CN113848317A - 一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条 - Google Patents

一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条。所述试纸条包括塑料外壳和免疫层析试纸条，免疫层析试纸条包括吸水垫、检测垫、免疫探针结合垫和样品垫；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线上包被有羊抗小鼠IgG，检测线上包被有AFB1‑BSA；所述免疫探针结合垫上涂有抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1与金纳米花形成的金纳米花免疫探针AuNF‑mAb；所述抗AFB1单克隆抗体3A1由抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1分泌产生。该试纸条用于检测黄曲霉毒素，具有检测快速，操作简单，灵敏度高的特点。

Description

一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒的试纸条。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等真菌产生的次生代谢产物，也是目前研究的最多和最为详细的一种真菌毒素，其毒性极强，广泛存在于粮食和油料作物的种子、乳类、乳制品类、发酵产品和饲料内，甚至在酒类和酶制剂中也都发现了黄曲霉毒素。因此，可以说黄曲霉毒素污染时时刻刻都在威胁着人类的生命和财产安全。目前分离得到的黄曲霉毒素共20多种，包括AFB1、AFB2、AFG1等。其中，以AFB1的毒性最强、危害最大。于动物而言，采食含黄曲霉毒素1μg/kg的食物或饲料就会引发中毒。于对人类而言，食用含有黄曲霉毒素的食品，会造成中毒、致癌等严重影响，特别是对肝脏造成严重损害。
目前对黄曲霉毒素的检测方法主要有生物检测法、仪器检测法和免疫化学检测法。生物检测法由于存在检测专一性弱、无法准确定量的问题，故无法比较精确的检测黄曲霉毒素。仪器分析法灵敏度高，但是所用大型仪器需在实验室由专人操作，且存在样品前处理复杂、成本高且花费时间长、不适合现场大宗产品的快速筛查等问题。酶联免疫反应和免疫层析技术等免疫分析方法以其快速、简便、灵敏及特异性强的特点近年来被广泛的应用于食品安全检测方面。本发明立足于我国目前食品中残存的黄曲霉毒素AFB1，在相关研究文献的基础上，将其与人血清白蛋白（HSA）相偶联，制备出完全抗原，通过小鼠免疫、细胞融合和抗体纯化，获得一株分泌抗AFB1抗体的单克隆杂交瘤细胞株。在对其它黄曲霉毒素的检测过程中惊喜的发现，该杂交瘤细胞株对黄曲霉毒素AFB2及AFG1也可以进行检测，以该抗体为基础，在最优条件下建立间接ELISA和金纳米花免疫层析试纸条方法，成功地应用于对AFB1、AFB2及AFG1的检测，这对实现食品中黄曲霉毒素的快速检测具有重要意义。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条，所述试纸条包括塑料外壳和免疫层析试纸条；其中，所述的免疫层析试纸条包括吸水垫、检测垫、免疫探针结合垫和样品垫；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线上包被有羊抗小鼠IgG，检测线上包被有黄曲霉毒素AFB1-牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA）；所述免疫探针结合垫上涂有抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1与金纳米花形成的金纳米花免疫探针（AuNF-mAb）的稀释液；所述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1由抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1分泌产生。
上述金纳米花免疫探针（AuNF-mAb）的稀释液的制备方法如下：通过种子生长法，以直径为20nm的胶体金为晶核，对苯二酚介导制备花瓣状金纳米花（AuNF）；取AuNF 20mL，向其中加入60μL 0.1M的K2CO3，然后缓慢滴加120μL 1.5mg/mL的抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1，维持搅拌1h，紫外可见全波长扫描分析吸附情况，按终浓度1wt%加入牛血清白蛋白，继续搅拌30min，按终浓度0.5vol%加入PEG20000，维持搅拌30min；静置于4℃平衡体系过夜；离心纯化探针，按1/10体积重悬，得到金纳米花免疫探针（AuNF-mAb）的稀释液。
上述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1的制备方法，步骤如下：将抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1以1×106cell/只的量注射到用弗氏不完全佐剂预致敏过的9周龄的Balb/c小鼠腹腔中，待小鼠腹部明显膨大且腹部皮肤具有紧张感时收集该小鼠的腹水，置于4℃下11000r/min离心20min，取中间层经过蛋白G亲和层析进行纯化，然后用超纯水透析完全，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1。
上述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1已于2021年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.21998；抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1的制备方法如下：通过碳二亚胺盐酸盐（EDC）将黄曲霉毒素AFB1与人血清白蛋白（HSA）交联形成人工完全抗原AFB1-HSA，作为Balb/c小鼠的免疫抗原；将Balb/c小鼠经抗原AFB1-HSA免疫5-8次后，用2倍于前一次免疫剂量的免疫抗原AFB1-HSA作最后一次加强免疫，3天后取脾细胞与SP2/0细胞用50vol%的PEG1450进行细胞融合，采用ELISA法分两步进行融合细胞的筛选：第一步采用间接竞争ELISA法筛选出抗人工完全抗原AFB1-BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，第一次亚克隆后7-8天采用同样的两步筛选进行检测，其余亚克隆后10-12天改为仅用间接竞争ELISA法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1。
上述一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1）将2.5cm×30cm的硝酸纤维膜固定于6cm×30cm的胶体金专用卡式底板上；将2.2mg/mL的人工完全抗原AFB1-BSA用0.01M pH7.4的PBS缓冲液按1:60体积稀释，在硝酸纤维膜上按照1.5μL/cm横向划线3mm，得检测线；将1mg/mL的羊抗小鼠IgG用0.01M pH7.4的PBS缓冲液按1:2体积稀释，在硝酸纤维膜上按照1.5μL/cm横向划线3mm，得质控线（质控线在上，检测线在下，检测线与质控线间的距离为0.8cm）；将吸水垫粘贴在所述硝酸纤维膜的远离检测线的一端，吸水垫与硝酸纤维膜之间的粘贴间隔为2mm；
2）将聚酯MA0280放入封闭液中浸湿，于37℃孵育封闭60min，干燥后剪成4mm×15mm的规格；将上述金纳米花免疫探针的稀释液按4/10体积重悬，然后取10μL加到上述聚酯MA0280上，冷冻干燥，得到免疫探针结合垫；将免疫探针结合垫粘贴在步骤1）得到的硝酸纤维膜的靠近检测线的一端，免疫探针结合垫于硝酸纤维膜之间的粘贴间隔为2mm；
3）将玻纤GL-b02放入封闭液中浸湿，于37℃孵育封闭60min，干燥后剪成4mm×15mm的规格，得到样品垫；将样品垫粘贴在步骤2）得到的免疫探针结合垫的远离检测线的一端，样品垫与免疫探针结合垫之间的粘贴间隔为2mm，得到免疫层析试纸条；
4）将步骤3）得到的免疫层析试纸条干燥后装配到完好的塑料外壳当中，即得到本发明所述的基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条。
其中，上述重悬液的配方均为：100mL pH7.4 0.01M的PBS缓冲液中加入0.5g牛血清白蛋白、0.5g甘氨酸、5g海藻糖和0.5mL Tween20；
上述封闭液的配方为：100mL pH7.4 0.01M的PBS缓冲液中加入1g牛血清白蛋白和1mL Tween 20。
上述一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条在检测黄曲霉毒素AFB1、AFB2和AFG1中的应用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1，用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得亲和力常数Kaff达9.38×108L/mol，可较好地识别黄曲霉毒素AFB1、AFB2及AFG1，对黄曲霉毒素AFB1的50%抑制浓度IC50达到220.3ng/mL。
（2）本发明提供的一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条，经半定量测定后，对黄曲霉毒素AFB1肉眼可见的最低检测限为0.125ng/mL，对黄曲霉毒素AFB2的最低检测限为1.25ng/mL，对黄曲霉毒素AFG1的最低检测限为1.25ng/mL，对黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1三者的混合毒素的最低检测限为0.34ng/mL。
附图说明
图1是本发明抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1的染色体分析图。
图2是本发明抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1分泌的单克隆抗体的亚型鉴定图。
图3是本发明抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1分泌的单克隆抗体的纯化结果鉴定图。泳道1：Maker；泳道2：腹水总蛋白；泳道3：纯化后的3A1单克隆抗体。
图4是本发明抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1所产生的单克隆抗体亲和力检测结果图。
图5是本发明抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1所产生的单克隆抗体的特异性分析图。
图6是本发明抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1所产生的单克隆抗体的特异性分析图。
图7是本发明3A1单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线图。
图8是本发明3A1单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线直线图。
图9是本发明金纳米花胶体溶液数码照片图。
图10是本发明金纳米花快速检测试纸对黄曲霉毒素AFB1半定量检测图。C为质控线，T为检测线，S为样品垫待测液滴加区域。
图11是本发明金纳米花快速检测试纸对黄曲霉毒素AFB2半定量检测图。C为质控线，T为检测线，S为样品垫待测液滴加区域。
图12是本发明金纳米花快速检测试纸对黄曲霉毒素AFG1半定量检测图。C为质控线，T为检测线，S为样品垫待测液滴加区域。
图13是本发明金纳米花快速检测试纸的特异性鉴定图。C为质控线，T为检测线，S为样品垫待测液滴加区域。
图14是本发明金纳米花快速检测试纸对混合黄曲霉毒素的敏感度检测图。C为质控线，T为检测线，S为样品垫待测液滴加区域。
图15是本发明金纳米花快速检测试纸对实际样品的检测图。C为质控线，T为检测线，S为样品垫待测液滴加区域。
具体实施方式
以下实施实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所用到的材料及主要试剂如下：
Balb/c小鼠购自上海吴氏实验动物；
RPMI-1640不完全培养基、HAT完全培养基、HT完全培养基均购自上海中乔新舟生物科技公司；
胎牛血清FBS购于赛默飞生物公司;
鼠源骨髓瘤细胞SP2/0购于上海一研生物科技有限公司；
亚型测定试剂盒购自上海翊圣生物公司；
吸水垫购自上海杰一生物技术有限公司；
羊抗小鼠IgG购自GAMA公司。
大米粉、小麦粉、大豆粉、花生米及玉米为超市随机购买；
其他常规试剂均购自上海麦克林生物科技有限公司。
实施例1 杂交瘤细胞株3A1的制备
所述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1的制备方法，包括以下步骤：
1. 人工完全抗原的制备
准确称量2mg 黄曲霉毒素AFB1 标准品与4mg植物胆碱加氧酶（CMO），将其混合并溶解于400μL吡啶中，将混合液置于1.5mL的EP 管中，在25℃恒温培养振荡器中避光反应24h。反应结束后，分别取出1μL和2μL的反应物进行薄层层析（thin layerchromatography, TLC），以进行定性检测，对照孔为1μL 0.1mg/mL的AFB1 标准品，在25mL氯仿-甲醇（9:1，V/V）为展开剂的层析缸中进行TLC 分析，在紫外灯下观察，直至AFB1完全转化为AFB1肟。若AFB1未完全转化为AFB1肟，则将上述 AFB1 标准品、CMO和吡啶的混合液继续置于25℃恒温培养振荡器中避光反应。AFB1 完全肟化成功以后，在通风橱中将吡啶挥发完全, 然后将AFB1肟分为质量相等的两等份。取一支10mL的离心管，将其中一份AFB1 肟加入至离心管中，然后加入0.64mL的DMF-水（6:9，V/V），再加入13.8mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC ），避光混匀，再向试管中加入0.13mol/L NaHCO3活化的载体蛋白HSA溶液1.4mL（1.4mL载体蛋白HSA 溶液中含有7mg的HSA 蛋白），然后25℃避光、100r/min 反应4h，之后再补加12.8mg的EDC继续反应24h，得到偶联产物人工完全抗原AFB1-HSA。
人工完全抗原AFB1-BSA的制备方法与AFB1-HSA相同，仅将制备方法中的人血清白蛋白（HSA）替换为牛血清白蛋白（BSA）。
2. 动物免疫
以人工完全抗原AFB1-HSA为免疫抗原，免疫6周龄Balb/c小鼠。取AFB1-HSA与等体积的弗氏完全佐剂混匀，用漩涡振荡器与注射器抽吸结合乳化完全后，以每只200μg/200μL的量于小鼠颈背部皮下多点注射。第一加强免疫与首次免疫间隔28天，取相同批次的完全抗原AFB1-HSA与等体积的弗氏不完全佐剂混匀，按每只50μg/200μL的量于小鼠颈背部皮下多点注射。其余加强免疫与上一次加强免疫均间隔21天，免疫剂量与方式与第一次加强免疫相同。从第四次加强免疫开始，每次免疫后5-7天内，于小鼠尾部静脉取血，分离血清，采用间接竞争ELISA法检测小鼠血清效价。从第六次加强免疫开始，每次免疫后5-7天，于小鼠尾部静脉取血，分离血清，采用间接竞争ELISA法检测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清IC50。选择效价及IC50均相对较好的小鼠，用2倍于前一次免疫剂量的免疫抗原AFB1-HSA以生理盐水稀释至500μL，于小鼠腹腔注射，进行最后一次冲击免疫。
3. 细胞融合
饲养层细胞的制备方法如下：将健康的7周龄Balb/c小鼠脱颈处死后在75vol%的酒精中浸泡6 min；将小鼠擦干，并将四肢固定在超净台中的泡沫板上，剪开腹部的上皮肤并撕开，使里面的腹腔膜暴露出来；用注射器吸取含有15vol% FBS的RMPI-1640不完全培养基5mL，并将其注入到小鼠腹腔内，避免扎到血管、内脏和肠等；将小鼠提起左右上下地晃动3min，使其中的饲养细胞充分溶解到培养基中，再用注射器将含有饲养细胞的培养基全部吸取出来，并注入到100mL含有15vol% FBS的RMPI-1640不完全培养基中；用移液枪将混合培养基移取到96孔细胞培养板中，每孔100μL，然后将培养板放到37℃、5%CO2培养箱中培养。
冲击免疫3-4天后取小鼠的脾细胞，采用50vol%的聚乙二醇1450（PEG1450）作为融合剂，按常规方法进行细胞融合。将上述小鼠脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0按照4:1的细胞个数比混合于20mL新鲜的RPMI-1640不完全培养基中，轻柔混合均匀后，1100rpm离心7min，弃上清，轻弹离心管使底部细胞松散，随后将离心管置于37℃水浴，于1min内先慢后快地滴加1mL 50vol%的PEG1450（PEG1450使用前于37℃下预热），边加边晃动离心管，促进细胞接触，静置0.5min，随后在第1min内缓慢加入1mL RPMI-1640不完全培养基，在2min内先慢后快补加RPMI-1640不完全培养基至混液体积为40mL，终止PEG的作用；然后1000rpm离心10min，弃去上清，加入5mL RPMI-1640不完全培养基轻柔混匀，将细胞悬液转入95mL HAT完全培养基中，混合均匀，铺板至预先铺好饲养层细胞的96孔板中，每孔100μL；将培养板放到37℃、5%CO2培养箱中培养；融合15天后用HT完全培养基换出全部的HAT完全培养基。
4. 细胞株的筛选及亚克隆
待细胞生长至融合后第5-7天，于96孔板中每孔吸取100μL上清，然后每孔补加120μL HAT完全培养基，融合第10-12天，采用ELISA法分两步进行筛选，第一步采用间接竞争ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素AFB1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出来的阳性孔以AFB1毒素作为竞争抗原进行间接竞争ELISA；选择吸光值和灵敏度均较高的孔（此处的吸光值，指同一个细胞孔的第一步检测结果；此处的灵敏度，指抑制率为50%时的竞争抗原浓度，即同一个细胞孔的第二步检测结果），采用有限稀释法进行亚克隆。第一次亚克隆后7-8天采用同样的两步筛选进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，其余亚克隆后10-12天改为仅用间接ELISA法进行检测，选择吸光值较高的孔，重复亚克隆2-3次后，直至阳性率为100%为止，即获得抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1。
5. 染色体分析
参照文献（Ian F R. Culture of Animal Cells - A Manual of BasicTechnique and Sp[M]. Alan R.Liss, 1987.），用0.1vol%的秋水仙素处理处于对数生长期的抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1，观察其染色体数目。结果如图1所示，处于***中期的抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1的染色体数目为106±3条，接近于两个亲本的染色体数目之和，证明该阳性抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1为鼠源骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合而成。
6. 抗体亚型鉴定
用市售亚型测定试剂盒鉴定抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1分泌的抗黄曲霉毒素AFB1的单克隆抗体，鉴定结果如图2所示，该抗体为IgG1亚型抗体。
上述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1已于2021年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21998。
实施例2 抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体的制备与性质鉴定
1. 腹水的制备与纯化
1）腹水的制备：将处于对数生长期的抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1按约1×106cell/只注射到弗氏不完全佐剂致敏过的9周龄Balb/c雌鼠腹腔，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，置4℃、13000r/min离心20min，离心后分为三层（由下向上依次为聚集物、含有大量抗体的中间层、脂质层），取中间层。
2）抗体纯化：采用Protein G亲和层析法对中间层进行纯化，以13% SDS-PAGE凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图3所示，纯化后的抗体在25kDa及50kDa处均有条带，分别对应IgG1抗体的轻链和重链，而且几乎没有杂带，表明纯化效果良好。用超纯水透析完全后，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1（mAb 3A1），将抗体置-20℃冰箱中备用。
2. 单克隆抗体的特性鉴定
本实施例中的包被缓冲液配方为：2.93g碳酸氢钠、1.59g碳酸钠溶于去离子水中并定容至1L，调pH至9.6。
1）亲和力测定：根据Beatty的方法（参考文献：Beatty J D, Beatty B G, VlahosW G. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzymeimmunoassay.[J]. Journal of Immunological Methods, 1987, 100(1-2):173-179.），用间接竞争ELISA法进行单克隆抗体亲和力常数Kaff的测定。用包被缓冲液将AFB1-BSA稀释成2.2、1.1、0.55、0.275μg/mL的浓度包被酶标板，其余步骤按常规间接ELISA法操作。利用Origin8.0进行分析，如图4所示，按下面公式计算mAb 3A1的亲和力常数，计算结果为9.38×108 L/mol ，3A1为高亲和力抗体。
Figure 754216DEST_PATH_IMAGE001
式中：[Ab] 表示抗原浓度为[Ag] 时，在IC50处的抗体浓度；
[Ab]t表示抗原浓度为[Ag]t时，在IC50处的抗体浓度；
n=[Ag]/[Ag]t。
2）特异性分析：检测抗原AFB1-BSA以1μg/mL的浓度包被酶标板，采用常规间接竞争ELISA法对海葵毒素（OA）、柠檬素（CTN）、青霉酸（PA）、曲霉毒素（OTA）进行检测，OA、CTN、PA、OTA均稀释为100ng/mL，mAb 3A1按1:64000体积进行稀释，结果如图5所示，mAb 3A1只对黄曲霉毒素AFB1有结合能力，说明mAb 3A1的特异性好。除此之外，还将钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）及鸡卵白蛋白（OVA）均稀释成1μg/mL包被酶标板，采用常规间接竞争ELISA法对mAb 3A1进行测定，结果如图6所示，mAb 3A1只与人工完全抗原AFB1-HSA结合，可说明mAb 3A1的特异性好。
3）灵敏度测定：用常规间接竞争ELISA法鉴定mAb 3A1对AFB1的灵敏度，绘制标准竞争曲线，结果如图7所示，曲线方程为y=0.0259+(1.09243-0.0259)/(1+(x/0.18308)^0.96476)，R2=0.98215，其中IC50 = 220.3ng/mL，在IC20-IC80之间呈现良好的线性关系，线性部分直线方程为y=1.1205-0.55242x ，R2=0.98094，结果如图8所示，线性范围0.029-1.526ng/mL，检测限（LOD）为0.023ng/mL 。
实施例3黄曲霉毒素AFB1的金纳米花免疫探针的制备
1. 金纳米花的制备与表征
1）金纳米花（AuNF）的制备：取100mL ddH2O调其pH值为7.0，向其中依次加入直径为20nm的胶体金500μL、1wt%的柠檬酸钠300μL、1wt%的HAuCl4 750μL，混合均匀，剧烈搅拌，然后一次性快速加入1mL 30mM的对苯二酚，持续剧烈搅拌30min，得到金纳米花胶体，置4℃下保存。
2）金纳米花（AuNF）的表征：如图9所示，上述制得的金纳米花胶体为深蓝色，未见浑浊，底部无沉淀，分散性良好；紫外可见光谱扫描，其最大吸收峰约为600nm。
2. 最适标记条件
1）最适标记抗体量：取酶标条分别加入200μL金纳米花（AuNF），各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μL浓度为1.01mg/mL的mAb 3A1，孵育30min；分别加入10wt% NaCl各20μL，5min后观测颜色变化趋于稳定的第一个孔对应的体积，结果为3μL mAb 3A1/200mL AuNF。
2）最适标记pH值：取酶标条分别加入200 μL金纳米花（AuNF），各加入0、1、2、3、4、5、6、7、8μL 0.1M的K2CO3，混匀，随后分别加入3μL浓度为1.15mg/mL的mAb 3A1，孵育30min；再分别加入10wt%的NaCl各20μL，5min后观测颜色最深的孔，结果为3μL 0.1M K2CO3/200mLAuNF。
3. 金纳米花免疫探针（AuNF-mAb）稀释液的制备
1）取20mL金纳米花（AuNF）置冰水浴，低速搅拌，向其中加入60μL 0.1M的K2CO3，然后缓慢滴加120μL 1.5mg/mL的mAb 3A1，维持冰水浴低速搅拌1h；按终浓度1wt%加入BSA，维持冰水浴，低速搅拌30min；再按终浓度0.5vol%加入PEG20000，继续搅拌30min；静置4℃平衡体系过夜。
2）离心纯化：将上述过夜后的体系置4℃、1500r/min离心20min，弃沉淀，取上清置4℃、10000r/min离心5min，保留沉淀，按1/10体积重悬，得到金纳米花免疫探针AuNF-mAb的稀释液。重悬液配方为：在100 mL的pH7.4 0.01M的PBS缓冲液中加入0.5g BSA、0.5g甘氨酸、5g海藻糖和0.5mL Tween20。
实施例4 基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条及其测试
1. 试纸条组装
1）将2.5cm×30cm的硝酸纤维膜（Sartorius CN140）固定于6cm×30cm的胶体金专用卡式底板上（DB-6）；将2.2mg/mL的人工完全抗原AFB1-BSA同0.01M的PBS缓冲液（pH7.4）按1:60体积稀释，在硝酸纤维膜上按照1.5μL/cm横向划线3mm，得检测线；将1mg/mL的羊抗小鼠IgG（GAMA）用0.01M的PBS缓冲液（pH7.4）按1:2体积稀释，在硝酸纤维膜上按照1.5μL/cm横向划线3mm，得质控线（质控线在上，检测线在下，检测线与质控线间的距离为0.8cm）；将吸水垫粘贴在所述硝酸纤维膜的远离所述检测线的一端，吸水垫与硝酸纤维膜之间的粘贴间隔为2mm；
2）将聚酯MA0280放入封闭液中浸湿，于37℃孵育封闭60min，干燥后剪成4mm×15mm的规格；将实施例3中得到的金纳米花免疫探针稀释液用重悬液按4/10体积进行稀释（重悬液配方同实施例3），然后取10μL加到上述聚酯MA0280上，冷冻干燥，得到免疫探针结合垫；将免疫探针结合垫粘贴在步骤1）得到的硝酸纤维膜的靠近所述检测线的一端，免疫探针结合垫与硝酸纤维膜之间的粘贴间隔为2mm；
3）将玻纤GL-b02放入封闭液中浸湿，于37℃孵育封闭60min，干燥后剪成4 mm×15mm的规格，得到样品垫；将样品垫粘贴在步骤2）得到的免疫探针结合垫的远离所述检测线的一端，样品垫与免疫探针结合垫之间的粘贴间隔为2mm，得到免疫层析试纸条；
4）将步骤3）得到的免疫层析试纸条干燥后装配到完好的塑料外壳当中，即得到本发明所述的基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条；
上述封闭液配方为：100 mL的pH7.4 0.01M 的PBS缓冲液中加入1g BSA和1mLTween 20。
2. 工作过程与结果判读
1）工作过程：取100μL待测液，滴加至试纸卡的样品垫，结合免疫探针结合垫上的免疫探针随液体流动而泳动，在侧流层析过程中免疫探针依据抗原抗体反应被截留在检测线和质控线处，在检测线和质控线处形成可视信号，检测过程为10min。
2）结果判读：检测线和质控线都正常显色，且颜色接近，为阴性，说明待测液中不含靶标；检测线不显色，质控线正常显色，为阳性，说明待测液中含有靶标，且浓度高于检测阈值；检测线显色明显浅于质控线显色，为阳性，说明待测液含有靶标。
3. 金纳米花快速检测试纸条的测试
1）灵敏度测试：用含有不同浓度的AFB1、AFB2及AFG1溶液，鉴定上述金纳米花快速检测试纸，该检测试纸对黄曲霉毒素经半定量测定后，AFB1肉眼可见的最低检测限（vLOD）为0.125ng/mL（图10），AFB2的最低检测限为1.25ng/mL（图11），AFG1的最低检测限为1.25ng/mL（图12）。
2）特异性测试：用PA、CTN、OA、OTA、AFB1、AFB2及AFG1对上述金纳米花快速检测试纸做特异性检测，与空白对照相比，仅AFB1、AFB2及AFG1能使卡条检测线消失，证明该试纸卡条能特异性识别AFB1、AFB2及AFG1三种黄曲霉毒素，结果如图13所示。
3）混合毒素检测：根据查询文献（Nii, Korley, Kortei, et al. Riskassessment and exposure to levels of naturally occurring aflatoxins in somepackaged cereals and cereal based foods consumed in Accra, Ghana.[J].Toxicology Reports, 2018.）得到的混合黄曲霉毒素在自然界中的所占比例，模拟在实际应用中的检测情况，将已有的黄曲霉毒素标品AFB1、AFB2及AFG1按照文献中的比例稀释并混合（AFB1:AFB2:AFG1(m:m:m)= 77.6:10.9:7.5），得到的混合毒素的最低检测阈值为0.34ng/mL，结果如图14所示。
实施例5金纳米花快速检测试纸的应用
1）实际样品前处理：分别取随机购买于超市的大米粉、小麦粉、大豆粉及花生米各两份，同时挑选超市已腐败的玉米和本实验室已侵染混合黄曲霉毒素（AFB1:AFB2:AFG1(m:m:m)= 77.6:10.9:7.5）的玉米，将其磨成粉。粮食粉末样品的处理方法是：用三倍体积的甲醇溶解，过滤。
2）金纳米花快速检测试纸的检测：用稀释过的实际样品100μL点样，以实施例4中的金纳米花快速检测试纸进行检测。检测结果如图15所示。
对照：加入未经处理的双蒸水100μl ，金纳米花试纸未检测出黄曲霉毒素。
样品1（sample 1）：已侵染黄曲霉毒素的玉米，金纳米花试纸检测结果为检测出黄曲霉毒素或检测结果高于检测限。
样品2（sample 2）：超市挑选的已开始腐败的玉米，金纳米花试纸检测结果为检测出黄曲霉毒素或检测结果高于检测限。
样品3（sample 3）：花生米经磨样处理，金纳米花试纸检测结果为未检测出黄曲霉毒素或检测结果低于检测限。
样品4（sample 4）：大豆粉，金纳米花试纸检测结果为未检测出黄曲霉毒素或检测结果低于检测限。
样品5（sample 5）：大米粉，金纳米花试纸检测结果为未检测出黄曲霉毒素或检测结果低于检测限。
样品6（sample 6）：小麦粉，金纳米花试纸检测结果为未检测出黄曲霉毒素或检测结果低于检测限。
上述检测限均指的是实施例4中得到的混合毒素的最低检测阈值（0.34 ng/mL）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条，其特征在于：所述试纸条包括塑料外壳和免疫层析试纸条；其中，所述的免疫层析试纸条包括吸水垫、检测垫、免疫探针结合垫和样品垫；所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线上包被有羊抗小鼠IgG，检测线上包被有黄曲霉毒素AFB1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA；所述免疫探针结合垫上涂有抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1与金纳米花形成的金纳米花免疫探针AuNF-mAb的稀释液；所述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1由抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1分泌产生。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述金纳米花免疫探针AuNF-mAb的稀释液的制备方法如下：通过种子生长法，以直径为20nm的胶体金为晶核，对苯二酚介导制备花瓣状金纳米花AuNF；取金纳米花AuNF 20mL，向其中加入60μL 0.1M的K2CO3，然后缓慢滴加120μL 1.5mg/mL的抗AFB1单克隆抗体3A1，维持搅拌1h，按终浓度1wt%加入牛血清白蛋白，继续搅拌30min，按终浓度0.5vol%加入PEG20000，维持搅拌30min；静置于4℃平衡体系过夜；离心纯化探针，按1/10体积重悬，得到金纳米花免疫探针AuNF-mAb的稀释液；其中，所述重悬液配方为：100mL pH7.4 0.01M的PBS缓冲液中加入0.5g牛血清白蛋白、0.5g甘氨酸、5g海藻糖和0.5mL Tween20。
3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1的制备方法如下：将抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1以1×106 cell/只的量注射到用弗氏不完全佐剂预致敏过的9周龄的Balb/c小鼠腹腔中，待小鼠腹部明显膨大且腹部皮肤具有紧张感时收集该小鼠的腹水，置于4℃下11000 r/min离心20min，取中间层经过蛋白G亲和层析进行纯化，然后用超纯水透析完全，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体3A1。
4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株3A1已于2021年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21998。
5.一种如权利要求1所述的试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将2.5cm×30cm的硝酸纤维膜固定于6cm×30cm的胶体金专用卡式底板上；将2.2mg/mL的人工完全抗原AFB1-BSA用pH7.4 0.01M的PBS缓冲液按1:60体积稀释，在硝酸纤维膜上按照1.5μL/cm横向划线3mm，得检测线；将1mg/mL的羊抗小鼠IgG用pH7.4 0.01M的PBS缓冲液按1:2体积稀释，在硝酸纤维膜上按照1.5μL/cm横向划线3mm，得质控线；质控线在上，检测线在下，检测线与质控线间的距离为0.8cm；将吸水垫粘贴在所述硝酸纤维膜的远离检测线的一端，吸水垫与硝酸纤维膜之间的粘贴间隔为2mm；
2）将聚酯MA0280放入封闭液中浸湿，于37℃孵育封闭60min，干燥后剪成4mm×15mm的规格；将金纳米花免疫探针AuNF-mAb的稀释液按4/10体积重悬，然后取10μL加到上述聚酯MA0280上，冷冻干燥，得到免疫探针结合垫；将免疫探针结合垫粘贴在步骤1）得到的硝酸纤维膜的靠近检测线的一端，免疫探针结合垫与硝酸纤维膜之间的粘贴间隔为2mm；
3）将玻纤GL-b02放入封闭液中浸湿，于37℃孵育封闭60min，干燥后剪成4mm×15mm的规格，得到样品垫；将样品垫粘贴在步骤2）得到的免疫探针结合垫的远离检测线的一端，样品垫与免疫探针结合垫之间的粘贴间隔为2mm，得到免疫层析试纸条；
4）将步骤3）得到的免疫层析试纸条干燥后装配到完好的塑料外壳当中，即得到基于金纳米花技术半定量检测黄曲霉毒素的试纸条；
其中，所述重悬液配方为：100mL pH7.4 0.01M的PBS缓冲液中加入0.5g牛血清白蛋白、0.5g甘氨酸、5g海藻糖和0.5mL Tween20；
所述封闭液配方为：100mL pH7.4 0.01M的PBS缓冲液中加入1g牛血清白蛋白和1mLTween20。
6.如权利要求1所述的试纸条在检测黄曲霉毒素AFB1、AFB2和AFG1中的应用。
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