CN113854066B - 一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法 - Google Patents

一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法，涉及植物病害防治技术领域。本发明利用适宜浓度的分生孢子悬浮液、适宜的栽培温度和基质pH，提高番茄拮抗枯萎病的能力，达到更优的番茄抗枯萎病效果。经所述拟康宁木霉T‑51分生孢子悬浮液浸蘸的番茄幼苗，发病率、死亡率以及病情指数显著降低，还可以提高番茄单株产量。

Description

一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法。
背景技术
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum.)是引起番茄枯萎病的病原菌，传播范围广泛，难以根除。目前生产中主要使用大量化学药剂杀灭病原菌，但带来了农产品农药残留和危害生态环境的负面影响，同时使病原菌的抗药性提高。因此，寻求快速有效地生物防治番茄枯萎病的方法越来越受到人们的重视。
木霉菌是广泛存在于自然界的一种真菌。木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科。木霉菌广泛存在于土壤、根围、叶围、种子等生态环境中，也是一种优良的生防菌。由于木霉菌的广泛适应性、广谱性和多机制性，因此该菌一直是植物病害生物防治研究的重点对象，但是目前并没有一种可显著抗番茄枯萎病并提高番茄产量的木霉菌应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法，利用拟康宁木霉T-51抑制尖孢镰刀菌，从而提高番茄对枯萎病的抗性，达到生物防治番茄枯萎病的效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抗番茄枯萎病的栽培方法，包括以下步骤：将番茄幼苗的根在拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51的分生孢子悬浮液中浸蘸，在所述浸蘸后移栽并定植；
所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度不低于1×106个/mL；
所述移栽和定植的环境温度为20～25℃，移栽基质的pH为7～9。
优选的，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的制备方法，包括：将拟康宁木霉T-51的菌落边缘菌丝接种到PDA培养基上，利用无菌水刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，得所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液；
所述无菌水中吐温-20的体积百分含量为0.5％。
优选的，当所述番茄幼苗为2周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×108个/mL；
当所述番茄幼苗为3周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×107个/mL；
当所述番茄幼苗为4周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×106个/mL。
优选的，所述浸蘸的时间为15～30min。
优选的，所述枯萎病由尖孢镰刀菌引起。
优选的，所述拟康宁木霉T-51的保藏编号为CCTCC NO:M 2015729。
本发明还提供了一种提高番茄产量的栽培方法，包括以下步骤：将番茄幼苗的根在拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51的分生孢子悬浮液中浸蘸30min，在所述浸蘸后移栽并定植；
所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度不低于1×106个/mL；
所述移栽和定植的环境温度为20～25℃，移栽基质的pH为7～9。
有益效果：本发明提供了一种抗番茄枯萎病的栽培方法，利用适宜浓度的分生孢子悬浮液、适宜的栽培温度和基质pH，提高番茄拮抗枯萎病的能力，达到更优的番茄抗枯萎病效果。在本发明实施例中，所述拟康宁木霉T-51菌株表现出对尖孢镰刀菌的显著抑制效果，并且拟康宁木霉T-51菌株能够寄宿在植株体内，诱导植物产生***性抗性。经所述拟康宁木霉T-51分生孢子悬浮液浸蘸的番茄幼苗，发病率、死亡率以及病情指数显著低于对照组；而且经拟康宁木霉T-51菌株孢子液处理的番茄单株产量比对照组高；经拟康宁木霉T-51菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理的番茄单株产量比单独尖孢镰刀菌孢子液处理组的高。
附图说明
图1为拟康宁木霉T-51菌株与尖孢镰刀菌在PDA培养基上共同培养5天对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用；
图2为拟康宁木霉T-51菌株分别在不同温度条件下对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用，图中每组数据从左到右依次表示15℃、20℃、25℃、30℃和35℃下的抑制作用；
图3为拟康宁木霉T-51菌株分别在不同pH时对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用，图中每组数据从左到右依次表示pH为5、7、9和11；
图4为不同孢子悬浮液对番茄幼苗浸根后，植株病情指数；
图5为不同孢子悬浮液对番茄幼苗浸根后，植株发病率；
图6为浸根后各处理番茄单株果实产量。
生物保藏信息
拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51，于2015年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地点为：中国、武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015729。
具体实施方式
本发明提供了一种抗番茄枯萎病的栽培方法，包括以下步骤：将番茄幼苗的根在拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51的分生孢子悬浮液中浸蘸，在所述浸蘸后移栽并定植；
所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度不低于1×106个/mL；
所述移栽和定植的环境温度为20～25℃，移栽基质的pH为7～9。
本发明将番茄幼苗的根在拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液中优选浸蘸30min。本发明所述拟康宁木霉T-51优选分离自湖北武汉地区油菜田土壤中，已于2015年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地点为：中国、武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015729。本发明所述拟康宁木霉T-51已在中国专利CN110938551A中进行公开。
本发明所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的制备方法，优选包括：将拟康宁木霉T-51的菌落边缘菌丝接种到PDA培养基上，利用无菌水刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，得所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液；所述无菌水中含体积百分含量为0.5％的吐温-20。本发明优选将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上进行培养，得到拟康宁木霉T-51的菌落，所述培养的温度优选为20℃，并在20℃条件下进行光照培养2天。本发明优选将菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上继续培养，所述继续培养的参数优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明得到所述康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液后，优选还包括利用血球计数板在显微镜下计数，调整分生孢子悬浮液浓度为1×107个/ml。
本发明针对不同时期的番茄幼苗，采用不同浓度的拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液进行处理，如当所述番茄幼苗为2周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×108个/mL；当所述番茄幼苗为3周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×107个/mL；当所述番茄幼苗为4周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×106个/mL。本发明所述浸蘸的时间优选为15～30min，更优选为30min。
本发明在所述浸蘸后移栽并定植。在本发明中，所述移栽和定植的环境温度为20～25℃，优选为20℃；所述移栽基质的pH为7～9，优选为7。
本发明所述枯萎病优选由尖孢镰刀菌引起。在本发明实施例中，将拟康宁木霉T-51菌株与尖孢镰刀菌在PDA培养皿中进行平板对峙，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃环境条件下，拟康宁木霉T-51菌株在20～25℃范围内对尖孢镰刀菌有较显著的抑制效果，其中以20℃效果最好；将拟康宁木霉T-51菌株与尖孢镰刀菌在PDA培养皿中进行平板对峙，其PDA的pH分别设置四个梯度：5、7、9和11，拟康宁木霉T-51菌株在pH＝5～11范围内对尖孢镰刀菌均有抑制效果，在pH＝7～9时抑制效果较显著，其中以pH＝7时效果最好。
本发明对所述PDA的来源和配制方法并没有特殊限定，优选的包括以下浓度的原料：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂粉10g/L，在配制时优选将洗净后去皮的马铃薯切片，加水煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖，将琼脂粉加水搅拌均匀，加入上述溶液中，再加水补足，搅拌溶解后分装灭菌。
本发明还提供了一种提高番茄产量的栽培方法，包括以下步骤：将番茄幼苗的根在拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)T-51的分生孢子悬浮液中浸蘸30min，在所述浸蘸后移栽并定植；
所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度不低于1×106个/mL；
所述移栽和定植的环境温度为20～25℃，移栽基质的pH为7～9。
本发明所述栽培方法优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗番茄枯萎病和提高番茄产量的栽培方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
拟康宁木霉T-51菌株对尖孢镰刀菌的抑制作用
将保存的T-51菌株和尖孢镰刀菌分别在PDA平板上活化，在超净工作台里用打孔器在PDA培养基平板上打孔，得到5×5mm的菌饼，将两种菌转接到新的PDA平板，室温培养7天。重复三次统计平均值，结果如图1所示，T-51菌株表现出显著的抑制尖孢镰刀菌作用。
实施例2
拟康宁木霉T-51菌株抑制尖孢镰刀菌生长的适宜温度范围
将保存的T-51菌株和尖孢镰刀菌分别在PDA平板上活化，在超净工作台里用打孔器在PDA培养基平板上打孔，得到5×5mm的菌饼，将两种菌转接到新的PDA平板。将平板分别放置在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒温培养箱内培养7天。十字交叉法测量不同温度下尖孢镰刀菌菌丝的生长直径(单位：cm)。重复三次统计平均值，结果如表1和图2所示，拟康宁木霉T-51菌株在20～25℃范围内对尖孢镰刀菌有较显著的抑制效果，其中以20℃效果最好。
表1不同温度时抑制率
温度 1d 3d 5d 7d
15℃ 13％ 22％ 28％ 37％
20℃ 18％ 36％ 44％ 59％
25℃ 13％ 24％ 33％ 47％
30℃ 10％ 21％ 32％ 42％
35℃ 12％ 16％ 12％ 13.79％
实施例3
拟康宁木霉T-51菌株抑制尖孢镰刀菌生长的适宜pH范围
将保存的T-51菌株和尖孢镰刀菌分别在PDA平板上活化，在超净工作台里用打孔器在PDA培养基平板上打孔，得到5×5mm的菌饼，将两种菌转接到新的PDA平板。新的平板分别是pH＝5、7、9和11的PDA培养基，培养7天。十字交叉法测量不同pH下尖孢镰刀菌菌丝的生长直径(单位：cm)。本试验重复三次统计平均值，结果如表2和图3所示，拟康宁木霉T-51菌株在pH＝5～11范围内对尖孢镰刀菌均有抑制效果，在pH＝7～9时抑制效果较显著，其中以pH＝7时效果最好。
表2不同pH时抑制率
pH值 1d 3d 5d 7d
5 3.333333 12.73224 14 36.66667
7 14.66667 13.47541 28.36538 58.96491
9 10.66667 12.93103 25.90291 50.7099
11 2 10.28807 19.92593 43.58865
实施例4
拟康宁木霉T-51菌株对番茄枯萎病的防治作用
对番茄材料同时进行萌发处理，后种植在50孔穴盘中，选择长势相似的番茄幼苗进行下一步处理；
将生长三周的番茄幼苗从穴盘里取出来，清水冲洗干净根部，分成四组，分别浸泡在清水(对照，表格和图片中以Control表示)、拟康宁木霉T-51菌株孢子悬浮液(1×107个/ml，表格和图片中以T-51表示)、尖孢镰刀菌孢子悬浮液(1×107个/ml)拟康宁木霉T-51菌株与尖孢镰刀菌孢子混合悬浮液(表格和图片中以T-51&F.oxy表示)中，浸根30min，每一处理24株；
将浸泡好的番茄幼苗定植于种植槽内，每个种植槽种植8株，水肥正常。本实验重复三次，将槽内基质pH调为7左右，环境温度在20℃左右。
其中：拟康宁木霉T-51孢子悬浮液制备：
1)将拟康宁木霉T-51菌株接种在PDA培养基上培养，得到拟康宁木霉T-51菌株菌落；
2)将步骤1)得到的拟康宁木霉T-51菌株菌落边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养；
3)在步骤2)的培养皿中加入含0.5％Tween-20的无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液。
4)将步骤3)的分生孢子悬浮液利用血球计数板方法在显微镜下计数，调整分生孢子悬浮液浓度为1×107个/ml。
处理后，番茄在苗期出现表型差异：根据番茄植株发病状态划分为4级：
0级：植株生长健壮，叶片自然舒展、绿色明亮，茎部粗壮；
1级：植株挺立，叶片黄化萎蔫面积小于叶总面积50％，茎基部褐化；
2级：植株叶片黄化萎蔫面积大于总叶面积50％，顶部叶片发黄且皱缩，茎部枯黄皱缩；
3级：植株矮小枯萎，叶片枯黄卷曲皱缩，仅生长点存活，茎部萎蔫；
4级：植株枯萎至死。
根据发病等级计算病情指数：病情指数＝∑(各级病株数x相应病级)/(总株数×最高病级)×100。以病情指数作为拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液对尖孢镰刀菌孢子悬浮液的抑制效果。结果如表3和图4所示。
计算发病率(处于2～4级即判定为枯萎病番茄植株)：发病率＝该处理发病植株数/该处理发病植株总数×100。以发病率作为拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液对尖孢镰刀菌导致番茄枯萎病的防治效果。结果如表4和图5所示。
采用拟康宁木霉T-51菌株分生孢子悬浮液浸根方法使番茄植株生长健壮，提高了单株番茄果实产量(表5和图6)。经过拟康宁木霉T-51菌株孢子液处理的番茄单株产量比对照组高；经过拟康宁木霉T-51菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理的番茄单株产量比单独尖孢镰刀菌孢子液处理组(表格和图片中以F.oxy表示)的高。
表3不同处理下的病情指数
Control F.oxy T-51&F.oxy T-51
病情指数 7.50％ 81.25％ 34％ 4.16％
表4不同处理下的防治效果
Figure BDA0003344532980000071
Figure BDA0003344532980000081
表5不同处理下的果实产量
Control F.oxy T-51&F.oxy T-51
平均单株产量(g) 142.8716667 49.277 135.67 186.7507692
实施例5
番茄幼苗不同时期适用的拟康宁木霉T-51菌株分生孢子液浓度
分别将生长两周、三周和四周的番茄幼苗从穴盘里取出，清洗干净植株根部，这三个时期的幼苗再各自分成三组，分别浸泡在1×108个/ml、1×107个/ml和1×106个/ml的拟康宁木霉T-51菌株分生孢子液浓度与尖孢镰刀菌的混合孢子液(1×107个/ml)中，浸根30min；
各时期番茄幼苗浸根后定植于种植槽中，每个槽定植8株，水肥正常，本试验重复三次统计平均值，不同处理后番茄幼苗枯萎病结果如表1所示，2周苗、3周苗和4周苗分别适宜1×108个/ml、1×107个/ml和1×106个/ml的拟康宁木霉T-51菌株分生孢子液浓度。
表1不同时期番茄幼苗枯萎病发病率
1×10<sup>6</sup>个/ml 1×10<sup>7</sup>个/ml 1×10<sup>8</sup>个/ml
两周苗 16.7％ 8.3％ 0
三周苗 12.5％ 0 0
四周苗 0 0 0
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种抗番茄枯萎病的栽培方法，其特征在于，包括以下步骤：将番茄幼苗的根在拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis）T-51的分生孢子悬浮液中浸蘸，在所述浸蘸后移栽并定植；
所述移栽和定植的环境温度为20~25℃，移栽基质的pH为7~9；
所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的制备方法，包括：将拟康宁木霉T-51的菌落边缘菌丝接种到PDA培养基上，利用无菌水刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，得所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液；
所述无菌水中吐温-20的体积百分含量为0.5%；
当所述番茄幼苗为2周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×108个/mL；
当所述番茄幼苗为3周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×107个/mL；
当所述番茄幼苗为4周苗时，所述拟康宁木霉T-51的分生孢子悬浮液的浓度为1×106个/mL；
所述枯萎病由尖孢镰刀菌引起；
所述浸蘸的时间为15~30min；
所述拟康宁木霉T-51的保藏编号为CCTCC NO:M 2015729。
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