CN113855711A - 皮肤外用组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种皮肤外用组合物,其是以乳酸菌共生质发酵物作为有效成分,其中乳酸菌共生质发酵物是利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。乳酸菌是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP‑32、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP‑9及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06所组成,发酵底物包含动物性蛋白、植物性蛋白和/或植物萃取物。所述乳酸菌共生质发酵物可有效抑制金黄色葡萄球菌和/或痤疮丙酸杆菌的生长,且可应用于皮肤外用组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种外用组合物,特别是一种皮肤外用组合物及其用于制备改善异位性皮肤炎及痤疮等皮肤疾病的组合物或药物的用途。
背景技术
皮肤是人体体积最大的器官,皮肤的功能不仅包含防止水分散失、调节体温及产生皮肤感觉,还包含作为阻隔屏障。影响皮肤健康的因素,除了生理因素(如激素、营养素及油脂分泌等)及环境条件(如湿度、阳光及天气)外,皮肤上的微生物也扮演着重要的角色。如果皮肤上的微生物可达到生态平衡,则皮肤可维持健康,但如果皮肤致病菌取得生长优势,则容易引起皮肤疾病。举例而言,金黄色葡萄球菌与异位性皮肤炎及湿疹的产生有关,而痤疮丙酸杆菌与寻常性痤疮的发生有关。常见的皮肤疾病的症状包含搔痒、发炎及干燥等症状,且患部皮肤容易因为抓挠或是碰触而产生伤口,甚至导致更严重的发炎反应。
目前常见治疗皮肤疾病的策略可归为:一、施用不同强度的类固醇,以抑制发炎反应;二、施用抗生素,以抑制皮肤致病菌的生长;三、施用含抗组织胺的药物来止痒。然而,长期使用类固醇、抗生素和/或抗组织胺等药品,可能导致如皮肤萎缩、皮肤变薄、微血管扩张、皮囊炎和/或色素沉积等副作用的产生。
因此,须找出一种取代药物治疗的方法。益生菌是治疗皮肤疾病的研究目标之一,其中乳酸菌具有相当大的潜力。乳酸菌可藉由将糖类代谢为乳酸和/或乙酸等有机酸来改变微环境的氢离子浓度,从而抑制其他细菌的生长。然而,利用上述乳酸菌的抑菌作用来达到改善皮肤疾病的功效,往往需要保留乳酸菌的活性,因为在产品制程或剂型上产生诸多限制。此外,产品中的乳酸菌的活性不容易评估也不易保存,所以产品容易在质量管理控制和/或长期保存上产生问题。
鉴于此,亟须提供一种可以有效改善上述缺点的皮肤外用组合物。
发明内容
因此,本发明的一个目的是提供一种皮肤外用组合物,其包含乳酸菌共生质发酵物作为有效成分,其中乳酸菌共生质发酵物是利用乳酸菌菌株进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌共生质发酵物中的乳酸菌为去活化态,但仍可有效抑制金黄色葡萄球菌和/ 或痤疮丙酸杆菌的生长。
本发明的另一目的是提供乳酸菌共生质发酵物用于制备改善皮肤疾病的组合物或药物、尤其是皮肤外用组合物或药物的用途,其中乳酸菌共生质发酵物是利用特定乳酸菌菌株进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌共生质发酵物可有效抑制金黄色葡萄球菌和/或痤疮丙酸杆菌的生长。
本发明的又一目的是提供乳酸菌共生质发酵物在制备用于改善皮肤发炎的组合物或药物、尤其是皮肤外用组合物或药物中的用途,其中乳酸菌共生质发酵物是利用乳酸菌菌株进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌共生质发酵物提高TGF-β及IL-10的分泌量。
在一个实施方案中,提供一种皮肤外用组合物,其包含乳酸菌共生质发酵物作为有效成分。所述乳酸菌共生质发酵物是通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarius subsp.salicinius)AP-32(于 2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC),保藏编号为CCTCC M2011127)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9(于2014年11月24 日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2014588)及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(于2018年1 月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC),保藏编号为CGMCC 15210)所组成。所述发酵底物可包含蛋白质和/或植物萃取物。
在另一个实施方案中,提供乳酸菌共生质发酵物用于制备改善皮肤疾病的组合物或药物、尤其是皮肤外用组合物或药物的用途,其中乳酸菌共生质发酵物是通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2011127)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9(于2014年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2014588)及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(于2018年1月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC 15210) 所组成。所述发酵底物可包含蛋白质和/或植物萃取物。
在又一个实施方案中,提供乳酸菌共生质发酵物用于制备改善皮肤发炎的组合物或药物、尤其是皮肤外用组合物或药物的用途,其中乳酸菌共生质发酵物是通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2011127)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9(于2014年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2014588)及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(于2018年1月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC 15210) 所组成。所述发酵底物可包含蛋白质和/或植物萃取物。所述乳酸菌共生质发酵物提高IL-10及TGF-β的分泌量。
依据本发明上述实施方案,所述蛋白质包含动物性蛋白和/或植物性蛋白,其中动物性蛋白包含牛奶、奶粉及酪蛋白,植物性蛋白包含大豆及豆类制品。
依据本发明上述实施方案,所述植物萃取物是选自于由洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花、积雪草及其任意组合所组成的组的植物的萃取物。依据本发明上述实施方案,所述乳酸菌共生质发酵物可包含发酵液,并且发酵液的有效剂量可以是例如2重量百分比(wt%)至30wt%。
依据本发明上述实施方案,所述乳酸菌共生质发酵物可包含发酵干燥物,并且发酵干燥物的有效剂量可以是例如0.4wt%至6wt%。
依据本发明上述实施方案,所述皮肤外用组合物可以是例如医药组合物或化妆品组合物。
依据本发明上述实施方案,所述皮肤外用组合物的剂型可以是例如乳液、锭剂、胶囊、粉剂、乳膏、喷雾剂、凝胶、溶液剂、散剂、霜剂或洗剂。
依据本发明上述实施方案,蛋白质包含动物性蛋白和/或植物性蛋白,其中动物性蛋白包含牛奶、奶粉及酪蛋白,植物性蛋白包含大豆及豆类制品。
依据本发明上述实施方案,植物萃取物是选自于由洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花、积雪草及其任意组合所组成的组的植物的萃取物。
依据本发明上述实施方案,所述乳酸菌共生质发酵物抑制金黄色葡萄球菌和/或痤疮丙酸杆菌的生长。
应用本发明的皮肤外用组合物,不仅解决质量管控困难的问题,还可以有效抑制金黄色葡萄球菌和/或痤疮丙酸杆菌,以及提高抗炎因子的分泌量,从而具有改善异位性皮肤炎及痤疮等皮肤疾病的潜力。
生物材料保藏
唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32于2011 年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)(地址:中国武汉武汉大学保藏中心,邮编:430072),保藏编号为CCTCC NO: M2011127;动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9于2014年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址:中国武汉武汉大学保藏中心,邮编:430072),保藏编号为CCTCC NO: M 2014588;嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusacidophilus) TYCA06于2018年1月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址:中国北京中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No. 15210。此外,唾液乳酸杆菌AP-32、动物双歧杆菌乳酸亚种CP-9及嗜酸乳酸杆菌TYCA06还分别于2009年7月30日、2014年8月21日及2018 年1月18日保藏于中国台湾新竹食品路331号财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(BCRC),保藏编号分别为BCRC910437、 BCRC910645及BCRC910813。
附图简要说明
为了让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施方案能更明显易懂,随附的附图的详细说明如下:
图1A至图1C是绘示根据本发明实施例3的对金黄色葡萄球菌(图1A)、痤疮丙酸杆菌(图1B)及白色念珠菌(图1C)的抑菌率的直方图。
图2A及图2B是绘示根据本发明实施例4的TGF-β含量(图2A)及IL-10 含量(图2B)的直方图。
图3是绘示根据本发明实施例5的对金黄色葡萄球菌的抑菌率的直方图。
图4是绘示根据本发明实施例6的皮肤保水分数的散布图。
图5A至图5D是绘示根据本发明实施例7的患有异位性皮肤炎的受试者的手部皮肤在施用乳液前(图5A及图5B)后(图5C及图5D)的局部外观照片。
图6是绘示根据本发明实施例8的对痤疮丙酸杆菌的抑菌率的直方图。
图7是绘示根据本发明实施例9的施用凝胶后寻常性痤疮患部皮肤的发炎指数的柱形图。
图8是绘示根据本发明实施例9的将凝胶施用于寻常性痤疮患部皮肤不同天数的局部外观照片。
具体实施方式
承上所述,本发明提供一种皮肤外用组合物,其中所述皮肤外用组合物可包含乳酸菌共生质发酵物作为有效成分。乳酸菌共生质发酵物是通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得。所述乳酸菌共生质发酵物具有抑制皮肤致病菌生长以及提高抗炎因子分泌量的功效。此外,由于乳酸菌共生质发酵物的乳酸菌去活化,因此本发明的皮肤外用组合物具有生物安全性,也较容易控制剂量及保存。
所述“共生质(synbiotics)”是指益生菌(probiotics)及益生元(prebiotics) 的混合物,其中益生元可提供益生菌生长及活化,从而代谢益生元。在本发明中,益生菌可以是例如乳酸菌,益生元可以是例如发酵底物。在体外模拟肠道中的环境,并将乳酸菌培养在发酵底物中,可使乳酸菌代谢发酵底物,从而获得乳酸菌共生质发酵物。
所述“乳酸菌”指的是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis) 及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)所组成的混合菌株。在一个实施方案中,所述乳酸菌是由唾液乳酸杆菌AP-32(于2011年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2011127)、动物双歧杆菌乳酸亚种CP-9(于2014年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC M 2014588)及嗜酸乳酸杆菌TYCA06(于2018年1月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC15210)(下文分别简称为:AP-32菌株、CP-9菌株及 TYCA06菌株)组成的。
所述“发酵底物”可以是例如液态发酵底物、固态发酵底物、半固态发酵底物,并且发酵底物包含蛋白质和/或植物萃取物。在一个实施方案中,蛋白质是动物性蛋白,可以是或来源于例如牛奶、奶粉及酪蛋白。在一个实施方案中,蛋白质是植物性蛋白,可以是或来源于例如大豆及豆类制品 (例如,豆浆或豆浆粉)。在一个实施方案中,植物萃取物是选自于由洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花、积雪草及其任意组合所组成的组的植物的萃取物。植物萃取物可以通过本领域已知的常规萃取方法获得。所述萃取方法可例如藉由任何药学或化妆品上可接受的萃取溶剂(如水或酒精等)进行。所述蛋白质和/或植物萃取物的含量不受限制,可视实际需求任意调整。例如,基于发酵底物为100wt%,发酵底物中蛋白质的含量可以为2wt%至30wt%。发酵底物中植物萃取物的量可以为1wt%至12wt%。
在一个具体实施方案中,发酵底物是由2wt%的酪蛋白、12wt%的绿茶的水萃取物及86wt%的Man Rogosa and Sharp(MRS)培养液所组成。在一个具体实施方案中,发酵底物是由30wt%的豆浆、1wt%的洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花及积雪草的水萃取物的等重混合物及69wt%的MRS培养液所组成。在一个具体实施方案中,发酵底物是由20wt%的牛奶、12wt%的绿茶及洋甘菊的水萃取物的等重混合物及68wt%的MRS培养液所组成。
所述“发酵步骤”可例如在已知的发酵条件下进行,以获得乳酸菌共生质发酵菌液。由于CP-9菌株是厌氧菌,而AP-32菌株及TYCA06菌株是兼性厌氧菌,并且AP-32菌株、CP-9菌株及TYCA06菌株偏好生长于约 37℃的温度,因此发酵步骤在37℃的厌氧环境中进行。
接着,对乳酸菌共生质发酵菌液进行去活化步骤,以获得乳酸菌共生质发酵物。所述去活化步骤可包含灭菌处理和/或分离处理,其中灭菌处理可利用已知的灭菌方法进行,例如热灭菌;分离处理可利用已知的分离方法进行,例如离心。在一个实施方案中,以100℃的温度进行灭菌处理。上述所称的乳酸菌共生质发酵物包含发酵液和发酵干燥物,其中发酵液包含但不限于乳酸菌共生质发酵菌液经灭菌处理后的去活性发酵液,或乳酸菌共生质发酵菌液经分离处理及灭菌处理后的去除菌体的发酵液,发酵干燥物是发酵液进一步经已知的方法进行干燥步骤及/或磨碎步骤后获得。所述干燥步骤可使用已知的干燥方法,例如冷冻干燥法、真空干燥法或喷雾干燥法等。所述研磨步骤可使用已知的研磨方法,例如机械力研磨、滚筒式研磨和/或流动气体研磨等。
当乳酸菌共生质发酵物以发酵液形式应用于皮肤外用组合物时,有效剂量可以例如为2重量百分比(wt%)至30wt%。如果皮肤外用组合物中的发酵液含量过低(例如小于2wt%),则皮肤外用组合物无法有效抑制皮肤致病菌和/或提升皮肤的含水量。如果皮肤外用组合物中的发酵液含量过高(例如大于30wt%),则皮肤外用组合物将引起皮肤过敏反应。
当乳酸菌共生质发酵物以发酵干燥物形式应用于皮肤外用组合物时,发酵干燥物的有效剂量可以例如为大于0.4wt%。在一些具体实施方案中,发酵干燥物的有效剂量可以例如为0.4wt%至6wt%。如果皮肤外用组合物中的发酵干燥物含量过低(例如小于0.4wt%),则皮肤外用组合物无法有效抑制皮肤致病菌的功效和/或提升皮肤的含水量。如果皮肤外用组合物中的发酵干燥物的含量过高(例如大于6wt%),则皮肤外用组合物将引起皮肤过敏反应。
值得注意的是,可将AP-32菌株、CP-9菌株及TYCA06菌株共培养,以获得混合乳酸菌共生质发酵物。另外,也可先分别获得AP-32菌株、CP-9 菌株及TYCA06菌株的发酵液或其发酵干燥物,再进行混合。
所述“皮肤致病菌”是指可在皮肤上引起疾病的微生物,例如:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes) 及白色念珠菌(Candida albicans)。
所述“抗炎因子”是指免疫抑制型细胞激素,可以是例如:IL-10及 TGF-β。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物为医药组合物或化妆品组合物。在一个实施方案中,皮肤外用组合物可选择性包含但不限于药学或化妆品上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅助剂和/或添加剂。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物可选择性包含凝胶剂,例如:天然聚葡糖胶、三仙胶、卡波姆和/或丙烯酰二甲基牛磺酸铵。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物可选择性包含植物萃取物,例如:芦荟、西葫芦籽、大豆、鱼腥草、黄芩根、印度楝叶、中国地黄根、白柳树皮、黄蘗树皮、须松萝、百里香、甘草、南瓜籽、薄荷、左手香、柠檬萃取物和/或梨汁发酵液。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物可选择性包含防腐剂,例如:二丙二醇、羟基苯乙酮、辛基乙二醇、甘草酸二钾、辛酸甘油酯、乙基己基甘油、氢化蓖麻油、丁二醇、丙二醇、乙醇酸、辛甘醇、对羟基苯乙酮、 PEG-40和/或PEG-60。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物可选择性包含植物油,例如:棕梠油、蚕丝油、乳木果油、杏仁油、薄荷醇油和/或茶树精油。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物可选择性包含保湿剂,例如:透明质酸钠和/或尿囊素(allantoin)。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物可选择性包含稀释剂,例如:氢氧化钠、海泉水和/或甘油。
在一个实施方案中,所述皮肤外用组合物的剂型不受限制,可以例如为乳液、锭剂、胶囊、粉剂、乳膏、喷雾剂、凝胶、溶液剂、散剂、霜剂或洗剂。
在一个实施方案中,可以采用本领域常规方法将所述皮肤外用组合物配制成乳液。乳液可以包含0.4wt%至6wt%的本发明所述的乳酸菌共生质发酵物、2wt%至10wt%的植物油(包含棕梠油、蚕丝油、乳木果油及杏仁油)0.5wt%至1.5wt%的天然植物萃取物(芦荟萃取液及西葫芦籽萃取物)、2 wt%至10wt%的保湿剂(包含透明质酸钠及尿囊素)、0.5wt%至1.5wt%的多元醇防腐剂(包含二丙二醇、羟基苯乙酮、辛基乙二醇以及甘草酸二钾)、 0.5wt%至1.5wt%的凝胶剂(包含天然聚葡糖胶、三仙胶及卡波姆)、0.05 wt%至10wt%的稀释剂(包含氢氧化钠、海泉水及甘油),其余为无菌水。除本发明所述的乳酸菌共生质发酵物之外,乳液中的其他成分皆属已知成分,可视实际需求任意调整,且此调整并不影响抑菌功效评估,在此不另行赘述。
在一个具体实施方案中,可以采用本领域常规方法将所述皮肤外用组合物配制成凝胶。凝胶可以包含2wt%至30wt%的本发明所述的乳酸菌共生质发酵物、1wt%至6wt%的天然植物萃取物(包含大豆、鱼腥草、黄芩根、印度楝叶、中国地黄根、白柳树皮、黄蘗树皮、梨汁发酵液、须松萝、百里香、甘草、南瓜籽、芦荟、薄荷、柠檬等萃取物)、0.1wt%至0.5wt%的保湿剂(包含透明质酸钠、尿囊素)、0.1wt%至1.5wt%的多元醇防腐剂(包含辛酸甘油酯、乙基己基甘油、PEG-40、氢化蓖麻油、乙醇酸、丁二醇、丙二醇、辛甘醇及对羟基苯乙酮)、0.3wt%至1wt%的凝胶剂(包含丙烯酰二甲基牛磺酸铵及卡波姆)和0.05wt%至1wt%的稀释剂(包含氢氧化钠及海泉水),其余为水。除本发明所述的乳酸菌共生质发酵物之外,凝胶中的其他成分皆属已知成分,可视实际需求任意调整,且此调整并不影响抑菌功效评估,在此不另行赘述。
经实验证实,混合使用AP-32菌株、CP-9菌株及TYCA06菌株的乳酸菌共生质发酵物抑制金黄色葡萄球菌及痤疮丙酸杆菌等皮肤致病菌的生长的效果,超过各个菌株的加合效果。其次,经细胞实验证实,所述乳酸菌共生质发酵物可有效提升IL-10及TGF-β等抗炎因子的分泌量。另外,将含有所述乳酸菌共生质发酵物的皮肤外用组合物涂抹于患部皮肤后,可显著降低异位性皮肤炎及痤疮的发炎及发痒程度,并有效提升伤口愈合的速率。因此,本发明的乳酸菌共生质发酵物可应用于皮肤外用组合物,以改善异位性皮肤炎及寻常性痤疮的不适症状。
以下利用数个实施例以说明本发明的应用,然其并非用以限定本发明,本领域普通技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下应当可作出各种变动与修饰。
实施例1:乳酸菌的细菌学特征
利用16S rRNA序列分析及微生物鉴定试剂盒API来分析乳酸菌的菌种及细菌学上的特征,并将结果列于表1。
表1
实施例2:制备发酵液及发酵粉
首先,取得乳酸菌的菌株No.1至No.6,其中菌株No.1至No.6分别为:唾液乳酸杆菌AP-32、动物双歧杆菌乳酸亚种CP-9、嗜酸乳酸杆菌TYCA06、唾液乳酸杆菌L-53、动物双歧杆菌乳酸亚种L-28及嗜酸乳酸杆菌L-6,其中菌株L-53、菌株L-28及菌株L-6是由位于台湾台南市的丰华生物科技股份有限公司提供。将上述菌株No.1至No.6涂布于MRS培养基上,以获得菌株No.1至No.6的单一菌落。
分别将菌株No.1至No.6的单一菌落接种于发酵底物中,并于37℃下进行发酵步骤,以获得乳酸菌菌液,此时乳酸菌菌液含有约为109CFU/mL 至1010CFU/mL的细菌。基于发酵底物为100wt%,发酵底物是由2wt%的酪蛋白、12wt%的绿茶的水萃取物及86wt%的MRS培养液所组成。补充说明的是,以基于发酵底物为100wt%,利用30wt%的豆浆、1wt%的洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花及积雪草的水萃取物的等重混合物及69wt%的MRS培养液配制的发酵底物,或利用20wt%的牛奶、12wt%的洋甘菊及绿茶的水萃取物的等重混合物及68wt%的MRS培养液所组成,所获得的乳酸菌菌液具有109CFU/mL至1010CFU/mL的乳酸菌含量。
在本实施例中,以相同发酵底物对菌株No.1至No.6进行发酵步骤。将发酵液以4℃的温度、每分钟3000转(rotation per minute,rpm)的转速离心10分钟,藉以获得去除菌体的发酵液。接着,在90℃以上对去除菌体的发酵液以发酵槽进行直接灭菌法进行灭菌步骤达60分钟,以获得发酵液。接下来,将发酵液进行喷雾干燥,以获得发酵粉,详细而言,喷雾干燥是先将发酵液以高速旋转喷头(喷口直径0.84mm至4.06mm,喷雾角度: 80度)雾化成极小水珠后,再利用热气(利用抽风机及送风机加热并净化空气后形成)蒸发发酵液的极小水珠中的水分,其中未蒸发的固体成分即为发酵粉。上述发酵粉可视为发酵液的五倍浓缩物。
实施例3:单菌株或多菌株发酵粉对于皮肤致病菌的抑菌率
分别以纯水将实施例2中菌株No.1至No.6的发酵粉配置成4wt%的发酵粉溶液,以获得制备例1、制备例2、制备例3、比较例1、比较例2 及比较例3。混合等量的制备例1、制备例2及制备例3,以获得制备例4,其中制备例4所含有的发酵粉含量是4wt%。混合等量的比较例1、比较例 2及比较例3,以获得比较例4,其中比较例4所含有的发酵粉含量是4wt%。以纯水作为对照例。
分别配制金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌及白色念珠菌的致病菌菌液 (浓度:5×105CFU/mL)。将100μl致病菌菌液加入至2.5mL的制备例1、制备例2、制备例3、制备例4、比较例1、比较例2、比较例3、比较例4 或对照例中,并于37℃下进行发酵步骤达20分钟,以获得致病菌培养液。将所述致病菌培养液稀释10、102及103倍后各取1ml,涂布于致病菌相对应的琼脂培养基上[金黄色葡萄球菌:营养琼脂(Nutrient Agar);痤疮丙酸杆菌:含有5wt%羊血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基(tryptic soy agar,TSB);白色念珠菌:酵母麦芽琼脂培养基(Yeast Malt,YM)],并于37℃下培养48 小时,以获得致病菌菌落。
分别计算金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌及白色念珠菌的致病菌菌落数,并计算抑菌率(Z),如式(I)所示。
Z=(1-X/Y)x 100% (I)
其中在本实施例中,X表示制备例或比较例的致病菌菌落的数量,Y表示对照例的致病菌菌落的数量。
图1A至图1C是绘示根据本发明实施例3的对金黄色葡萄球菌(图1A)、痤疮丙酸杆菌(图1B)及白色念珠菌(图1C)的抑菌率的直方图,其中横轴表示组别,纵轴表示相对抑菌率,“*”、“**”及“***”表示经student’s t-test 统计分析后,相较于对照例,制备例或比较例具有统计学上显著差异性(p 值范围分别是p<0.05、p<0.01及p<0.001),“#”、“##”表示经student’s t-test 统计分析后,制备例4相较于比较例4具有统计学上显著差异性(p值范围分别是p<0.05及p<0.01)。如图1A所示,制备例1、制备例2、制备例3、比较例1、比较例2及比较例3的抑菌率分别为30.2%、30.2%、30.4%、 28.6%、23.3%及26.6%,制备例4及比较例4的抑菌率分别为72%及40%。经统计,制备例1至制备例3的抑菌率与对照例的抑菌率之间没有统计学上的显著差异性,但制备例4的抑菌率显著大于对照例的抑菌率,显示混合使用不同菌株的发酵粉抑制金黄色葡萄球菌生长的效果,超过各个菌株的效果。此外,虽然制备例4及比较例4的乳酸菌的菌种相同,但比较例 4及制备例4在抑菌率上具有显著差异,显示需混合本发明的菌株(No.1菌株至No.3菌株)的发酵粉,才能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。
如图1B所示,制备例1、制备例2、制备例3、比较例1、比较例2 及比较例3的抑菌率分别为87.6%、37.7%、12%、80.4%、18.1%及7.0%,制备例4与比较例4的抑菌率分别为95%及80.2%。相较于制备例1、制备例2、制备例3、比较例1、比较例2、比较例3及比较例4,制备例4的抑菌率较高,显示制备例4可有效抑制痤疮丙酸杆菌的生长。
如图1C所示,制备例1、制备例2、制备例3、比较例1、比较例2 及比较例3的抑菌率分别为45.2%、16.1%、16.1%、33.7%、11.3%及15.2%,制备例4与比较例4的抑菌率分别为71.1%及42.2%。相较于其他组别,制备例4的抑菌率较高,显示制备例4可有效抑制白色念珠菌的生长。
由上述实验可知,混合使用菌株No.1至菌株No.3的发酵粉抑制金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和/或白色念珠菌的效果超过菌株No.1至菌株 No.3的发酵粉各自的效果。此外,混合使用与本发明所述的相同菌种但不同菌株的发酵粉,无法达到有效抑制上述皮肤致病菌的生长的效果,显示混合本发明的菌株(菌株No.1至菌株No.3)才能实现有效抑制上述皮肤致病菌的生长的效果。
实施例4:体外细胞实验评估发酵粉的抗炎功效
首先,将上述菌株No.1至菌株No.3的发酵粉溶于水后,再分别用 RPMI-1640培养液配置成浓度为20mg/mL的标准液。接着,分别将菌株 No.1至菌株No.3的标准液20μ1与1x106个外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)及RPMI-1640培养液100μ1混合,以获得制备例5、制备例6及制备例7。比较例5是藉由混合含有1x106个PBMC的RPMI-1640培养液100μ1及20μ1的纯水所获得。将比较例5、制备例 5、制备例6及制备例7于37℃培养48小时后,在4℃下以3000rpm离心 10分钟,以获得上清液。以酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测量上清液中TGF-β含量及IL-10含量,并将结果显示于图2A及图2B。
图2A及图2B是绘示根据本发明实施例4的TGF-β含量(图2A)及IL-10 含量(图2B)的直方图,其中横轴表示组别,纵轴表示浓度(单位:pg/mL),“**”及“***”表示经student’st-test统计分析后,相较于比较例5,制备例具有统计学上显著差异性,p值范围分别是p<0.01及p<0.001。如图2A 所示,制备例5、制备例6及制备例7的TGF-β含量分别为56.5pg/mL、23.2pg/mL及130.9pg/mL,显著大于比较例5的TGF-β含量,显示菌株 No.1、菌株No.2及菌株No.3的发酵粉具有诱导细胞分泌TGF-β的功效。
如图2B所示,制备例5、制备例6及制备例7的IL-10含量分别为147.6 pg/mL、84.2pg/mL及303.2pg/mL,显著大于比较例5的IL-10含量,显示菌株No.1、菌株No.2及菌株No.3的发酵粉具有诱导细胞分泌IL-10的功效。
由上述实验可知,菌株No.1、菌株No.2及菌株No.3的发酵粉可有效提高细胞的免疫抑制型细胞激素的分泌量,意味着菌株No.1、菌株No.2 及菌株No.3的发酵粉具有抗炎的功效。
实施例5:评估含发酵粉的乳液抑制金黄色葡萄球菌生长的效果
将菌株No.1、菌株No.2及菌株No.3的发酵粉以相同的重量混合,从而获得混合发酵粉,并配制乳液,其中乳液包含0.4wt%的混合发酵粉、2 wt%至10wt%的植物油(包含棕梠油、蚕丝油、乳木果油及杏仁油)、0.5wt%至1.5wt%的天然植物萃取物(芦荟萃取液及西葫芦籽萃取物)、2wt%至10 wt%的保湿剂(包含透明质酸钠及尿囊素)、0.5wt%至1.5wt%的多元醇防腐剂(包含二丙二醇、羟基苯乙酮、辛基乙二醇以及甘草酸二钾)、0.5wt%至1.5wt%的凝胶剂(包含天然聚葡糖胶、三仙胶及卡波姆)、0.05wt%至10wt%的稀释剂(包含氢氧化钠、海泉水及甘油),其余为无菌水。除本发明所述的乳酸菌共生质发酵物之外,乳液中的其他成分皆属已知成分,可视实际需求任意调整,且此调整并不影响抑菌功效评估,在此不另行赘述。以上述乳液作为制备例8。采用无菌水作为比较例6。
分别在2.5mL的上述乳液(制备例8)或无菌水(比较例6)中加入100μl 金黄色葡萄球菌菌液(其中金黄色葡萄球菌的浓度为5×105CFU/mL),于 37℃培养20分钟后,分别稀释10、102及103倍,之后各取1ml涂布于营养琼脂上,继续于37℃进行培养达48小时,从而获得金黄色葡萄球菌菌落。分别计算制备例8及比较例6的金黄色葡萄球菌菌落数。以前述式(I)所示的公式计算抑菌率,其中在本实施例中,X表示制备例8的金黄色葡萄球菌菌落数,Y表示比较例6的金黄色葡萄球菌菌落数。将结果显示于图3。
图3是绘示根据本发明实施例5的对金黄色葡萄球菌抑菌率的直方图,其中横轴表示组别,纵轴表示抑菌率,且“***”表示经student’s t-test统计分析后,相较于比较例6,制备例8具有统计学上显著差异性(p<0.001)。如图3所示,制备例8的抑菌率为96%,显著大于比较例6的抑菌率,显示制备例8的乳液可有效抑制金黄色葡萄球菌。已知金黄色葡萄球菌在异位性皮肤炎的发生上扮演重要角色,因此具有抑制金黄色葡萄球菌的功效意味着具有改善异位性皮肤炎的不适症状的能力。需补充说明的是,乳液中的混合发酵粉含量为3wt%或6wt%时,也可有效抑制金黄色葡萄球菌。
实施例6:评估含发酵粉的乳液对异位性皮肤炎的保湿效果
制备例9与制备例10分别为含有0.2wt%及0.4wt%混合发酵粉的实施例5所述的乳液。将比较例6、制备例9与制备例10的乳液分别施用于患有异位性皮肤炎的受试者的脸颊皮肤上,于室温下等待3小时后,利用智能皮肤分析***(伊丽美-型号ES3100)检测受试者的脸颊的皮肤保水程度,并将结果显示于图4。
图4是绘示根据本发明实施例6的皮肤保水分数的散布图,其中横轴表示组别,纵轴表示皮肤保水分数,“*”表示经student’s t-test统计分析后,相较于比较例6,制备例9和10具有统计学上显著差异性(p<0.05)。如图 4所示,相较于比较例6,制备例10的受试者的皮肤保水分数显著上升,显示混合发酵粉的有效剂量是大于等于0.4wt%。
实施例7:评估含发酵粉的乳液抑制皮肤发炎的效果
图5A至图5D是绘示根据本发明实施例7的患有异位性皮肤炎的受试者的手部皮肤在施用乳液前(图5A及图5B)后(图5C及图5D)的局部外观照片,其中图5A及图5C分别显示受试者1施用前及施用后的局部皮肤,图 5B及图5D分别显示受试者2施用前及施用后的局部皮肤,箭头所指处是伤口或是皮肤干燥的位置,本实施例使用的乳液是上述制备例10的乳液。比较图5A及图5C,受试者1在施用制备例10的乳液后,关节处的皮肤干燥脱皮的状况有明显改善,且伤口恢复良好。比较图5B及图5D,受试者 2在施用制备例10的乳液后,箭头所指的伤口复原状况良好,显示制备例 10的乳液可提升异位性皮肤炎的皮肤伤口的修复速率。
由上述实验可知,本发明的皮肤外用组合物除了可抑制金黄色葡萄球菌的生长,亦可提高异位性皮肤炎患者的皮肤保湿度,还可以提升伤口修复速率,显示本发明的皮肤外用组合物可改善异位性皮肤炎的不适症状。
实施例8:评估含发酵液的凝胶抑制痤疮丙酸杆菌生长的效果
将实施例2中菌株No.1至菌株No.3的发酵液等体积混合,以形成混合发酵液,并配制成凝胶,其中凝胶包含5wt%的混合发酵液及含有各种已知的添加物,例如天然植物萃取物(包含大豆、鱼腥草、黄芩根、印度楝叶、中国地黄根、白柳树皮、黄蘗树皮、梨汁发酵液、须松萝、百里香、甘草、南瓜籽、芦荟、薄荷、柠檬等萃取物)、保湿剂(包含透明质酸钠、尿囊素)、多元醇防腐剂(包含辛酸甘油酯、乙基己基甘油、PEG-40、氢化蓖麻油、乙醇酸、丁二醇、丙二醇、辛甘醇及对羟基苯乙酮)、凝胶剂(包含丙烯酰二甲基牛磺酸铵及卡波姆)、稀释剂(包含氢氧化钠及海泉水),以及水,其添加量可分别例如为1wt%至6wt%、0.1wt%至0.5wt%、0.1wt%至1.5 wt%、0.3wt%至1wt%、0.05wt%至1wt%,及平衡量。由于上述添加物皆属已知成分,可视实际需求任意调整,且此调整并不影响抑菌功效评估,在此不另赘述。所得凝胶为制备例11。采用无菌水作为比较例7。
分别在2.5克的上述凝胶(制备例11)或2.5mL的无菌水(比较例7)中加入100μL含有5×105CFU/mL痤疮丙酸杆菌菌液,于37℃的厌氧环境下培养20分钟,再以逆渗透水稀释10、102及103后,各取1ml涂布于含有5wt%羊血的胰蛋白胨大豆琼脂培养基上,并接着于37℃的厌氧环境下培养48 小时,以获得痤疮丙酸杆菌菌落。计算痤疮丙酸杆菌菌落数,并依照式(I) 的公式计算抑菌率,其中在本实施例中,X表示制备例11的痤疮丙酸杆菌菌落数,Y表示比较例7的痤疮丙酸杆菌菌落数。结果显示于图6。
图6是绘示根据本发明实施例8的抑菌率的直方图,其中横轴表示组别,纵轴表示抑菌率,且“***”表示经student’s t-test统计分析后,相较于比较例7,制备例11具有统计上显著差异性(p<0.001)。如图6所示,制备例11的抑菌率达100%,显著大于比较例7的抑菌率,显示制备例11的凝胶具有抑制痤疮丙酸杆菌的效果。需补充说明的是,凝胶中的混合发酵液含量为2wt%或30wt%时,也可有效抑制痤疮丙酸杆菌。
实施例9:评估含发酵液的凝胶抑制皮肤发炎的效果
施用上述凝胶(制备例11)或无菌水(比较例7)在患有寻常性痤疮的受试者的寻常性痤疮上,其中施用频率为每日1次,并于第0天(施用前)、第3 天、第7天及第14天观察并记录寻常性痤疮的状况。此外,在第0天、第 7天及第14天时,以智能皮肤分析***(伊丽美-型号ES3100)检测寻常性痤疮的发炎数值。取施用后的发炎数值相对于施用前的发炎数值的百分比值,以获得发炎指数。上述结果显示于图7及图8。
图7是绘示根据本发明实施例9的施用凝胶后患部皮肤的发炎指数柱形图,其中横轴由左至右分别表示施用前、施用第7天及施用第14天,纵轴表示发炎指数,长条701、长条703及长条705分别表示施用前、施用上述凝胶(制备例11)及施用无菌水(比较例7),且“**”表示经student’s t-test 统计分析后,相较于比较例7,制备例11具有统计学上显著差异性(p<0.01)。如图7所示,施用前(长条701)的发炎指数为100%,在施用第7天,制备例11与比较例7的发炎指数分别为34%及95%,在施用第14天,制备例 11与比较例7的发炎指数分别为21%及86%。不论是在施用第7天或是在施用第14天,相较于比较例7,制备例11的发炎指数均显著下降,显示制备例11的凝胶可有效改善寻常性痤疮的发炎状况。
图8是绘示根据本发明实施例9的将凝胶施用于寻常性痤疮皮肤不同天数的局部外观照片。如图8所示,施用制备例11的凝胶7天后,受试者 B及受试者C的发炎及肿胀状况获得大幅改善,施用制备例11的凝胶14 天后,受试者A的发炎及肿胀状况也获得大幅改善,但施用无菌水(比较例 7)14天后,受试者A、受试者B及受试者C的皮肤的发炎及肿胀症状并无改善,显示制备例11的凝胶可有效使寻常性痤疮患部消肿。
由上述实施例可知,本发明的皮肤外用组合物,其优点在于乳酸菌共生质发酵物不需保留乳酸菌的活性,因此可简化制程、利于质量管理和控制以及保存。此外,本发明的皮肤外用组合物包含乳酸菌菌株的乳酸菌共生质发酵物,相较于使用单一特定菌株的乳酸菌共生质发酵物,混合使用特定菌株的乳酸菌共生质发酵物不仅能更有效抑制皮肤致病菌的生长,还可有效促进细胞分泌抗炎因子,应用于皮肤外用组合物中,有潜力改善皮肤疾病(例如异位性皮肤炎及痤疮)的不适症状。
应理解的是,本发明虽使用特定的剂型、特定的受试者、特定的给药方式或特定的评估方式作为例示,说明本发明的皮肤外用组合物及其用于制备改善皮肤疾病的药物的用途,但本领域普通技术人员可知,本发明并不限于此,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,本发明也可使用其他的剂型、其他的受试者、其他的给药方式或其他的评估方式进行。
虽然本发明已以数个实施例进行说明,然其并非用以限定本发明,本领域普通技术人员在不脱离本发明的精神和范围的情况下应当可作各种更改与修饰,因此本发明的保护范围应当视所附的权利要求所界定的范围为准。
Claims (12)
1.一种皮肤外用组合物,其特征在于包含乳酸菌共生质发酵物作为有效成分,所述乳酸菌共生质发酵物是通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得,所述乳酸菌由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivariussubsp.salicinius)AP-32、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CP-9及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06所组成,所述唾液乳酸杆菌AP-32保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2011127;所述动物双歧杆菌乳酸亚种CP-9保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2014588;所述嗜酸乳酸杆菌TYCA06保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC15210,并且所述发酵底物包含蛋白质和/或植物萃取物。
2.如权利要求1所述的皮肤外用组合物,其特征在于所述蛋白质包含动物性蛋白和/或植物性蛋白,所述动物性蛋白选自于由牛奶、奶粉、酪蛋白及其任意组合所组成的组,所述植物性蛋白包含大豆和/或豆类制品。
3.如权利要求1所述的皮肤外用组合物,其特征在于所述植物萃取物是选自于由洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花、积雪草及其任意组合所组成的组的植物的萃取物。
4.如权利要求1所述的皮肤外用组合物,其特征在于所述乳酸菌共生质发酵物是发酵液,其中基于皮肤外用组合物为100wt%,所述发酵液的有效剂量为2wt%至30wt%。
5.如权利要求1所述的皮肤外用组合物,其特征在于所述乳酸菌共生质发酵物是发酵干燥物,其中基于皮肤外用组合物为100wt%,所述发酵干燥物的有效剂量为0.4wt%至6wt%。
6.如权利要求1所述的皮肤外用组合物,其特征在于所述皮肤外用组合物为医药组合物或化妆品组合物。
7.如权利要求1所述的皮肤外用组合物,其特征在于所述皮肤外用组合物的剂型为乳液、锭剂、胶囊、粉剂、乳膏、喷雾剂、凝胶、溶液剂、散剂、霜剂或洗剂。
8.乳酸菌共生质发酵物用于制备改善皮肤疾病的组合物的用途,其特征在于所述乳酸菌共生质发酵物是通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行灭菌步骤而获得,所述乳酸菌是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivariussubsp.salicinius)AP-32、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CP-9及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06所组成,所述唾液乳酸杆菌AP-32保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2011127;所述动物双歧杆菌乳酸亚种CP-9保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2014588;所述嗜酸乳酸杆菌TYCA06保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC15210,并且所述发酵底物包含蛋白质和/或植物萃取物。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于所述蛋白质包含动物性蛋白和/或植物性蛋白,所述动物性蛋白包含牛奶、奶粉及酪蛋白,所述植物性蛋白包含大豆及豆类制品。
10.如权利要求8所述的用途,其特征在于所述植物萃取物是选自于由洋甘菊、艾草、绿茶、金盏花、积雪草及其任意组合所组成的组的植物的萃取物。
11.如权利要求8所述的用途,其特征在于其中该乳酸菌共生质发酵物抑制金黄色葡萄球菌和/或痤疮丙酸杆菌的生长。
12.乳酸菌共生质发酵物用于制备改善皮肤发炎的组合物的用途,其特征在于所述乳酸菌共生质发酵物通过利用乳酸菌对发酵底物进行发酵步骤以及对发酵步骤的产物进行去活化步骤而获得,所述乳酸菌是由唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivariussubsp.salicinius)AP-32、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CP-9及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06所组成,所述唾液乳酸杆菌AP-32保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2011127;所述动物双歧杆菌乳酸亚种CP-9保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2014588;所述嗜酸乳酸杆菌TYCA06保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC15210,并且所述发酵底物包含蛋白质和/或植物萃取物,藉以提高IL-10及TGF-β的分泌量。
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