CN113897406A - 一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，该方法包括：(1)预处理：将红景天粉末与磷酸溶液混合，热处理后，调节pH，加入复合酶，酶解后制得红景天粗提液；(2)酵母菌种子液制备；(3)酵母菌发酵得红景天发酵液；(4)分离纯化得红景天苷提纯液。按照本发明的方法酶解、发酵提取、提纯后，红景天苷的提取率达到了90.8％‑92.3％，纯度也由2.8％提高为50‑55％，实现红景天苷提取产量和纯度的大幅度提升。本发明方法具有低成本、操作简单、高效率、高提取率且能够连续生产的特点，对于进行大规模地生产高纯度的红景天苷有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及到一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法。
背景技术
红景天苷，即2-(4-羟苯基)乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(C14H20O7)，是从各种天然的红景天植物中，例如大花红景天(Rhodiolacrenulata)、蔷薇红景天(Rhodiolarosea L)、高山红景天(Rhodiolasachalinensis)分离鉴定出来的一种酪醇糖苷化合物，是红景天植物中最主要、最有效的活性成分之一，最早作为中药使用。红景天苷已被证实具有良好的抗高原反应、抗炎、抗氧化、抗疲劳、提高精力、抗骨质疏松、抗衰老等生理作用。近些年，研究者还发现其在某些癌症和肿瘤的治疗方面也发挥了显著疗效，对糖尿病也展现出一定的治疗作用。红景天苷因其突出的药理和保健作用吸引了越来越多的关注，其作为功能性成分已被广泛应用于医药、化妆品和特医食品等行业，市场需求日渐扩大，因此，对红景天中有效成分的提取和纯化方法的研究也就显得比较重要，生产成本低、操作简单、易于大规模工业化生产的红景天苷提取纯化方法亟待开发。
目前，提取和纯化红景天苷的现有技术主要有以下几种：一是浸提法，利用相似相溶原理，根据不同组分在溶剂中的溶解度差异，对红景天苷进行分离提取。通常是先将红景天根茎干物料粉碎后研磨成粉，然后采用水或乙醇对红景天苷进行提取。王威等分别用水蒸煮和乙醇蒸煮对红景天中有效成分红景天苷进行提取，水蒸煮条件为：水蒸煮两次，每次30min；乙醇蒸煮条件为：70％乙醇热蒸煮两次，每次30min；两者的得率分别为0.16％和0.14％(王威,刘传斌,修志龙.高山红景天苷提取新工艺[J].中草药.1999,30(11):824-826.)。二是有机溶剂联合树脂法，该方案通常是在使用乙醇、***等对红景天苷粗提取之后，再联合大孔树脂的萃取作用来提高其纯度，如发明专利CN201610688538.5得收率为1.6-2.1％。另有专利CN201910168702.3先利用乙醇回流从红景天预处理粉末中提取红景天苷，最后用大孔吸附树脂进行吸附纯化，但是并未提供红景天苷的提取率和纯度值。上述浸提法和有机试剂结合树脂纯化这两种方法，分离选择效果相对较差，目标成分损失大，比较容易造成低的提取率和低的纯度，并且后处理工艺也比较困难，醇耗量很大，导致较高的生产成本。三是物理法联合树脂使用，在发明专利CN201810718980.7、CN201610918396.7、CN201310463903.9和CN201510273811.3中，红景天被粉碎之后，先通过物理超声波或微波辅助乙醇进行粗提取物的预处理，再通过醇沉或大孔吸附树脂层析纯化；另外，还有发明专利CN201710694349.3将红景天粉末利用高频磁场活化，再加入乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等溶剂分离红景天苷；以及最新发明专利CN202110049505.7提供了一种借助磁性颗粒材料提取红景天苷的工艺，该磁性颗粒需先通过酪胺将镍或钯络合物固定在磁性二氧化硅颗粒表面制备所得，然后与红景天粉末混合孵化，置于磁场中吸引分离，得到的磁性颗粒浸泡于洗脱液中，再次置于磁场中吸引分离，后将得到的样液进行乙酰化，与五乙酰基葡萄糖在磁性颗粒的催化下反应，反应物脱乙酰基处理后，得到红景天苷。此方法除了分离纯化操作工艺比较复杂之外，对操作人员的技术要求也比较高，且生产成本(包括设备或材料等)也很高，目前基本处于实验室探索阶段，不利于工业化应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，主要是酶解后利用天然酵母菌株通过发酵后进行树脂层析的方式获得提取率高、纯度较高的红景天苷产品，提纯工艺简单，节能环保。而利用生物法提取纯化红景天苷尚未见报道。
本发明的技术方案如下：
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：将红景天粉末与磷酸溶液混合，热处理后，调节pH至4.5～5.8，加入复合酶，所述复合酶由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶组成；30～60℃酶解9～12h，制得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酵母菌活化后接种于种子培养基中，培养得酵母菌种子液；
(3)发酵：将步骤(2)的酵母菌种子液接种至步骤(1)的红景天粗提液中，28～40℃静置发酵24～72h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)的红景天发酵液离心取上清液，纯化后得红景天苷提纯液。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述红景天粉末为红景天干根茎直接粉碎后的红景天粉末或经有机溶剂提取后的红景天提取物粉末。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述磷酸溶液的浓度为0.01～0.1wt％。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述红景天粉末与磷酸溶液的质量体积之比为1～3:1，单位g/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述热处理的方法为：121～160℃热处理14～45分钟，后冷却至50～60℃。
根据本发明优选的，步骤(1)所述复合酶中葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶的质量比1:1:2。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述复合酶与红景天粉末的投料质量比为(0.05-0.1)：(10-50)。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述复合酶为固体粉末状。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述酵母菌为酿酒酵母、***克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述活化是将酵母菌接种于YPD固体培养基中，20～37℃静置培养。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述种子培养基为YPD液体培养基。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述培养的条件为20～37℃、100～200rpm，培养至酵母菌种子液OD600为0.6～0.8。
根据本发明优选的，步骤(3)中酵母菌种子液的接种量为5～10％，为质量百分比。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述离心的条件为8000～12000rpm离心10～20min。
根据本发明优选的，步骤(4)中所述纯化为将上清液抽滤后经过400kDa纳膜脱色除杂，再通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
根据本发明优选的，步骤(4)中的红景天苷提纯液经干燥后可以得到红景天苷提纯粉末。
本发明中，红景天粉末原料通过加水溶解后经HPLC-UV检测红景天苷粉末原料纯度为2.8％；按照本发明的方法，通过磷酸溶液溶解、复合酶酶解、微生物发酵、离心、纳滤和HP20大孔吸附树脂层析纯化后，红景天苷的提取率达到了90.8％-92.3％，纯度也由2.8％提高至50-55％，实现红景天苷提取产量和纯度的大幅度提升。
有益效果：
1、本发明中第一次利用葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶(质量比1:1:2)这三种酶协同预处理红景天粉末原料，使原料中的红景天苷最大限度的溶出，酶反应条件温和，更有利于保护红景天苷的生物活性，保证其提取率显著提升。
2、本发明利用酿酒酵母、***克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母对红景天粉末进行发酵后提纯获得红景天苷提纯液，显著地提高了红景天苷的提取率和纯度。而目前市售的红景天粉末通常是通过粉碎研磨成粉，或是再用有机试剂(甲醇、乙醇等)进行简单的提取所得，因此其中红景天苷的提取率和纯度都比较低。本发明利用酸解和酶解预处理红景天粉末后，采用微生物发酵法提取红景天苷，不仅极大地提高了其提取率，且纯度也得到了明显提升，本发明方法具有条件温和、产物易分离、生产周期短、易调控等优点，有机试剂使用少，极大地保护了红景天苷的食用和药用价值，有利于进行大规模的工业化生产推广。
3、本发明可以解决红景天植物直接粉碎制备红景天粉末或者有机溶剂法提取红景天苷提取效率低，产品纯度低，分离纯化工艺也比较复杂的难题。按照本发明的方法酶解、发酵提取、提纯后，红景天苷的提取率达到了90.8％-92.3％，纯度也由2.8％提高为50-55％，实现红景天苷提取产量和纯度的大幅度提升。综上所述，本发明方法具有低成本、操作简单、高效且能够连续生产的特点，对于进行大规模地生产高纯度的红景天苷有着良好的应用前景。
附图说明
图1为原料红景天粉末纯水溶解后的HPLC图谱。
图2为实施例1红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图3为实施例2红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图4为实施例3红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图5为对比例1红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图6为对比例2红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图7为对比例3红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图8为对比例4红景天苷提纯液的HPLC图谱。
图9为对比例5红景天苷提纯液的HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合实施例、对比例以及说明书附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，以下实施例、对比例用于说明本发明，但是本发明的保护范围并不限于此。
本发明中若无特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域工作人员所熟知的常规手段。
本发明中所用的红景天粉末为经有机溶剂粗提取后的红景天提取物粉末(纯度3％)，为普通市售品；红景天苷标准品、葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶以及HP20大孔吸附树脂均为普通市售品；酿酒酵母、***克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母也为普通市售品，可从济南圣和化工有限公司、上海信裕生物科技有限公司或丰寿(上海)生物科技有限公司获得。
YPD液体培养基：胰蛋白胨2％、酵母提取物1％、葡萄糖2％；固体培养基则额外添加1.5％琼脂粉，均为质量百分比。
红景天苷标准品梯度溶液制备：取红景天苷标准品0.1mg，加入100μL的超纯水中，混匀后得1mg/mL的初级标准品溶液，放置-20℃下储藏备用；取初级标准品溶液10μL，加入90μL超纯水，得浓度为100mg/L标准品溶液，分别逐级稀释成不同的浓度，得到红景天苷的标准品梯度溶液；然后，使用高效液相色谱(HPLC)对各梯度标准品进行检测。检测条件为波长280nm，流速0.5mL/min，流动相为乙腈-0.1％甲酸水，紫外检测器。根据检测结果，绘制标准曲线为y＝2295997x-34651，R2＝1，在0.01-2mg/mL线性关系良好，红景天苷出峰时间为10.080-13.100min。
采用高效液相色谱对原料红景天粉末中的红景天苷进行检测：取10mg红景天粉末加入10mL纯水溶解，12000rpm离心20min取上清，使用0.22μm滤膜滤过后进行HPLC检测，检测条件为：波长280nm，流速0.5mL/min，流动相为乙腈-0.1％甲酸水，紫外检测器。检测结果如图1所示。
从图1中的液相图谱可以看出原料红景天粉末中的杂峰比较多，且结合标准曲线和HPLC图谱计算得出，原料红景天粉末中红景天苷的浓度为0.028mg/mL，则其含量为28mg/g红景天粉末，利用公式“红景天苷纯度＝红景天苷质量/红景天粉末质量*100％”计算，其纯度为2.8％。
实施例1
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取10g红景天粉末于三角瓶中，加入10mL 0.1wt％的磷酸溶液，121℃恒温处理30分钟，静置冷却至60℃后，用氢氧化钠溶液调pH至5.8，加入100mg由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶组成的复合酶，葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶的质量比为1:1:2，再加入纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，150rpm酶解12h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酿酒酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的酿酒酵母接种于1L YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.8，得酿酒酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得酿酒酵母种子液按照接种量5wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，37℃静置发酵培养48h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液12000rpm离心20min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色除杂，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件为：波长280nm，流速0.5mL/min，流动相为乙腈-0.1％甲酸水，紫外检测器，与红景天标准品的检测方法一致。检测结果如图2所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本实施例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.50mg/mL，质量为254.5mg，红景天苷的提取率为90.9％。
将本实施例所得红景天苷提纯液干燥后得高纯度红景天苷粉末，纯度为50.0％。
实施例2
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取15g红景天粉末于三角瓶中，加入6mL 0.01wt％的磷酸溶液，155℃恒温处理30分钟，静置冷却至50℃后，用氢氧化钠溶液调pH至4.5，加入50mg由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶组成的复合酶，葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶的质量比为1:1:2，再加入纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，200rpm酶解9h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将***克鲁维酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的***克鲁维酵母接种于1.5L YPD液体培养基中，置于摇床中25℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.6，得***克鲁维酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得***克鲁维酵母种子液按照接种量10wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，30℃静置发酵培养56h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液8000rpm离心10min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色除杂，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图3所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本实施例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.52mg/mL，质量为382.7mg，红景天苷的提取率为91.1％。
将本实施例所得红景天苷提纯液干燥后得高纯度红景天苷粉末，纯度为51.9％。
实施例3
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取20g红景天粉末于三角瓶中，加入10mL 0.01wt％的磷酸溶液，140℃恒温处理20分钟，静置冷却至55℃后，用氢氧化钠溶液调pH至5.0，加入80mg由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶组成的复合酶，葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶的质量比为1:1:2，再加入纯水定容至500mL，置于摇床中，在40℃下，120rpm酶解10h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将乳酸克鲁维酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的乳酸克鲁维酵母接种于2L YPD液体培养基中，置于摇床中37℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.7，得乳酸克鲁维酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得乳酸克鲁维酵母种子液按照接种量8wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，35℃静置发酵培养64h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液10000rpm离心15min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色除杂，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图4所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本实施例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.54mg/mL，质量为516.7mg，红景天苷的提取率为92.3％。
将本实施例所得红景天苷提纯液干燥后得高纯度红景天苷粉末，纯度为54.1％。
对比例1
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取10g红景天粉末于三角瓶中，直接加入纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，150rpm摇匀震荡12h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酿酒酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的酿酒酵母接种于1L YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.8，得酿酒酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得酿酒酵母种子液按照接种量5wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，37℃静置发酵培养48h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液12000rpm离心20min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色除杂，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图5所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本对比例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.29mg/mL，质量为174.3mg，红景天苷的提取率为62.3％；干燥后得红景天苷粉末，纯度为29.0％。HPLC检测图谱中可以看出杂峰较多，且红景天苷提取率和纯度都有所降低，说明没有经过稀酸和酶解预处理的红景天粉末直接进行发酵、层析之后，还是有一些杂质物质无法被酵母降解，存在于红景天提取物中，导致纯度降低。另外，可能有一部分红景天苷随着抽滤的固体杂质而损失，导致提取率也降低。
对比例2
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取10g红景天粉末于三角瓶中，加入10mL纯水，121℃恒温处理30分钟，静置冷却至60℃后，用氢氧化钠溶液调节pH至5.8，加入100mg由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶组成的复合酶，葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶的质量比为1:1:2，再用纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，150rpm摇匀震荡12h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酿酒酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的酿酒酵母接种于1L YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.8，得酿酒酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得酿酒酵母种子液按照接种量5wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，37℃静置发酵培养48h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液12000rpm离心20min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色和除杂质，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图6所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本对比例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.36mg/mL，质量为196.3mg，红景天苷的提取率为70.1％；干燥后得红景天苷粉末，纯度为35.8％。
相比于实施例1，对比例2中红景天苷的提取率和提取纯度都显著降低，且HPLC图谱中杂峰较多；相比于对比例1，对比例2的HPLC图谱中杂峰稍少，且所得红景天苷提取率和纯度也有提升。以上结果说明加了复合酶处理红景天原料粉末后，降低了一些纤维素杂质对发酵提取和纯化目的产品的影响，但是无酸解处理，也导致了一些杂质物质无法被酵母菌利用，影响了红景天苷的提取和纯化。
对比例3
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取10g红景天粉末于三角瓶中，加入10mL 0.1wt％的磷酸溶液，121℃恒温处理30分钟，静置冷却至60℃后，用氢氧化钠溶液调节pH至5.8，仅加入100mg葡聚糖酶，再用纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，150rpm摇匀震荡12h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酿酒酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的酿酒酵母接种于1L YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.8，得酿酒酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得酿酒酵母种子液按照接种量5wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，37℃静置发酵培养48h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液12000rpm离心20min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色和除杂质，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图7所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本对比例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.41mg/mL，质量为225.1mg，红景天苷的提取率为80.4％；干燥后得红景天苷粉末，纯度为40.9％。
相比于实施例1，对比例3中红景天苷的提取率和提取纯度都有所降低，且HPLC图谱中杂峰较多；相比于对比例1，本对比例HPLC图谱中杂峰稍少，且所得红景天苷提取率和纯度也有所提升。以上结果说明经酸和葡聚糖酶处理红景天原料粉末后，降低了一些纤维素等杂质对发酵提取和纯化目的产品的影响，但是仅采用葡聚糖酶酶解，其酶解效果不如复合酶的酶解效果。
对比例4
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取10g红景天粉末于三角瓶中，加入10mL 0.1wt％的磷酸溶液，121℃恒温处理30分钟，静置冷却至60℃后，调节pH至5.8，仅加入100mg阿魏酸酯酶，再用纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，150rpm摇匀震荡12h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酿酒酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的酿酒酵母接种于1L YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.8，得酿酒酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得酿酒酵母种子液按照接种量5wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，37℃静置发酵培养48h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液12000rpm离心20min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色和除杂质，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图8所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本对比例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.45mg/mL，质量为228.2mg，红景天苷的提取率为81.5％；干燥后得红景天苷粉末，纯度为45.2％。
相比于实施例1，对比例4中红景天苷的提取率和提取纯度都有所降低，且HPLC图谱中杂峰较多；相比于对比例1，本对比例HPLC图谱中杂峰稍少，且所得红景天苷提取率和纯度也有所提升。以上结果说明经酸和阿魏酸酯酶处理红景天原料粉末后，降低了一些纤维素等杂质对发酵提取和纯化目的产品的影响，但是仅采用阿魏酸酯酶酶解，其酶解效果不如复合酶的酶解效果。
对比例5
一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：取10g红景天粉末于三角瓶中，加入10mL 0.1wt％的磷酸溶液，121℃恒温处理30分钟，静置冷却至60℃后，调节pH至5.8，仅加入100mg纤维素酶，再用纯水定容至500mL，置于摇床中，在50℃下，150rpm摇匀震荡12h，制备得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酿酒酵母接种于YPD固体培养基中，30℃的恒温培养箱中活化培养，然后将活化的酿酒酵母接种于1L YPD液体培养基中，置于摇床中30℃，200rpm进行摇瓶培养至OD600为0.8，得酿酒酵母种子液；
(3)发酵：将步骤(2)所得酿酒酵母种子液按照接种量5wt％接入步骤(1)所得红景天粗提液中，37℃静置发酵培养48h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)所得红景天发酵液12000rpm离心20min取上清液，将离心后的上清液进行抽滤，再经过400kDa纳膜脱色和除杂质，之后通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液。
将所得红景天苷提纯液使用高效液相色谱(HPLC)进行检测，检测条件同实施例1。检测结果如图9所示。
结合标准曲线和HPLC检测图谱，计算得出本对比例中所得红景天苷提纯液的红景天苷浓度为0.48mg/mL，质量为241.6mg，红景天苷的提取率为86.3％；干燥后得红景天苷粉末，纯度为47.7％。
相比于实施例1，对比例5中红景天苷的提取率和提取纯度都有所降低，且HPLC图谱中杂峰较多；相比于对比例1，本对比例HPLC图谱中杂峰稍少，且所得红景天苷提取率和纯度也有所提升。以上结果说明经酸和纤维素酶处理红景天原料粉末后，降低了一些纤维素等杂质对发酵提取和纯化目的产品的影响，但是仅采用纤维素酶酶解，其酶解效果不如复合酶的酶解效果。
上述实施例1～3和对比例1～5的制得红景天苷的分析结果如表1所示。
表1.本发明实施例1～3和对比例1～5的检测分析结果
| 红景天苷提取率 | 红景天苷提纯粉末纯度 | |
| 实施例1 | 90.8％ | 50％ |
| 实施例2 | 91.1％ | 51.9％ |
| 实施例3 | 92.3％ | 54.1％ |
| 对比例1 | 62.3％ | 29.0％ |
| 对比例2 | 70.1％ | 35.8％ |
| 对比例3 | 80.4％ | 40.9％ |
| 对比例4 | 81.5％ | 45.2％ |
| 对比例5 | 86.3％ | 47.7％ |
综上所述，采用本发明的方法，经过酸解、复合酶酶解、酵母菌发酵后，纯化得到的红景天苷提取率及产品纯度均大幅度提升，红景天苷的提取率达到了90.8～92.3％，纯度为50～55％。在红景天粉末原料中，纤维素等杂质束缚了红景天苷的释放，不利于红景天苷的提取和纯化，本发明通过酸解，改变纤维素等杂质的致密结构，然后采用复合酶对纤维素等杂质进行分解，进一步改变了纤维素等杂质的结构，促进红景天苷的释放，再利用酵母菌将酶解后的小分子物质代谢降解掉，进一步促进了红景天苷的释放。另外，本发明采用的复合酶是由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶以质量比1:1:2的比例混合，由对比例3～5与实施例1的对比结果可知，较单独使用一种酶进行酶解，使用复合酶进行酶解的效果最佳，三种酶的作用相辅相成，共同促进红景天粉末中纤维素等杂质的降解。
Claims (10)
1.一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预处理：将红景天粉末与磷酸溶液混合，热处理后，调节pH至4.5～5.8，加入复合酶，所述复合酶由葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶组成；30～60℃酶解9～12h，制得红景天粗提液；
(2)酵母菌种子液制备：将酵母菌活化后接种于种子培养基中，培养得酵母菌种子液；
(3)发酵：将步骤(2)的酵母菌种子液接种至步骤(1)的红景天粗提液中，28～40℃静置发酵24～72h，得红景天发酵液；
(4)分离纯化：将步骤(3)的红景天发酵液离心取上清液，纯化后得红景天苷提纯液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述红景天粉末为红景天干根茎直接粉碎后的红景天粉末或经有机溶剂提取后的红景天提取物粉末。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述磷酸溶液的浓度为0.01～0.1wt％；
优选的，步骤(1)中所述红景天粉末与磷酸溶液的质量体积之比为1～3:1，单位g/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述热处理的方法为：121～160℃热处理14～45分钟，后冷却至50～60℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述复合酶中葡聚糖酶、阿魏酸酯酶和纤维素酶的质量比1:1:2；
优选的，步骤(1)中所述复合酶与红景天粉末的投料质量比为(0.05-0.1)：(10-50)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述复合酶为固体粉末状。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述酵母菌为酿酒酵母、***克鲁维酵母或乳酸克鲁维酵母；
优选的，步骤(2)中所述活化是将酵母菌接种于YPD固体培养基中，20～37℃静置培养。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子培养基为YPD液体培养基；
优选的，步骤(2)中所述培养的条件为20～37℃、100～200rpm，培养至酵母菌种子液OD600为0.6～0.8。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中酵母菌种子液的接种量为5～10％，为质量百分比；
优选的，步骤(4)中所述离心的条件为8000～12000rpm离心10～20min。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述纯化为将上清液抽滤后经过400kDa纳膜脱色除杂，再通过HP20大孔吸附树脂层析纯化，用2％的乙醇洗脱旋蒸，得红景天苷提纯液；
优选的，步骤(4)中的红景天苷提纯液经干燥后得到红景天苷提纯粉末。
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