CN111500546A - 分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡 - Google Patents

分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡 Download PDF

Info

Publication number
CN111500546A
CN111500546A CN202010378256.1A CN202010378256A CN111500546A CN 111500546 A CN111500546 A CN 111500546A CN 202010378256 A CN202010378256 A CN 202010378256A CN 111500546 A CN111500546 A CN 111500546A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
aflatoxin
solution
cell strain
detection card
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010378256.1A
Other languages
English (en)
Inventor
边超
姚譞
樊敏伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Yimiao Hezhen Biomedical Technology Co ltd
Shanghai Tcm Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Yimiao Hezhen Biomedical Technology Co ltd
Shanghai Tcm Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Yimiao Hezhen Biomedical Technology Co ltd, Shanghai Tcm Technology Co ltd filed Critical Shanghai Yimiao Hezhen Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202010378256.1A priority Critical patent/CN111500546A/zh
Publication of CN111500546A publication Critical patent/CN111500546A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。该细胞株的分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。本发明提供的分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株8B11分泌的抗体可以高亲和力结合并同时识别《中国药典》规定的四种黄曲霉毒素主要亚型，即B1、B2、G1、G2，为开发总黄曲霉毒素快速检测产品提供基础。此外，本发明提供一种方便、快速的中药材前处理方法，配套基于抗原抗体反应的免疫层析检测卡，用于中药材黄曲霉毒素快速检测，具有快速、方便、低成本的优点，可大规模推广。

Description

分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和 一种免疫层析检测卡
技术领域
本发明涉及抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的杂交瘤细胞株领域，具体涉及分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。
背景技术
黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，有约20种，分别命名为B1、B2、G1、G2、M1、M2、GM、P1、Q1、毒醇等。黄曲霉毒素是主要由黄曲霉(aspergillus flavus)和寄生曲霉(a.parasiticus)产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中黄曲霉毒素位列一类致癌物，是毒性极强的剧毒物质，其中以B1的毒性最大，致癌性最强。动物食用黄曲霉毒素污染的饲料后，在肝、肾、肌肉、血、奶及蛋中可测出极微量的毒素。黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1简写为AFB1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。在中药领域里，2015版《中国药典》规定黄曲霉毒素检查有19种中药材，相对2010版《中国药典》增加了14个品种，具体包括：远志、大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟榔、酸枣仁、薏苡仁、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕。要求黄曲霉毒素B1不得超过5μg/kg；黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2总量不得超过10μg/kg。
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。
荧光免疫层析分析技术，非常适宜被用于黄曲霉毒素的检测，荧光免疫层析分析方法具有灵敏度高、稳定性好、成本低、速度快、受自然荧光干扰低等优点，成为食品质量安全快速检测分析研究的热点，是一种易于现场即时使用的检测技术。目前，用于荧光免疫分析的标记物主要包括荧光素、量子点、上转换纳米粒子等。
基于荧光免疫层析方法开发的检测产品的核心是特异性识别黄曲霉毒素的单克隆抗体，该抗体的结合灵敏度和特异性决定了检测试剂盒的质量，因此好的黄曲霉毒素单克隆抗体的研制是该类检测试剂盒开发的关键前提。目前市场广泛存在的检测黄曲霉毒素的快速检测产品均为检测黄曲霉毒素B1的胶体金或荧光免疫层析检测卡。其所用单克隆抗体试剂特异性识别黄曲霉毒素B1亚型，对其他亚型没有识别性。但是若要开发检测总黄曲霉毒素，即包含B1、B2、G1、G2四种黄曲霉毒素亚型的快速检测产品，则需要首先获得能够同时识别四种黄曲霉毒素的单克隆抗体试剂，并且对中药材进行前处理，其目的是将中药材中的黄曲霉毒素快速、充分的溶解于适宜抗体试剂结合的中性液相介质中。
目前《药典》规定的黄曲霉毒素前处理方法为：“取供试品粉末约15g(过二号筛)，精密称定，加入氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70％甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟(搅拌速度大于11000转/分钟)，离心5分钟(离心速度2500转/分钟)，精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(2015版《中国药典》)”。该方法是配合后续液相色谱检测所开发，不适用于配套免疫层析快速检测方法。主要问题是：1.最终检测样本中甲醇含量过高，影响抗原抗体结合反应；2.采用了免疫亲和柱净化，虽然去掉了大量可能影响色谱检测的杂质，但是提高了检测成本，增加了处理步骤和处理时间；3.处理过程耗时长，较为繁琐。
综上所述，目前对中药材黄曲霉毒素进行快速检测，需要一种同时识别四种黄曲霉毒素的单克隆抗体和适用于配套免疫层析快速检测方法的中药材前处理方法。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷，提供分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。通过构建杂交瘤细胞株、单克隆抗体的纯化产生抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种亚型的单克隆抗体，并且基于此，制备一种免疫层析检测卡，实现对中药材的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2四种亚型的快速检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。
本发明的第二个方面是提供上述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株分泌的抗体，该抗体的制备方法包括如下步骤：
步骤一，动物免疫：用黄曲霉毒素B1半抗原与免疫佐剂混合，乳化后，对实验动物皮下注射进行免疫；三次免疫后，将黄曲霉毒素B1半抗原溶于PBS缓冲液，然后腹腔注射进行回忆刺激；
步骤二，杂交瘤细胞株的构建：将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合，然后在室温加入预热的融合剂进行融合，融合后的细胞经处理后放置培养箱中进行培养，得到分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株；
步骤三，利用有限稀释法对杂交瘤细胞株进行单克隆化；
步骤四，生产抗体：给注射了降植烷的实验动物接种杂交瘤细胞，接种8-12天后，腹腔抽取含有抗体的腹水；
步骤五，纯化抗体。
进一步地，步骤一中黄曲霉毒素B1半抗原的注射剂量为0.1mg/次/只。
进一步地，步骤二中骨髓瘤细胞处于对数生长期。
进一步地，步骤二中骨髓瘤细胞与脾细胞的比例为1:10或1:5。
进一步地，步骤二中的融合剂为含5％DMSO的浓度为45％的聚乙二醇(PEG)溶液，融合的时间为60-120s。
进一步地，抗体纯化的具体步骤为：
(1)抽取的腹水用冷PBS溶液稀释后，离心、去沉淀；
(2)在4℃下，向上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，直至使上清液中硫酸铵的浓度为50％；
(3)将处理后的上清液置冰中30min～60min，然后离心、去上清，将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液中再进行透析；
(4)透析后，离心去沉淀，然后稀释上清液，通过柱层析法对抗体进行分离纯化。
本发明的第三个方面是提供一种免疫层析检测卡，用于对中药材的总黄曲霉毒素进行快速检测，其具体的制备方法包括如下步骤：
步骤一，用活化剂活化荧光微球，然后再加入上述抗体或兔IgG，然后振荡、离心、封闭，得到抗体偶联荧光微球或兔IgG偶联荧光微球溶液；
步骤二，向样品垫上滴加预处理液，结合垫上滴加偶联物稀释液；
步骤三，将步骤一制备的抗体偶联荧光微球溶液和兔IgG偶联荧光微球溶液混匀，喷洒至结合垫上；
步骤四，将黄曲霉毒素B1半抗原和羊抗兔IgG分别用PBS稀释，另外分别添加1％的抗体添加剂，划至NC膜上，T、C线各划1μl/cm；
步骤五，烘干结合垫和NC膜，然后将NC膜、结合垫、样品垫、吸水纸依次贴于底板上，切成一定宽度的试纸条，即为该免疫层析检测卡。
进一步地，步骤一中的活化剂包括如下浓度的溶液：50mg/ml Sulfo-NHS溶液和50mg/ml EDC溶液或50mg/ml EDC.Hcl溶液。
进一步地，步骤二中的偶联物稀释液的配制方法为：将0.7g Tx-100、180ml水、0.242g Tris、10g蔗糖和2g BSA完全溶解后，调pH至7.4，加水至200ml，过滤，4℃保存。
进一步地，步骤二中的预处理液的配制方法为：将0.6057g Tri、0.5g BSA、1gTween 20、0.073g EDTA和20μl Proclin 300完全溶解后，调pH至7.4，加水至100ml，4℃保存。
进一步地，使用免疫层析检测卡对中药材中的黄曲霉毒素进行检测前需对中药材进行前处理，具体的处理步骤如下：
(1)准确称取待测药材粉末15g，加入40-60ml 70％甲醇溶液，用均质机高速搅拌1-2分钟；
(2)然后将步骤(1)搅拌后的溶液在室温下进行离心或使用定量滤纸过滤；
(3)收集上清或滤液，然后加入磷酸盐缓冲液，混匀，即为处理好的待检样本。
进一步地，上清或滤液与磷酸盐缓冲液的体积比为100：200-800。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明提供的分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株8B11分泌的抗体可以高亲和力结合并同时识别《中国药典》规定的四种黄曲霉毒素主要亚型，即B1、B2、G1、G2，为开发总黄曲霉毒素快速检测产品提供基础。此外，本发明提供一种方便、快速的中药材前处理方法，配套基于抗原抗体反应的免疫层析检测卡，用于中药材黄曲霉毒素快速检测，具有快速、方便、低成本的优点，可大规模推广。
附图说明
本发明公开的分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其已进行保藏，分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。
图1为本发明一实施例中单克隆抗体6B12对总黄曲霉毒素抗原的定量曲线；
图2为本发明一实施例中单克隆抗体6B12对四种不同黄曲霉毒素亚型(B1、B2、G1、G2)的识别反应性的柱状图；
图3为本发明一实施例中免疫层析检测卡检测总黄曲霉毒素的定量标准曲线。
具体实施方式
本发明涉及分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
如无特殊说明，本发明所述实验过程所用试剂、材料均为常规商品化试剂和材料，所用方法为标准实验方法(具体细节参照《抗体技术实验指南》(E.哈洛著科学出版社2005)和《抗体制备与使用实验指南》G.C.霍华德著科学出版社2010)，所提及学术专用名词及其英文缩写如无特殊说明均按照全国科学技术名词审定委员会编《免疫学名词》(科学出版社2008)的规定使用。以下实施例涉及的试剂和仪器为：
黄曲霉毒素B1半抗原(黄曲霉毒素B1 BSA偶联物，简称AFB1-BSA)购自北京孚博生物科技有限公司；
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2对照品购自北京索莱宝科技有限公司；
黄曲霉毒素混合对照品购自中国食品药品检定研究院；
小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0购自中国科学院细胞库；
荧光微球购自南京微测生物科技有限公司；
荧光免疫分析仪购自杭州格伦坤科技有限公司。
实施例一
本实施例提供分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其已进行保藏，分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。
上述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株的构建方法为：
步骤一，动物免疫：
实验动物采用Balb/c品系雌性6周龄小鼠。免疫流程：用AFB1-BSA与Freund’s完全佐剂混合，乳化后，皮下多点注射进行免疫。AFB1-BSA的剂量为0.1mg/次/只。首次免疫用完全Freund’s佐剂，再次免疫用不完全Freund’s佐剂。每次免疫的间隔时间为3周，共3次免疫。第三次免疫后，进行细胞融合前对小鼠进行回忆刺激，0.1mg抗原溶解于0.5ml PBS缓冲液中，腹腔注射。回忆刺激后3天，进行细胞融合和杂交瘤构建。
步骤二，杂交瘤细胞株构建：
细胞融合前一天制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml，均为100μl/孔。
(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液(RPMI1640)洗涤2次。
(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。
(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
(6)在室温下融合：30秒内加入预热的1ml 45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌，作用90秒钟后加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
(7)离心，800rpm，6分钟。
(8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
(11)融合24小时后，加HAT选择培养液(用时1ml加入50ml 20％小牛血清完全培养液中)，然后在37℃、5％CO2条件下培养3-7天，即得该分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株。
实施例二
本实施例提供利用实施例一构建的细胞株制备的抗黄曲霉毒素四种亚型(B1、B2、G1、G2)的抗体，其制备过程如下：
步骤一，杂交瘤细胞株的单克隆化(有限稀释法)：
(1)制备饲养细胞悬液：一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106/ml，小鼠脾细胞为1×106/ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml，均为100μl/孔。
(2)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×103/ml。
(3)取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
(4)培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。
(5)第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注：初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
(6)采用有限稀释法连续克隆阳性杂交瘤细胞3次。构建稳定细胞株，并扩大培养、冻存。
步骤二，抗体生产：
(1)于小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，注射后1～9周内种植细胞。
(2)收取对数生长期的杂交瘤细胞，用不完全培养液洗涤一次，1000r/min离心10min。
(3)取样，用台盼兰染色，计活细胞数，重新用不完全培养液配成1.0×107细胞/ml的悬液。
(4)给注射了降植烷的小白鼠接种杂交瘤细胞，每只腹腔注射1ml(含1.0×107个细胞/ml)。
(5)接种后10天左右时间肿瘤体积最大，此时可由腹腔抽取腹水，每隔1～3天取1次。血清可由腋下动脉或心脏采血后分离。
步骤三，纯化单克隆抗体
(1)小鼠腹水用冷PBS液稀释4倍后，于1×105转离心30min，去沉淀。
(2)在4℃于上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使溶液最终为50％硫酸铵浓度。
(3)此溶液置冰中30min～60min，然后5000r/min离心10min，去上清。
(4)将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液(40mMol/L NaCl)中(溶液可能混浊)。
(5)装入透析袋于Tris-HCl缓冲液(20mMol/L NaCl)中透析除盐。
(6)离心去沉淀。
(7)溶液稀释(1:100或更高倍稀释)后，于280nm测蛋白含量，估计蛋白质含量：1A280unit＝0.8mg蛋白质。一般每毫升腹水中，含有总蛋白约25mg～36mg。
(8)过DEAE-纤维素柱：纤维素柱高40cm，以20mMol/L NaCl Tris缓冲液平衡。透析样品以Tris缓冲液等量稀释。样品进入柱床速度为1ml～2ml/min，以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/L NaCl洗脱，也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L～150mMol/L NaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰，单克隆IgG(6B12)保存备用。
实施例三
本实施例采用竞争ELISA法检测单克隆IgG对总黄曲霉毒素的定量识别，具体步骤如下：
(1)抗原包被：取抗原(B1-BSA)用pH9.6的碳酸盐缓冲液配制成一定浓度(3μg/ml)的包被液，混匀。加入96孔ELISA检测板，100μl/孔。置于4℃冰箱内过夜。
(2)封闭：洗板，加封闭液(0.5％BSA溶于PBS)，200μl/孔，37℃保温箱温育2小时。
(3)加一抗(待测样品)：洗板。单克隆抗体6B12用PBS稀释成2μg/ml的浓度，分别与系列稀释的B1标准品按1：1混合，稍震荡，50μl/孔，立刻加到酶标板上，37℃恒温箱孵育1h。
(4)加二抗：洗板。稀释好的二抗(商品化羊抗鼠Ig-HRP，如：ab6789，abcam，1:2000稀释使用)加入孔内，100μl/孔。37℃温育1小时。
(5)显色：洗板。配好TMB底物，加入孔中，100μl/孔。显色5～10min后，加2M硫酸100μl/孔终止反应。
(6)检测：用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度OD值，然后分析数据。
由图1可知，包被3μg/ml黄曲霉素B1-BSA，竞争抗体6B12浓度2μg/ml,可定量检测的总黄曲霉毒素浓度范围在0.03-3ng/ml之间。
实施例四
本实施例采用ELISA检测法测定单克隆抗体6B12对不同亚型黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)的识别性，包括如下步骤：
(1)抗原包被：取抗原(B1-BSA)用pH9.6的碳酸盐缓冲液配制成一定浓度(4μg/ml)的包被液，混匀。加入96孔ELISA检测板，100μl/孔。置于4℃冰箱内过夜。
(2)封闭：洗板，加封闭液(0.5％BSA溶于PBS)，200μl/孔，37℃保温箱温育2小时。
(3)加一抗(待测样品)：洗板。将处理好的一抗溶液即纯化后的单克隆抗体6B12(实施例二的步骤三中第8步的洗脱液)与不同亚型的黄曲霉毒素混合，37℃孵育1小时，其中黄曲霉毒素浓度为0.05mg/ml，抗体浓度为0.1mg/ml。孵育后，将该溶液加到孔内，100μl/孔。37℃温箱温育2小时。
(4)加二抗：洗板，稀释好的二抗(商品化羊抗鼠Ig-HRP，如：ab6789，abcam，1:2000稀释使用)加入孔内，100μl/孔。37℃温育1小时。
(5)显色：洗板，配好TMB底物，加入孔中，100μl/孔。显色5～10min后，加2M硫酸100μl/孔终止反应。
(6)检测：用酶标仪检测溶液在450nm下的吸光度OD值，然后分析数据。
由图2可知，单克隆抗体6B12对B1、B2、G1、G2四种亚型黄曲霉毒素均有较好识别。
实施例五
本实施例提供一种对中药材的总黄曲霉毒素进行快速检测的免疫层析检测卡，其制备方法包括如下步骤：
步骤一，制备抗体偶联荧光微球：
1.活化微球
1.1.取2支1.5ml离心管各加入275μl 0.1M NaH2PO4溶液(pH6.2)，50μl荧光微球，混匀。
1.2.配置活化剂
50mg/ml Sulfo-NHS溶液+50mg/ml EDC溶液；
50mg/ml Sulfo-NHS溶液+50mg/ml EDC.HCl溶液。
1.3.微球活化
1号EP管中加入6μl Sulfo-NHS溶液，混匀，立即加入22μl EDC溶液，混匀；2号EP管中加入6μlSulfo-NHS溶液，混匀，立即加入22μlEDC.HCl溶液，混匀，37℃，振荡20min，250r。
1.4.离心：15000×g，离心，10min，去上清。
1.5.1号EP管重复步骤1.3和1.4，二次活化微球。
1.6.每支EP管中加入250μl 0.1M HEPES(pH 6.5)混匀。
1.7.超声：功率100W，工作4s，间隔2s，工作次数50次。
2.偶联
2.1.250μl的活化微球中分别加入40μg 6B12抗体(1号管)和40μg兔IgG(2号管)。
2.2.37℃振荡1.5h，250r。
2.3.离心：15000×g，离心，10min，去上清。
3.封闭
3.1.加入550μl 1％BSA溶液(0.1g BSA用0.1M HEPES(pH 6.5)定容至10ml，过滤)，混匀。
3.2.37℃振荡40min，250r。
3.3.离心：15000×g，离心，10min，去上清。
3.4.分别加入360μl和720μl偶联物保存液，混匀。
3.5.超声：功率100W，工作4s，间隔2s，工作次数50次，4℃保存。
步骤二，制备荧光免疫层析试纸条：
(1)将结合垫裁成11×300mm，样品垫11×300mm，吸水纸16×300mm，NC膜25×300mm，底板60×300mm规格。
(2)样品垫：样品垫预处理液，70μl/cm，滴加于样品垫上，37℃，烘干。
(3)结合垫：偶联物稀释液，30μl/cm，滴加于结合垫上，37℃，烘干。
(4)取30μl荧光标记6B12抗体溶液(111.1μg/ml)和30μl兔IgG溶液(55.56μg/ml)于离心管中，混匀，2μl/cm喷至结合垫上。
(5)将B1-BSA和羊抗兔IgG分别用PBS稀释至1.5mg/ml和0.2mg/ml，另外分别添加1％的抗体添加剂，划至NC膜上，T、C线各划1μl/cm。
(6)将结合垫和NC膜，37℃，烘干。
(7)将NC膜，结合垫，样品垫，吸水纸依次贴于底板上，切成4mm宽试纸条，即为免疫层析检测卡。
其中，偶联物稀释液的配制方法为：将0.7g Tx-100、180ml水、0.242g Tris、10g蔗糖和2g BSA完全溶解后，调pH至7.4，加水至200ml，过滤，4℃保存。
样品垫处理液的配制方法为：将0.6057g Tri、0.5g BSA、1g Tween 20、0.073gEDTA和20μl Proclin 300完全溶解后，调pH至7.4，加水至100ml，4℃保存。
实施例六
本实施例提供一种适用于黄曲霉毒素免疫层析快速检测的中药材前处理方法，包括如下步骤：
(1)准确称取待测药材粉末15g于烧杯中，油性药材加入3g氯化钠(非油性药材可不加)，加入40-60ml70％甲醇溶液，用均质机高速搅拌1-2分钟(搅拌速度大于11000转/分钟)。
(2)室温(20～25℃)离心5分钟(离心速度2500转/分钟)，如无离心设备，可使用定量滤纸过滤，如药材吸湿性过强，可用玻璃搅拌棒适当挤压。
(3)收集上清或滤液，准确吸取100μl于离心管中。
(4)在离心管中加入200-800μl磷酸盐缓冲液(预先恢复至室温)，混匀，即为待检样本。稀释的待检样本应在制备后6小时内检测完毕。
实施例七
本实施例利用实施例五提供的荧光免疫层析检测卡检测中药材样本总黄曲霉毒素，具体步骤如下：
(1)取出检测卡，平放在桌面上。
(2)用移液器吸取待检样本100μl，垂直滴加于加样孔中，加样后开始计时，反应15分钟。
(3)将荧光免疫分析仪连接电源，将电源开关拨到“-”的位置，启动荧光免疫分析仪，将检测卡***荧光免疫分析仪(注：加样孔朝里)，按检测按键，定量检测结果将呈现于仪器液晶显示屏上，可按打印键打印获得纸质的检测报告。
(4)标准曲线：本仪器使用前需首先绘制定量标准曲线，检测结果与定量标准曲线相比，计算得到最终的总黄曲霉毒素含量。制作标准曲线的方法：将总黄曲霉毒素标准对照品在磷酸盐缓冲液中配置成9ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0.33ng/ml、0.11ng/ml和0的参比溶液。采用上述检测卡测试方法检测，得到对应荧光值(T/C)，并绘制标准曲线(如图3所示)。
(5)实验用中药材样本的准备：采用黄曲霉毒素阴性的中药材样本(柏子仁、大枣、肉豆蔻、桃仁、炒麦芽、酸枣仁、胖大海、僵蚕、槟榔、莲子)，人工添加不同浓度(15μg/kg、10μg/kg、2μg/kg)的总黄曲霉毒素标准品，采用快检配套前处理方法(如实施例六所述)处理后即得，每个样本重复测定6-8次，取检测平均值作为检测结果并计算CV及回收率，结果如表1、2、3所示。
表1荧光免疫层析检测卡对若干中药材样本的检测结果(浓度为15μg/kg)
Figure BDA0002481041590000131
Figure BDA0002481041590000141
表2荧光免疫层析检测卡对若干中药材样本的检测结果(浓度为10μg/kg)
Figure BDA0002481041590000142
表3荧光免疫层析检测卡对若干中药材样本的检测结果(浓度为2μg/kg)
Figure BDA0002481041590000143
Figure BDA0002481041590000151
以15μg/kg和2μg/kg组参照计算，本检测产品灵敏度为97.5％，特异度为100％。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (13)

1.分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株，其特征在于，其分类命名为抗黄曲霉素杂交瘤细胞株8B11，保藏编号为CCTCC NO：C2019314，保藏日期为2019年12月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉市武汉大学。
2.一种如权利要求1所述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株分泌的抗体，其特征在于，采用以下步骤制备：
步骤一，动物免疫：用黄曲霉毒素B1半抗原与免疫佐剂混合，乳化后，对实验动物皮下注射进行免疫；三次免疫后，将黄曲霉毒素B1半抗原溶于PBS缓冲液，然后腹腔注射进行回忆刺激；
步骤二，杂交瘤细胞株的构建：将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合，然后在室温加入预热的融合剂进行融合，融合后的细胞经处理后放置培养箱中进行培养，得到所述分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株；
步骤三，利用有限稀释法对所述杂交瘤细胞株进行单克隆化；
步骤四，生产抗体：给注射了降植烷的实验动物接种所述杂交瘤细胞株，接种8-12天后，腹腔抽取含有抗体的腹水；
步骤五，纯化抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤一中所述黄曲霉毒素B1半抗原的注射剂量为0.1mg/次/只。
4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤二中所述骨髓瘤细胞处于对数生长期。
5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤二中所述骨髓瘤细胞与脾细胞的比例为1:10或1:5。
6.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，步骤二中所述融合剂为含5％DMSO的浓度为45％的聚乙二醇溶液，融合的时间为60～120s。
7.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体纯化的具体步骤为：
(1)抽取的腹水用冷PBS溶液稀释后，离心、去沉淀；
(2)在4℃下，向上清中缓缓滴加饱和硫酸铵液，边加边搅拌，直至使上清液中硫酸铵的浓度为50％；
(3)将处理后的上清液置冰中30min～60min，然后离心、去上清，将沉淀溶于Tris－HCl缓冲液中再进行透析；
(4)透析后，离心去沉淀，然后稀释上清液，通过柱层析法对抗体进行分离纯化。
8.一种免疫层析检测卡，其特征在于，用于对中药材的黄曲霉毒素进行快速检测，其具体的制备方法包括如下步骤：
步骤一，用活化剂活化荧光微球，然后再加入如权利要求2-3所述的抗体或兔IgG，然后振荡、离心、封闭，得到抗体偶联荧光微球或兔IgG偶联荧光微球溶液；
步骤二，向样品垫上滴加预处理液，结合垫上滴加偶联物稀释液；
步骤三，将步骤一制备的所述抗体偶联荧光微球溶液和兔IgG偶联荧光微球溶液混匀，喷洒至结合垫上；
步骤四，将黄曲霉毒素B1半抗原和羊抗兔IgG分别用PBS稀释，另外分别添加1％的抗体添加剂，划至NC膜上，T、C线各划1μl/cm；
步骤五，烘干结合垫和NC膜，然后将NC膜、结合垫、样品垫、吸水纸依次贴于底板上，切成一定宽度的试纸条，即为所述免疫层析检测卡。
9.根据权利要求8所述的免疫层析检测卡，其特征在于，步骤一中所述活化剂包括如下浓度的溶液：50mg/ml Sulfo-NHS溶液和50mg/ml EDC溶液或50mg/ml EDC.Hcl溶液。
10.根据权利要求8所述的免疫层析检测卡，其特征在于，步骤二中所述偶联物稀释液的配制方法为：将0.7g Tx-100、180ml水、0.242g Tris、10g蔗糖和2g BSA完全溶解后，调pH至7.4，加水至200ml，过滤，4℃保存。
11.根据权利要求8所述的免疫层析检测卡，其特征在于，步骤二中所述预处理液的配制方法为：将0.6057g Tri、0.5g BSA、1g Tween 20、0.073g EDTA和20ul Proclin 300完全溶解后，调pH至7.4，加水至100ml，4℃保存。
12.根据权利要求8所述的免疫层析检测卡，其特征在于，使用所述免疫层析检测卡对中药材中的黄曲霉毒素进行检测前需对中药材进行前处理，具体的处理步骤如下：
(1)准确称取待测药材粉末15g，加入40～60ml 70％甲醇溶液，用均质机高速搅拌1-2分钟；
(2)然后将步骤(1)搅拌后的溶液在室温下进行离心或使用定量滤纸过滤；
(3)收集上清或滤液，然后加入磷酸盐缓冲液，混匀，即为处理好的待检样本。
13.根据权利要求12所述的免疫层析检测卡，其特征在于，所述上清或滤液与磷酸盐缓冲液的体积比为100：200-800。
CN202010378256.1A 2020-05-07 2020-05-07 分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡 Pending CN111500546A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010378256.1A CN111500546A (zh) 2020-05-07 2020-05-07 分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010378256.1A CN111500546A (zh) 2020-05-07 2020-05-07 分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111500546A true CN111500546A (zh) 2020-08-07

Family

ID=71866678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010378256.1A Pending CN111500546A (zh) 2020-05-07 2020-05-07 分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111500546A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111965342A (zh) * 2020-08-11 2020-11-20 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种提高胶乳免疫比浊法线性范围和稳定性的方法、试剂及试剂盒
CN117007712A (zh) * 2023-08-04 2023-11-07 安徽天祥药业有限公司 一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101930006A (zh) * 2010-08-05 2010-12-29 中国农业科学院油料作物研究所 快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条及其制备方法
CN101993855A (zh) * 2010-08-05 2011-03-30 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株1c11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用
CN102747042A (zh) * 2012-04-20 2012-10-24 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株10g4及其产生的抗黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2总量单克隆抗体
CN104004717A (zh) * 2014-05-21 2014-08-27 无锡杰圣杰康生物科技有限公司 一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN104897863A (zh) * 2014-03-06 2015-09-09 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测黄曲霉毒素m1的荧光微球免疫层析试纸条及方法
CN107083368A (zh) * 2017-04-10 2017-08-22 北京勤邦生物技术有限公司 一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101930006A (zh) * 2010-08-05 2010-12-29 中国农业科学院油料作物研究所 快速检测黄曲霉毒素总量的高灵敏度免疫层析试纸条及其制备方法
CN101993855A (zh) * 2010-08-05 2011-03-30 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株1c11、其产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体及其应用
CN102747042A (zh) * 2012-04-20 2012-10-24 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株10g4及其产生的抗黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2总量单克隆抗体
WO2013155882A1 (zh) * 2012-04-20 2013-10-24 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株10g4及其产生的抗黄曲霉毒素b1、b2、g1、g2总量单克隆抗体
CN104897863A (zh) * 2014-03-06 2015-09-09 北京勤邦生物技术有限公司 一种检测黄曲霉毒素m1的荧光微球免疫层析试纸条及方法
CN104004717A (zh) * 2014-05-21 2014-08-27 无锡杰圣杰康生物科技有限公司 一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN107083368A (zh) * 2017-04-10 2017-08-22 北京勤邦生物技术有限公司 一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111965342A (zh) * 2020-08-11 2020-11-20 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种提高胶乳免疫比浊法线性范围和稳定性的方法、试剂及试剂盒
CN111965342B (zh) * 2020-08-11 2023-08-29 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种提高胶乳免疫比浊法线性范围和稳定性的方法、试剂及试剂盒
CN117007712A (zh) * 2023-08-04 2023-11-07 安徽天祥药业有限公司 一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法
CN117007712B (zh) * 2023-08-04 2024-03-26 安徽天祥药业有限公司 一种炒僵蚕饮片中黄曲霉毒素的检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105424939B (zh) 一种检测多菌灵的试纸条及其制备方法和应用
CN108776219B (zh) 一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条
CN107422112B (zh) 一种检测乙氧酰胺苯甲酯的免疫试剂盒、制备方法及应用
CN110208539A (zh) 抗mrjp4的配对单克隆抗体、检测mrjp4的elisa试剂盒和胶体金免疫试纸
CN108196054B (zh) 一种检测甘草酸的试纸条及其制备方法和应用
CN109324182A (zh) 一种检测二甲戊灵的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN106282125A (zh) 一株分泌抗磺胺类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株NaN‑1及其应用
CN111500546A (zh) 分泌抗黄曲霉毒素四种亚型抗体的细胞株及其分泌的抗体和一种免疫层析检测卡
CN105277708A (zh) 检测辣椒中黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒
CN109917126A (zh) 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法
CN107271665B (zh) 一种检测沙丁胺醇的试纸条及其应用
CN109265404A (zh) 一种多菌灵半抗原与抗原的制备方法及应用
CN101413956A (zh) 一种快速检测三聚氰胺的胶体金检测卡及其制备方法
CN101885774B (zh) 去氢***单克隆抗体、制备方法及其应用
CN111175511A (zh) 一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN112285354B (zh) 一种基于单克隆抗体检测细交链格孢菌酮酸的金纳米花快速检测试纸
CN104560886B (zh) 一株抗纳他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN108931640B (zh) 一种检测有机磷农药的试纸条及其应用
CN104345145B (zh) 一种检测呕吐毒素的试纸条及其应用
CN113156125B (zh) 一种检测米酵菌酸的试纸条及方法
CN115246818A (zh) 一种检测吡虫啉的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN106929479A (zh) 一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz‑4及其应用
CN103134939A (zh) 一种去氢***残留快速检测试纸卡及其制备方法
CN104215763B (zh) 一种检测t-2毒素的试纸条及其应用
CN111751535A (zh) 一种检测硫丹的试纸条及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200807

RJ01 Rejection of invention patent application after publication