CN113862259B - 基于DSN酶检测Hg2+的DNA生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域，具体涉及一种基于DSN酶检测Hg2+的DNA生物传感器。本发明首先公开了一种用于Hg2+浓度检测的核苷酸序列组，其包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的T‑探针、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列M和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列M4。其次还公开了一种包括上述核苷酸序列组的DNA生物传感器。本发明成功构建了一种基于DSN酶的DNA生物传感器并成功用于Hg2+的检测。该传感器具有结构简单、操作简单、灵敏度高、稳定性高以及选择性高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种基于DSN酶检测Hg2+的DNA生物传感器。
背景技术
双链特异性核酸酶(duplex-specificnuclease，DSN)是一种新型的核酸酶，已从虾、蟹等生物的消化腺或肝胰腺中成功分离出[1]。DSN酶对于双链DNA(dsDNA)以及DNA和RNA杂交体中的DNA具有特异性的剪切效果，并且对于单链DNA(sDNA)以及RNA形成的双链结构几乎没有生物活性。在对DNA-RNA杂交体中的DNA进行水解时，还可以保持RNA链的完整性。由于DSN酶的这一特性，DSN酶被广泛的应用于miRNA的检测中[2-6]。其次，DSN酶剪切dsDNA和DNA-RNA杂交体中的DNA链时，对双链的碱基对数有要求。只有当DNA双链的碱基对数大于10bp时，DSN酶才能水解DNA，而在DNA-RNA杂交体中，只有碱基对数大于15bp时，DSN酶才能对杂交体中的DNA链进行剪切。此外，DSN酶在对于相同长度的dsDNA或DNA-RNA杂交体进行水解作用时，对碱基对完全匹配的双链水解速度要高于碱基对非完全匹配的双链，基于此，DSN酶可以很好地区分单碱基错配。由于DSN酶具有的这些特性，DSN酶被广泛应用于生物医学和生物科学研究中，比如cDNA文库的构建[7,8]、基因组DNA的均一化、SNP检测[4]以及端粒末端定量检测[9]等方面。
众所周知汞是一种有毒的重金属，并且汞产品在人们的生活中随处可见。然而由于工厂污水或废弃的汞产品的处理不当等原因，自然界中就会存在一定量的汞离子，这些汞离子可以通过生物富集作用进入生物体内，进而转化成毒性更高的有机汞，并通过食物链进入人体。因此寻找一种简单、方便、廉价的测量环境中汞离子浓度的方法是很有必要的。
研究表明，汞离子可以与错配的碱基对T-T形成T-Hg2+-T结构，使得带有T-T错配碱基对的DNA链形成完全匹配的DNA双链[10-12]。而在以往的研究中，DSN酶大多被用于miRNA的检测中，很少用于对汞离子的检测中。
发明内容
在本发明中，将DSN酶与DNA生物传感器相结合，设计了两条带有T-T碱基错配的互补DNA单链，并在其中一条DNA链上修饰上FAM荧光基团以及BHQ荧光淬灭基团形成DNA荧光探针，通过加入不同浓度的汞离子使DNA形成完全匹配的DNA双链，进而被DSN酶水解，其检测结果表现为荧光强度的变化。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种用于Hg2+浓度检测的核苷酸序列组，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的T-探针、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列M和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列M4；优选的，所述T-探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
本发明第二个方面公开了一种DNA生物传感器，包括上述的核苷酸序列组；优选的，所述DNA生物传感器还包括DSN酶。
本发明第三个方面公开了上述的DNA生物传感器在检测Hg2+浓度中的应用。
本发明第四个方面公开了一种制备上述的DNA生物传感器的方法，包括：
S1：合成上述的核苷酸序列组；
S2：配制反应体系液，所述反应体系包括0.025-0.3U的DSN酶和核苷酸序列组；
S3：将反应体系液避光孵育0.5-2h，然后加入EDTA-2Na溶液终止反应，即得到DNA生物传感器。
优选的，在S2中，所述反应体系包括0.1U的DSN酶。
优选的，在S3中，避光孵育的反应温度为60℃。
优选的，在S3中，避光孵育的反应时间为1h。
优选的，在S2中，反应体系液为100μl；所述反应体系液包括1×DSN buffer、10nM的T-探针、序列M/序列M4和0.1U的DSN；其中1×DSN buffer包括50mM Tris-Hcl、10mMHEPES、5mM Mg2+、100mM Na+和25mM K+，pH8.0；DNA用HEPES缓冲液配置和稀释。
本发明第五个方面公开了使用上述的DNA生物传感器检测Hg2+浓度的方法，包括将含Hg2+的溶液加入DNA生物传感器中，再进行荧光检测。
优选的，在多功能微孔读板机上测量荧光的强度。检测FAM荧光的波长分别为：激发波长494nm，发射波长520nm。由于酶标仪的带宽限制，实际设置值为：激发波长485nm，发射波长530nm。
优选的，Hg2+的测量范围为1-10nM。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明成功构建了一种基于DSN酶的DNA生物传感器并成功用于Hg2+的检测。该传感器具有结构简单、操作简单、灵敏度高、稳定性高以及选择性高的特点。
附图说明
图1为本发明实施例中DNA生物传感器检测Hg2+的示意图；
图2为本发明实施例中不同浓度的DSN酶测出的荧光强度示意图；
图3为本发明实施例中不同的反应时间测出的荧光强度示意图；
图4为本发明实施例中不同的反应温度测出的荧光强度示意图；
图5为本发明实施例中DNA生物传感器的选择性分析示意图。
图6为本发明实施例中DNA生物传感器的灵敏度分析示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
试剂和仪器
HEPES(上海碧云天生物技术有限公司)，EDTA-2Na、Tris-Hcl(上海生工生物工程股份有限公司)，MgCl2·6H2O、NaCl、KCl、Hg(NO3)2、CuCl2、CaCl2(上海泰坦科技股份有限公司)，DSN(俄罗斯Evrogen股份有限公司)。
Mill-Q纯水仪(≥18.2MΩ，美国Millipore)，电子天平(托利多仪器(上海)股份有限公司)，Centrifuge 5424R离心机(德国Eppendorf公司)，DGG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)，SpectraMax ID3多功能微孔读板机(美谷分子仪器(上海)有限公司)，PHSJ-3FpH计(上海精密仪器有限公司)，摇床(上海旻泉仪器有限公司)。
实施例1
本实施例公开了一种DNA生物传感器的设计及检测方法。其工作原理如图1所示。
实验中设计的传感器中使用的DNA探针的序列如表1所示。本实验中所有的DNA探针的合成及纯化均来自生工生物工程(上海)股份有限公司。其中T-探针是在DNA链的5’端修饰了一个6-FAM荧光基团、3’端修饰了一个BHQ-1荧光淬灭基团的DNA序列，而Match(M)是一段与T-探针完全互补的DNA序列，Mis-match-4(M4)则是一段与T-探针有四个碱基错配的DNA序列，错配的碱基对为两个胸腺嘧啶(T)，以便于与汞离子形成T-Hg2+-T结构。
表1 DNA序列信息
本实验的实验体系为100μl，缓冲液为1×DSNbuffer(含50mM Tris-Hcl、10mMHEPES、5mM Mg2+、100mM Na+和25mM K+，pH8.0)，含有10nM的T-探针、M4和不同浓度的Hg2+溶液以及0.1U的DSN。其中DNA用HEPES缓冲液(含10mM HEPES、10mM Mg2+、100mM Na+和25mM K+，pH7.0)配置和稀释；Hg2+溶液的体积为20μl，使用1×DSN buffer对其进行稀释。将混合液置于60℃的环境避光孵育1h后，加入30μl的10mM EDTA-2Na于60℃反应5min以终止反应，最后在多功能微孔读板机上测量荧光的强度。
实施例2
本实施例研究不同的DSN酶量对荧光检测结果的影响。具体操作为：
选用了0.025U、0.05U、0.075U、0.1U、0.2U和0.3U六组不同的DSN酶用量梯度来对相同浓度的DNA探针进行了水解反应。六组试验中除了DSN酶用量不一样之外，其他条件相同。结果如图2所示，在DSN酶的量小于0.1U时，荧光强度随着酶用量的增加而增加并在0.1U处取得最大值，随后当酶的用量继续增加时，荧光强度几乎没有变化，因此，当酶的用量为0.1U时，荧光强度最大，因此，在一些优化的实施例中，我们选用0.1U作为DSN酶的用量。
实施例3
为了使酶和底物充分的反应，我们对酶反应的时间进行了优化，如图3所示，当反应时间小于60min时，荧光强度与反应进行的时间成正比，说明时间太短会造成酶与底物不能充分反应。当反应时间再延长时，反应时的温度可能会对FAM造成影响，使荧光强度有所降低，因此酶反应的优化时间为60min。
实施例4
为了提高酶的剪切效率，我们对实验中酶的反应温度进行了优化，我们设定了从40到70摄氏度的六个温度梯度，其结果如图4所示。在温度小于60℃时，荧光强度强度的大小随着温度的升高而增大，随后当反应温度继续升高时，荧光强度几乎没有变化。从图4中可以看出在温度达到60℃时，酶的工作效率已基本达到最高，因此在酶反应的优化温度为60℃。
实施例5
通过对实验条件的优化，我们在最优条件下我们对传感器的灵敏度以及选择性进行了分析。图5显示了传感器的选择性，可以看出我们设计的传感器在Hg2+存在时，荧光强度明显高于其他二价阳离子，由此可见在本研究中我们构建的DNA生物传感器具有良好的选择性。
实施例6
图6显示了实施例1中传感器的灵敏度分析结果。我们分别对不同浓度的Hg2+进行了荧光强度的检测，荧光强度的大小随着Hg2+浓度的增加而增大，在1-10nM的浓度范围内呈线性增加，其线性回归方程为Y＝0.025X+517(R2＝0.99)，检测限为10fM，S/N≥3。图6中检测的Hg2+浓度梯度分别为：10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM、4nM、10nM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 基于DSN酶检测Hg2+的DNA生物传感器
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Claims (9)
1.一种用于Hg2+浓度检测的核苷酸序列组，其特征在于，包括：核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的T-探针、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的序列M和核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的序列M4；所述T-探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
2.一种DNA生物传感器，其特征在于，包括权利要求1所述的核苷酸序列组；所述DNA生物传感器还包括DSN酶。
3.根据权利要求2所述的DNA生物传感器在检测Hg2+浓度中的应用。
4.一种制备权利要求2所述的DNA生物传感器的方法，其特征在于，包括：
S1：合成权利要求1所述的核苷酸序列组；
S2：配制反应体系液，所述反应体系包括0.025-0.3 U的DSN酶和核苷酸序列组；
S3：将反应体系液避光孵育0.5-2h，然后加入EDTA-2Na溶液终止反应，即得到DNA生物传感器。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S2中，所述反应体系包括0.1 U的DSN酶。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S3中，避光孵育的反应温度为60℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S3中，避光孵育的反应时间为1h。
8.使用权利要求2所述的DNA生物传感器检测Hg2+浓度的方法，其特征在于，包括将含Hg2+的溶液加入DNA生物传感器中，再进行荧光检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，Hg2+的测量范围为1-10nM。
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