CN113855782B

CN113855782B - 天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途

Info

Publication number: CN113855782B
Application number: CN202111307848.5A
Authority: CN
Inventors: 邵建秋; 梁伟英; 邓迪; 吴琼
Original assignee: Tonghua Shengyuan Biological Polytron Technologies Inc
Current assignee: Tonghua Shengyuan Biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2041-11-05
Also published as: CN113855782A

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途。实验结果显示，所述天麻多肽具有很强的抗新冠病毒活性，可以广泛用于抗新冠病毒的皮肤外用药剂、防护剂、清洗剂、洗涤剂、护肤品、个人护理用品、喷雾、体外纳米给药、衣物洗涤、医疗用品洗涤、防止家具或固体表面新冠病毒吸附及工业洗涤等抑制或杀灭病毒的应用。因此，本发明首次发现天麻多肽具有高效抑制和杀灭新冠病毒的活性，具有良好的应用价值、社会意义和市场前景。

Description

天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途。

背景技术

针对新冠病毒，现在广泛使用的是75％酒精和84消毒液，高锰酸钾，漂白粉等。但是75％酒精是挥发性极强的物质，不仅作用时间短，而且典型的如75％酒精是及其易燃易爆物质，大面积、高浓度频繁的喷洒极易造成火灾隐患；而含氯离子的消毒液气味难以接受，长期接触还有致病风险；高猛酸钾溶于水后与空气接触十几分后就基本失效。可见，目前市场上常见的针对新冠病毒的消毒剂普遍存在毒性大、安全性较低、杀毒效果较差、刺激性强、用户依从性差等缺陷，并不适于长期用于皮肤表面、医疗领域、食品领域和环境的精细消毒。

天麻是兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块根，其性辛、温，具有息风定惊、镇静催眠、镇痛、抗血小板聚集、抗氧化、延缓衰老、降压、抗惊厥、抗癫痫、改善学习记忆，增强非特异性免疫及细胞免疫等功效。近年来天麻在抗肿瘤、调节免疫等方面的作用倍受关注。天麻的化学成分主要有天麻素、天麻醚苷以及天麻多糖等，但是对天麻多肽的研究和报道较少。本发明人长期致力于相关领域的研究，并首次发现了天麻多肽具有良好的抗菌和抗病毒能力，对常见致病菌和病毒具有很强的杀伤力(参见CN105087732A)。此外，本发明人还发现天麻多肽安全性高、毒性低，天麻多肽的稳定性好，既耐酸碱又耐高温，高温处理及真空干燥后仍保留完整的药理活性，使用简单方便，皮肤渗透性好，无刺激性，不易残留，因此很适合将其作为抗菌和抗病毒防护产品对其进行商业开发。本发明是发明人此前研究工作的延续，在全球面临新冠病毒严峻的威胁下，本发明首次提出了天麻多肽可以作为高效抗2019新冠病毒的抑制剂或杀毒剂，具有良好的应用价值、社会意义和市场前景。

发明内容

为了解决目前高效、低毒的抗新冠病毒外用产品严重短缺的问题，本发明提供了一种天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途。本发明填补了此类物质在新冠防控领域的国际空白，有效减少和阻断新冠病毒传染的危害，有效助力国家攻坚克难，保护人民生命安全。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

本发明提供了天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途，所述天麻多肽具有抑制和杀灭新冠病毒的活性。

作为可选的方式，在所述用途中，所述新冠病毒是2019-nCov或 SARS-Cov-2。

作为可选的方式，在所述用途中，所述天麻多肽的制备方法包括以下步骤：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，过筛粉碎40-100目，按1g：6mL-12mL 的料液比，置于浓度为0.4％-1％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2-8h；

2)减压过滤后，将得到的天麻蛋白滤液浓缩为0.5-1.2g/mL的原药浓度；

3)向天麻蛋白浓缩液中按体积比加入0.2-0.8％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1-3％，胰蛋白酶0.6-1.5％，风味蛋白酶0.5-1％，酶解温度为50-60℃，酶解时间为30min-1.5h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤， 8000rpm离心20min，即得天麻多肽，为酸性多肽，分子量范围在5.8-7.8KD，等电点为7.83-8.15。

作为可选的方式，在所述用途中，所述外用防护产品选自皮肤外用药剂、消毒剂、防护剂、清洗剂、洗涤剂、护肤品、个人护理用品、洗衣液、口罩、防护服或医用面罩。

优选地，所述消毒剂选自医用消毒剂、环境消毒剂、食品消毒剂、消毒湿巾、消毒棉棒或消毒纱布。

另外优选地，所述洗涤剂选自医疗洗涤剂、防止家具或其他固体表面新冠病毒吸附的洗涤剂或工业洗涤剂。

作为可选的方式，在所述用途中，所述外用防护产品的剂型为溶液剂、乳剂、霜剂、膏剂、凝胶剂或喷雾剂。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)在全球面临新冠病毒严峻的威胁下，本发明首次提出了天麻多肽可以作为高效抗2019新冠病毒的抑制剂或杀毒剂。本发明填补了此类物质在新冠防控领域的国际空白，有效减少和阻断新冠病毒传染的危害，有效助力国家攻坚克难，保护人民生命安全。

(2)天麻多肽安全性高、毒性低，天麻多肽的稳定性好，既耐酸碱又耐高温，高温处理及真空干燥后仍保留完整的药理活性，使用简单方便，皮肤渗透性好，无刺激性，不易残留，是非常好的绿色环保抗病毒防护产品，具有较高的商业开发价值。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面对本发明中涉及的各种主要术语进行描述。

人的冠状病毒在1965年已被分离出来，但人们目前对它们的认识相当有限。5-9岁儿童有50％可检出中和抗体，成人中70％中和抗体阳性。1967年， Mclntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其代表株是OC43 株。1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。 1965年，Tyrrell与Bynoe利用胚胎的带有纤毛的气管组织首次培养出冠状病毒，此病毒在电子显微镜下可见如日冕般***的冠状，因此被称为冠状病毒(Coronaviridae)。1975年，病毒命名委员会正式命名冠状病毒科。这类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经***的嗜性。

冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。根据***发育树，冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立的亚群A、B、C和D群。人冠状病毒可对人造成普通感冒，严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS), 在流行病学特征上存在一定差异。

“新冠病毒”即2019新型冠状病毒，是2019年发现的一种病毒，属于灌装病毒科中的一种新病毒，2020年2月世界卫生组织将该病毒命名为COVID-19。本发明中的“新冠病毒”指2019-nCov或SARS-Cov-2。

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

制备实施例

天麻多肽的制备方法本发明人此前的申请CN105087732A，具体制备实施例如下所示：

实施例1：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至80目，按料液比1:6(g/mL)，置于浓度为0.6％的氯化钠溶液中,80℃水浴提取4h；

2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为1(g/mL)的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.4％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1.5％,胰蛋白酶0.8％，风味蛋白酶0.6％，酶解温度为55℃，酶解时间为40min，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得膜下滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用。

4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KD，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KD。

实施例2：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至100目，按料液比1:8(g/mL)，置于浓度为0.4％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2h；

2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为0.8g/mL的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.2％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶2％，胰蛋白酶0.6％，风味蛋白酶0.5％，酶解温度为50℃，酶解时间为30min，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用；

实施例3：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至40目，按料液比1:12(g/mL)，置于浓度为1％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取6h；

2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为0.5g/mL的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.8％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶3％，胰蛋白酶1.5％，风味蛋白酶1％，酶解温度为60℃，酶解时间为 1.5h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用；

实施例4：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至60目，按料液比1:10(g/mL)，置于浓度为0.8％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取8h；

2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为1.2g/mL的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.5％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1％，胰蛋白酶1.2％，风味蛋白酶0.8％，酶解温度为55℃,酶解时间为1h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用；

4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量,以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KD，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KD。

实施例5：

1号天麻抗菌肽原液的配方如下所示：

实施例1至实施例4制备的天麻多肽提取物(w/v，g/mL) 50％

丙三醇(w/v，g/mL) 0.10％

纯化水(v) 100％

效果实施例

实施例6：天麻多肽提取物的皮肤刺激性(参见CN105087732A)

1.实验方法：

采用多次完整皮肤刺激试验法，选用4只皮肤完好、重约3kg新西兰白兔, 试验前24h，脱去其背部脊柱两侧各约3cm×3cm的毛，次日分别将本发明制备的实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的天麻多肽提取物0.5mL擦于一侧去毛皮肤表面，敷贴2.0cm×2.0cm的2层无菌纱布并用无刺激胶布固定,另一侧以0.5mL提取溶剂作为空白对照。4h后去除敷贴物,用水清洗除去残留物。每天涂抹一次,连续涂抹14d。分别于去除受试物后24h观察皮肤局部反应,进行刺激反应评分。

2.皮肤刺激试验结果：

采用多次完整皮肤刺激试验法对4只新西兰种白兔进行试验,以检测不同原药浓度天麻多肽提取物对实验动物皮肤的刺激作用和强度。分别于24h后观察受试兔子脊柱两侧皮肤局部反应,观察结果为试验兔两侧皮肤均无红肿和红斑,评分均为0,皮肤刺激强度分级为无刺激性级别。

实施例7：1号天麻抗菌肽原液抗新冠病毒的活性

本实验委托权威检测机构中国科学院武汉病毒研究所完成，如有需要，可以提供原始检测报告，在本实施例中仅节选了部分检测结果。

1.受试样品：

受试样品为1号天麻抗菌肽原液，规格50mL/瓶，生产日期：2020年8 月5日，生产批号：20200805，由通化仁生源生物科技股份有限公司提供。

2.细胞与病毒：

实验所用新型冠状病毒株(SARS-CoV-2)由中国科学院武汉病毒研究所分离、保藏。病毒感染实验均在BSL-3实验室中进行。

实验所用细胞系为猴肾细胞系Vero E6，由本实验室保存。

3.试验方法

采用中国科学院武汉病毒研究所委托检测抗新冠病毒活性的标准实验方法和统计分析方法。

4.试验结果

4.1样品细胞毒性分析

不同含量的1号天麻抗菌肽样品与Vero E6细胞培养3天的毒性如表1所示。

表1：样品对细胞的毒性作用分析

注：+表示对细胞有明显毒性，细胞死亡；-表示对细胞无明显毒性，细胞存活。

1号天麻抗菌肽样品对Vero E6细胞有一定的毒性作用，当样品稀释48 倍后则没有细胞毒性。

4.2残留样品去除鉴定

根据1号天麻抗菌肽样品对细胞的毒性作用，选取稀释法作为去除残留样品的方法。测定的病毒滴度结果如表2所示。

表2：样品稀释后的抗病毒作用

注：+表示有病毒引起的CPE；-表示无病毒引起的CPE。

1号天麻抗菌肽原液稀释22倍(样品36μL，加到760μL培养基中) 后再加病毒液，测定的病毒滴度均为10^7.80TCID₅₀/mL，与病毒对照组(10^7.97 TCID₅₀/mL)相比，病毒滴度没有明显差异。说明样品经过22倍稀释科有效去除残留样品成分对病毒的灭活作用，对后续病毒滴度测定没有干扰。

4.3样品灭活新型灌装病毒

将1号天麻抗菌肽原液与SARA-CoB-2病毒(体积比9：1)混合，室温作用2min和10min后立即取40μL混合液加到760μL维持培养基中混匀稀释，测定残余病毒滴度。

表3：样品处理后的病毒滴度测定

注：+表示有病毒引起的CPE；-表示无病毒引起的CPE。

结果表明，在本次试验条件下，1号天麻抗菌肽在室温作用2min和10min 都可将SARA-CoV-2病毒灭活至检测限以下，即处理后病毒滴度≤10^2.80 TCID₅₀/mL；与病毒对照组(10^7.30TCID₅₀/mL)相比，杀灭对数值为≥4.50，病毒灭活率≥99.997％。

由此可见，在本试验条件下，1号天麻抗菌肽样品在室温作用2min和10 min对SARS-CoV-2病毒的杀灭对数值>4.00，即杀灭效率>99.99％，符合《消毒技术规范(2002年版)》相关规定。

实施例8：1号天麻抗菌肽原液对其他种类新冠病毒的抗新冠病毒的活性

SARS-CoV-2与HCoV-OC43 RNA聚合酶催化核心区域的序列相似性高达85％，但是HCoV-OC43的毒性却比SARS-CoV-2低得多，因此可以在普通BSL-2级实验室中即可开展相关实验。本发明人随后采用与实施例7完全相同的实验条件，在BSL-2级实验室中考察了1号天麻抗菌肽原液对HCoV-OC43冠状病毒的抗病毒活性。

结果表明，1号天麻抗菌肽在室温作用2min和10min，处理后HCoV-OC43 病毒滴度分别为10^6.70TCID₅₀/mL和10^5.95TCID₅₀/mL；与病毒对照组(10^7.35 TCID₅₀/mL)相比，杀灭对数值分别为0.65和1.35，即杀灭效率分别为77.61％和95.53％。

由此可见，尽管同属于冠状病毒且RNA聚合酶催化核心区域的序列相似性高达85％，但是1号天麻抗菌肽对HCoV-OC43冠状病毒的活性明显不及其对于 SARA-CoV-2的活性，可见本发明的天麻多肽提取物对于新冠病毒SARA-CoV-2 具有选择性的抑制或杀灭活性，取得了预料不到的技术效果。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.天麻多肽在制备抗新冠病毒的外用防护产品中的用途，其特征在于：所述天麻多肽具有抑制和杀灭新冠病毒的活性，所述新冠病毒是SARS-Cov-2，所述天麻多肽的制备方法包括以下步骤：

1）天麻经洗涤、剔出杂质后，过筛粉碎40-100目，按1 g：6 mL-12 mL的料液比，置于浓度为0.4%-1%的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2-8h；

2)减压过滤后，将得到的天麻蛋白滤液浓缩为0.5-1.2 g/mL的原药浓度；

3）向天麻蛋白浓缩液中按体积比加入0.2-0.8%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1-3%，胰蛋白酶0.6-1.5%，风味蛋白酶0.5-1%，酶解温度为50-60℃，酶解时间为30min-1.5h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000 rpm离心20min，即得天麻多肽，为酸性多肽，分子量范围在5.8-7.8KD，等电点为7.83-8.15。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述外用防护产品选自皮肤外用药剂、消毒剂、防护剂、清洗剂、洗涤剂、护肤品、个人护理用品、洗衣液、口罩、防护服或医用面罩。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述消毒剂选自医用消毒剂、环境消毒剂、食品消毒剂、消毒湿巾、消毒棉棒或消毒纱布。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述洗涤剂选自医疗洗涤剂、防止家具或其他固体表面新冠病毒吸附的洗涤剂或工业洗涤剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述外用防护产品的剂型为溶液剂、乳剂、霜剂、膏剂、凝胶剂或喷雾剂。