CN113861021A - 一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用 - Google Patents

一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用，主要通过石油醚提取、减压蒸馏、有机溶剂梯度洗脱和液相色谱分离等分离步骤，得到本发明的不饱和脂肪酸化合物I。药物活性实验表明本发明化合物具有较好的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，说明其在制备预防或治疗糖尿病药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用
技术领域
本发明涉及诺丽果化学领域，特别涉及一种不饱和脂肪酸类化合物及其分离方法和应用。
背景技术
诺丽(MorindaCitrifolia)又名海巴戟，为茜草科(Rubiaceae)海巴戟天属(Morinda)的常绿灌木或小乔木，集中分布于热带、亚热带地区，在我国主要分布于海南岛、西沙群岛和台湾岛等地。《本草纲目》记载，“海巴戟”具有“扶正祛邪，滋阴补肾、壮阳，祛风湿、治冷宫***、治阳痿”之功。诺丽果是一种具有独特保健作用的聚花果，由其发酵产生的原汁(诺丽酵素)为广受欢迎的保健饮品，具有降三高(高血糖、高血压、高血脂)、抗肿瘤等功效。
研究报道诺丽果的化学成分主要为苯丙素(苷)类、黄酮(苷)类、二萜、三萜、环烯醚萜类、酚酸类等类型化合物，且都具有较好的生物活性。关于诺丽种子的化学成分研究报道较少。本发明旨在对诺丽种子化学成分研究，以期得到具有显著降血糖作用的新结构化合物，充分挖掘诺丽这一保健水果的药用价值。
专利CN202110344488.X不饱和脂肪酸类化合物及其制备方法和应用，从红背山麻杆中提取不饱和脂肪酸类化合物，该化合物具有加强神经细胞分化功能，没有说明本发明中不饱和脂肪酸类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。专利不饱和脂肪酸化合物及其制备方法和应用，该申请从从海洋真菌Aspergillus sp.GDMCC 61218的发酵液中分离得到，这类不饱和脂肪酸化合物具有明显的抑制植物病原真菌活性，可用于制备抗植物病原真菌农药，该申请没有说明本发明中不饱和脂肪酸类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。因此本发明提出一种从诺丽果种子中提取得到具有抑制α-葡萄糖苷酶作用的不饱和脂肪酸类化合物。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种新结构的不饱和脂肪酸类化合物，具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，并提供目标化合物的分离方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
包括以下步骤：
(1)将诺丽种子粉碎，制得诺丽种子粉末，加入石油醚超声提取，料液比为1kg：4～5L，提取次数为3～6次，提取时间为1～3h，合并提取液，将提取液减压浓缩制得浸膏；
(2)将步骤(1)制得的浸膏，使用硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，制得洗脱组分1，即得Fr.1～6组分；
(3)将Fr.2组分先使用正相硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，得到洗脱组分2，将洗脱组分2减压浓缩后，再经凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿和甲醇混合液，得到洗脱组分3，将洗脱组分3减压浓缩后再经高效液相色谱仪制备，得到不饱和脂肪酸类化合物I。
进一步的，步骤(1)中，所述超声频率为30～50kHz，超声时间每次15-30min。
进一步的，步骤(2)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为100～1:1。
进一步的，步骤(3)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为20～1:1，所述氯仿和甲醇体积比为5:1。
进一步的，步骤(3)中，所述凝胶柱型号为Sephadex LH-20。
进一步的，所述洗脱剂洗脱体积为3～6个柱体积。
进一步的，步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为C18(100×2.1mm，1.7μm)，流速为2mL/min，流动相为体积比40:60的乙腈和水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明从诺丽种子中提取分离出不饱和脂肪酸类化合物I，具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。进一步的，本发明通过极性溶剂浸提、溶剂梯度洗脱和液相色谱分离等多级分离提取方法，从诺丽种子中得到该不饱和脂肪酸类化合物。
附图说明
图1：化合物I的1H-NMR谱(MeOD-d4)
图2：化合物I的13C-NMR谱(MeOD-d4)
图3：化合物I的DEPT(135°)谱(MeOD-d4)
图4：化合物I的1H-1H COSY谱(MeOD-d4)
图5：化合物I的HSQC谱(MeOD-d4)
图6：化合物I的HMBC谱(MeOD-d4)
图7：化合物I的HRESIMS谱
图8：化合物I结构图
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1诺丽果种子洗脱组分1的制备方法
(1)将诺丽种子粉碎，制得诺丽种子粉末，加入石油醚超声提取，超声频率为40kHz，超声时间每次20min，料液比为1kg：4L，提取次数为4次，提取时间为2h，合并提取液，将提取液减压浓缩制得浸膏；
(2)称取50g步骤(1)制得的浸膏，使用硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为100:1、70:1、30:1、10:1、5:1、1:1进行洗脱，每个梯度收集3个柱体积，每个梯度得到一个组分，共得到6个组分，即组分1～6。
使用高效液相色谱仪检测含量，色谱条件为检测条件：
检测波长220nm；
色谱柱：Waters C18(100×2.1mm，1.7μm)；
进样体积：2μl；
流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水；
洗脱梯度：(0～4min，5％～15％A；4.01～12min，15％～25％A；12.01～18min，25％～40％A；18.01～23min，40％～90％A；23.01～25min，90％～5％A)
体积比 100:1 70:1 30:1 10:1 5:1 1:1
含量(％) 40.37 43.19 41.31 39.12 37.61 35.13
实验结果表明，本发明中采用石油醚和乙酸乙酯体积比为70:1洗脱得到的不饱和脂肪酸类化合物含量最高。
实施例2诺丽果种子洗脱组分2的制备方法
将实施例1得到的洗脱组分2使用正相硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为100:1、70:1、30:1、10:1、5:1、1:1进行洗脱，收集各梯度洗脱组分进行检测。
检测条件同实施例1
体积比 20:1 10:1 30:1 5:1 1:1
含量(％) 60.13 65.12 58.42 53.11 54.62
实验结果表明，本发明中使用正相硅胶柱层析，采用石油醚和乙酸乙酯体积比为10:1洗脱得到的不饱和脂肪酸类化合物含量最高。
实施例3诺丽果种子不饱和脂肪酸类化合物的制备方法
将实施例2得到的洗脱组分2进行减压浓缩，再经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂由体积比为1:1的氯仿和甲醇制得，洗脱量为4个柱体积，得到洗脱组分3，将洗脱组分3减压浓缩后再经高效液相色谱仪制备，色谱条件为：Waters C18色谱柱，流速为2mL/min，流动相为体积比40:60的乙腈和水，得到不饱和脂肪酸类化合物I。
试验例1不饱和脂肪酸类化合物的结构鉴定
运用波谱(1H NMR，13C NMR，HSQC，HMBC，NOESY)和MS等现代结构鉴定技术，确定实施例3不饱和脂肪酸类化合物I的化学结构。
结构鉴定数据如下：化合物I为无色油状物，易溶于甲醇。经高分辩质谱HRESI(-)MS(m/z181.0860[M-H]-，理论值181.0865)确定其分子式为C10H14O3；根据1H，13C及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为不饱和脂肪酸。由于分子中只含有一个手性中心，经测定化合物I的旋光值为(
Figure BDA0003326198040000052
(c 0.10,MeOH)，对照文献数据，碳9位构型为S。因此，化合物鉴定为(S,2E,4Z,7Z)-9-羟基十碳-2,4,7-三烯酸[(S,2E,4Z,7Z)-9-hydroxydeca-2,4,7-trienoic acid]，将其命名为moricitacid A，其1H和13CNMR数据归属见表1。
表1.化合物I的1H-NMR(400MHz)和13C-NMR(100MHz)数据
Figure BDA0003326198040000051
经以上分析，确定化合物I结构，参见图8。
试验例2药理活性实验
实验材料：
96孔板、恒温培养箱、酶标仪(ELx800)、恒温振荡器、阿卡波糖(Acarbose)、α-葡萄糖苷酶、对硝基酚、对硝基苯-α-D-葡萄糖苷
实验方法：
按要求配制好底物PNPG溶液，0.2mol/L的Na2CO3溶液，α-葡萄糖苷酶的酶溶液，以阿卡波糖标准溶液为抑制剂。
依次取已制备的50μL磷酸盐缓冲液(pH 6.8)，20μL化合物I(终浓度分别为0.6,0.3,0.15,0.0725mg·mL-1)，10μLα-葡萄糖苷酶(1.0U·mL-1)，20μL2.5mmol·L-1底物(对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液，混匀后在37℃下孵育15分钟，然后加入150μL Na2CO3溶液终止反应。供试品混合均匀后在405nm波长处测定吸光度(A)值，即在酶的作用下底物释放出的硝基酚量。平行测定3次，取平均值。按下式计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率：
抑制率(％)＝[1-(A405nm sample-A405nm blank)/A405nm control]×100
式中，A405nm sample表示样品的A值，A405nm blank表示空白的A值(排除样品和酶的干扰)，A405nm control表示排除样品干扰的A值。
化合物的α-葡萄糖苷酶抑制作用的结果如表2所示，从实验结果可知，化合物I表现出较好的α-葡萄糖苷酶抑制效果，IC50为243μM。
表2化合物I的α-葡萄糖苷酶抑制活性
化合物 IC<sub>50</sub>/μM
I 243
<sup>a</sup>Acarbose 135.4
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种不饱和脂肪酸类化合物，其特征在于，所述化合物结构式如下：
Figure FDA0003326198030000011
2.如权利要求1所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将诺丽种子粉碎，制得诺丽种子粉末，加入石油醚超声提取，料液比为1kg：4～5L，提取次数为3～6次，提取时间为1～3h，合并提取液，将提取液减压浓缩制得浸膏；
(2)将步骤(1)制得的浸膏，使用硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，制得洗脱组分1，即得Fr.1～6组分；
(3)将Fr.2组分先使用正相硅胶柱洗脱分离，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯制得，得到洗脱组分2，将洗脱组分2减压浓缩后，再经凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿和甲醇混合液，得到洗脱组分3，将洗脱组分3减压浓缩后再经高效液相色谱仪制备，得到不饱和脂肪酸类化合物I。
3.如权利要求2所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声频率为30-50kHz，超声时间15-30min。
4.如权利要求2所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为100～1:1。
5.如权利要求2所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为20～1:1，所述氯仿和甲醇体积比为5:1。
6.如权利要求2所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，所述凝胶柱型号为Sephadex LH-20。
7.如权利要求2所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中，所述洗脱剂洗脱体积为3～6个柱体积。
8.如权利要求2所述的不饱和脂肪酸类化合物的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高效液相色谱仪的色谱条件为：色谱柱为C18，流速为2mL/min，流动相由体积比40:60的乙腈和水制得。
9.如权利要求1所述的不饱和脂肪酸类化合物的应用，其特征在于，所述化合物应用于预防或治疗糖尿病药物中。
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