，将A1作为起始的第1孔，从左到右依次进行，每个板上1～12孔为药液，每个板均做3个空白、阳性对照和阴性对照，阴性对照为无菌水，阳性对照为两性霉素B。首先用移液枪向每排第1孔加入180μL各菌悬液(菌液浓度106cfu/ml)，第2～12个孔各加入100μL各菌悬液，再分别吸取20μL精油至第1孔，依次对第1～12孔做梯度稀释，使其精油浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.097μL/mL，充分混匀，重复三次，真菌培养条件为恒温培养箱28℃中培养48h，而后使用酶标仪测定真菌的吸光值，抑菌率达到80％的样品浓度就为该样品对该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
7.2.3最低杀菌浓度(MBC)的测定
采用琼脂培养基平板法，取“7.2.2”下的各样品MIC值所对应的溶液均匀涂布于相应的培养基中，培养条件为恒温培养箱28℃培养，而后观察培养基中有无菌株生长，该药物的MBC为菌落数低于5个的平板所对应孔中的最低浓度。
7.3结果及分析
结果见表1～3。结果显示，三种真菌中，草果精油对热带假丝酵母菌表现出最强的抑制活性。其中精油③和精油④对热带假丝酵母菌的抑制和杀菌效果最好。
表1各样品对3种菌的抑菌圈直径
同列不同字母表示清除率差异显著(p<0.05)；“—”为无抑菌圈
表3各样品对3种菌的MIC值
表4各样品对3种菌的MBC值
在上述试验例7的基础上，本发明还发现，当粉末与水混合后调节pH7.0～8.0再静置浸泡时所得精油，相对于未调节pH所得的精油，表现出对热带假丝酵母菌更强的抑制效果(p<0.05)。其中pH7.3时抑菌圈直径大于20mm。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：取草果成熟果实，粉碎过30~50目筛，得粉末；粉末与水混合后静置2~5h，然后220~260℃下水蒸气蒸馏 5~8 h；
所述草果成熟果实：取采集后的成熟果实，在pH5.0~6.0水中浸泡，然后烘干至含水量低于13%；所述粉末与水混合后调节pH7.0~8.0。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在pH5.0~6.0水中浸泡的时间是3~5h。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，粉末与水的质量比为1:8~10。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，粉末与水混合后调节pH7.3。
5.一种抑制热带假丝酵母菌的草果精油，其特征在于，由权利要求1~4任一项所述的提取方法制得。
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