具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,找到了与MAGE-A1抗原短肽KVLEYVIKV(SEQ IDNO:9)能够特异性结合的TCR,所述抗原短肽KVLEYVIKV可与HLA A0201形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外,本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。
术语
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质,可以是Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子。因此,其对于抗原的呈递具有特异性,不同的个体有不同的MHC,能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
T细胞受体(TCR),是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫***中,通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触,然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用,这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应,从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95%的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成,而5%的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链,α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义上讲,α和β各链包含可变区、连接区和恒定区,β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区,但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区),CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合,其中CDR3由可变区和连接区重组而成,被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域,可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息***(IMGT)的公开数据库中找到,如TCR分子α链的恒定域序列为“TRAC*01”,TCR分子β链的恒定域序列为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外,TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区,胞质区很短。
在本发明中,术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。
天然链间二硫键与人工链间二硫键
在天然TCR的近膜区Cα与Cβ链间存在一组二硫键,本发明中称为“天然链间二硫键”。在本发明中,将人工引入的,位置与天然链间二硫键的位置不同的链间共价二硫键称为“人工链间二硫键”。
为方便描述二硫键的位置,本发明中TRAC*01与TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序列的位置编号按从N端到C端依次的顺序进行位置编号,如TRBC1*01或TRBC2*01中,按从N端到C端依次的顺序第60个氨基酸为P(脯氨酸),则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Pro60,也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸,又如TRBC1*01或TRBC2*01中,按从N端到C端依次的顺序第61个氨基酸为Q(谷氨酰胺),则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Gln61,也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸,其他以此类推。本发明中,可变区TRAV与TRBV的氨基酸序列的位置编号,按照IMGT中列出的位置编号。如TRAV中的某个氨基酸,IMGT中列出的位置编号为46,则本发明中将其描述为TRAV第46位氨基酸,其他以此类推。本发明中,其他氨基酸的序列位置编号有特殊说明的,则按特殊说明。
发明详述
TCR分子
在抗原加工过程中,抗原在细胞内被降解,然后通过MHC分子携带至细胞表面。T细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此,本发明的第一方面提供了一种能够结合KVLEYVIKV-HLA A0201复合物的TCR分子。优选地,所述TCR分子是分离的或纯化的。该TCR的α和β链各具有3个互补决定区(CDR)。
在本发明的一个优选地实施方式中,所述TCR的α链包含具有以下氨基酸序列的CDR:
αCDR1-SSNFYA (SEQ ID NO:10)
αCDR2-MTLNGDE (SEQ ID NO:11)
αCDR3-AFPSGGGADGLT (SEQ ID NO:12);和/或
所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为:
βCDR1-SGDLS (SEQ ID NO:13)
βCDR2-YYNGEE (SEQ ID NO:14)
βCDR3-ASSVEGYPSYEQY (SEQ ID NO:15)。
可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容,本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此,本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。本发明TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1具有至少90%,优选地95%,更优选地98%序列相同性的氨基酸序列;和/或本发明TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:5具有至少90%,优选地95%,更优选地98%序列相同性的氨基酸序列。
在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。具体地,一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域,所述α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO:10)、CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。优选地,所述TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更优选地,所述TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:1。另一方面,所述异质二聚TCR分子的β链包含可变域和恒定域,所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。优选地,所述TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更优选地,所述TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子是由α链的部分或全部和/或β链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根据文献中所述,本领域技术人员能够容易地构建包含本发明CDRs区的单链TCR分子。具体地,所述单链TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ,优选地按照从N端到C端的顺序连接。
所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1(SEQ ID NO:10)、CDR2(SEQ ID NO:11)和CDR3(SEQ ID NO:12)。优选地,所述单链TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:1。更优选地,所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:1。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1(SEQ ID NO:13)、CDR2(SEQ ID NO:14)和CDR3(SEQ ID NO:15)。优选地,所述单链TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:5。更优选地,所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息***)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如,本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”,TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中给出的氨基酸序列的第53位为Arg,在此表示为:TRAC*01外显子1的Arg53,其他以此类推。优选地,本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID NO:3,和/或β链的氨基酸序列为SEQ ID NO:7。
天然存在的TCR是一种膜蛋白,通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样,TCR也可以被开发应用于诊断和治疗,这时需要获得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途,它不仅可用于研究TCR与pMHC的相互作用,也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地,可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞,另外,可溶性TCR还可与其他分子(如,抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞,从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。本发明也获得了对MAGE-A1抗原短肽具有特异性的可溶性TCR。
为获得可溶性TCR,一方面,本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。例如,取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基来形成二硫键。引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是:TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77;TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17;TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59;TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15;TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54;TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19;或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。即半胱氨酸残基取代了上述α与β链恒定域中任一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多50个、或最多30个、或最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸,以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失天然二硫键的目的,也可通过将形成天然二硫键的半胱氨酸残基突变为另一氨基酸来达到上述目的。
如上所述,本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二硫键。应注意,恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键,本发明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。
为获得可溶性TCR,另一方面,本发明TCR还包括在其疏水芯区域发生突变的TCR,这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明可溶性TCR的稳定性提高的突变,如在公开号为WO2014/206304的专利文献中所述。这样的TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变:(α和/或β链)可变区氨基酸第11,13,19,21,53,76,89,91,94位,和/或α链J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3,5,7位,和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒数第2,4,6位,其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息***(IMGT)中列出的位置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息***,并可根据该数据库得到不同TCR的氨基酸残基在IMGT中的位置编号。
本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的稳定性可溶单链TCR。应注意,本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。如在本发明实施例4中构建的单链可溶性TCR,其α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:32,编码的核苷酸序列为SEQ ID NO:33;β链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO:34,编码的核苷酸序列为SEQ ID NO:35。
另外,对于稳定性而言,专利文献201510260322.4还公开了在TCR的α链可变区与β链恒定区之间引入人工链间二硫键能够使TCR的稳定性显著提高。因此,本发明的高亲和力TCR的α链可变区与β链恒定区之间还可以含有人工链间二硫键。具体地,在所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了:TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸;TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸;TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸;或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。优选地,这样的TCR可以包含(ⅰ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链,和(ⅱ)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链,其中(ⅰ)和(ⅱ)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域,α链与β链形成异质二聚体。更优选地,这样的TCR可以包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域,但其不包含α链恒定域,所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物,如可以用p53的四聚结构域来产生四聚体,或多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞,也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。
本发明的TCR可以单独使用,也可与偶联物以共价或其他方式结合,优选以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的,其中所述TCR用于检测呈递KVLEYVIKV-HLA A0201复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素(Koppe等,2005,癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24,539);2.生物毒(Chaudhary等,1989,自然(Nature)339,394;Epel等,2002,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51,565);3.细胞因子如IL-2等(Gillies等,1992,美国国家科学院院刊(PNAS)89,1428;Card等,2004,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53,345;Halin等,2003,癌症研究(Cancer Research)63,3202);4.抗体Fc片段(Mosquera等,2005,免疫学杂志(The Journal Of Immunology)174,4381);5.抗体scFv片段(Zhu等,1995,癌症国际期刊(International Journal of Cancer)62,319);6.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等,2005,癌症通信(Cancer letters)239,36;Huang等,2006,美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128,2115);7.病毒颗粒(Peng等,2004,基因治疗(Gene therapy)11,1234);8.脂质体(Mamot等,2005,癌症研究(Cancer research)65,11631);9.纳米磁粒;10.前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL));11.化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
另外,本发明的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如,有研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此,本发明TCR可包含人可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。因此,在其用于过继性T细胞治疗时应当有调节方案来进行免疫抑制,以允许表达鼠科的T细胞的植入。
应理解,本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示,氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下:Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
核酸分子
本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子,所述部分可以是一个或多个CDR,α和/或β链的可变域,以及α链和/或β链。
编码本发明第一方面TCR分子α链CDR区的核苷酸序列如下:
αCDR1-tccagcaatttttatgcc (SEQ ID NO:16)
αCDR2-atgactttaaatggggatgaa (SEQ ID NO:17)
αCDR3-gccttcccttcaggaggaggtgctgacggactcacc(SEQ ID NO:18)
编码本发明第一方面TCR分子β链CDR区的核苷酸序列如下:
βCDR1-tctggagacctctct (SEQ ID NO:19)
βCDR2-tattataatggagaagag (SEQ ID NO:20)
βCDR3-gccagcagcgtagaaggctacccctcctacgagcagtac(SEQ ID NO:21)
因此,编码本发明TCRα链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:16、SEQID NO:17和SEQ ID NO:18,和/或编码本发明TCRβ链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21。
本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的,该核酸分子可以是RNA或DNA,并且可以包含或不包含内含子。优选地,本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽,例如编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:2和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQID NO:6。或者,编码本发明TCRα链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:33和/或编码本发明TCRβ链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO:35。更优选地,本发明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:8。或者,本发明核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:31。
应理解,由于遗传密码的简并,不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此,编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以本发明中的其中一个例子来说明,“简并的变异体”是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白序列,但与SEQ ID NO:2的序列有差别的核酸序列。
核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的,可以根据细胞的类型,改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。
载体
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体,包括表达载体,即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
病毒递送***包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
优选地,载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中,例如T细胞中,使得该细胞表达MAGE-A1抗原特异性的TCR。理想的情况下,该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。
细胞
本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自:原核细胞和真核细胞,例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞等。
另外,本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞,特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞,或者可以是从受试者中分离的混合细胞群,诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如,该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC),可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。一般地,该细胞可以用抗体(如,抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化,以便使它们能够更容易接受转染,例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。
备选地,本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞,如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR,因为干细胞表面不表达CD3分子。然而,当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时,CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。
有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如,Robbins等.,(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如,Rosenberg等.,(2008)Nat RevCancer8(4):299-308)。
MAGE-A1抗原相关疾病
本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与MAGE-A1相关疾病的方法,其包括过继性转移MAGE-A1特异性T细胞至该受试者的步骤。该MAGE-A1特异性T细胞可识别KVLEYVIKV-HLA A0201复合物。
本发明的MAGE-A1特异性的T细胞可用于治疗任何呈递MAGE-A1抗原短肽KVLEYVIKV-HLA A0201复合物的MAGE-A1相关疾病。包括但不限于肿瘤,如黑色素瘤,以及其他实体肿瘤如胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、***癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等。
治疗方法
可以通过分离患有与MAGE-A1抗原相关疾病的病人或志愿者的T细胞,并将本发明的TCR导入上述T细胞中,随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。因此,本发明提供了一种治疗MAGE-A1相关疾病的方法,包括将分离的表达本发明TCR的T细胞,优选地,该T细胞来源于病人本身,输入到病人体内。一般地,包括(1)分离病人的T细胞,(2)用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞,(3)将基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明的TCR能够与MAGE-A1抗原短肽复合物KVLEYVIKV-HLA A0201结合,同时转导了本发明TCR的细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用。
下面的具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如(Sambrook和Russell等人,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例9 转导本发明TCR的细胞的杀伤实验
本实施例通过非放射性细胞毒性实验,测定LDH的释放,从而验证转导本发明TCR的细胞的杀伤功能。该试验是51Cr释放细胞毒性试验的比色替代试验,定量测定细胞裂解后释放的乳酸脱氢酶(LDH)。采用30分钟偶联的酶反应来检测释放在培养基中的LDH,在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。可以用标准的96孔读板计收集490nm可见光吸光值数据。
本领域技术人员熟知利用LDH的释放实验检测细胞功能的方法。本实施例效应细胞(T细胞)是实施例7中经流式细胞术分析表达本发明MAGE A1抗原短肽特异性TCR的CD8+T细胞,靶细胞系为293T和U266B1。根据nanostring结果,其中,U266B1表达MAGE A1抗原,293T基本不表达MAGE A1抗原,以此作为对照。
首先准备LDH平板。实验第1天,按以下顺序将试验的各个组分加入平板:培养基调整效应细胞至2X106个细胞/毫升,培养基调整各靶细胞系至5X105个细胞/毫升。混合均匀后取100μL靶细胞系5X105个细胞/毫升(即50,000个细胞/孔)、100μL效应细胞2X106个细胞/毫升(即200,000个细胞/孔)加入对应孔中,并设置三个复孔。同时设置效应细胞自发孔,靶细胞自发孔,靶细胞最大孔,体积校正对照孔及培养基背景对照孔。温育过夜(37℃,5%CO2)。实验第2天,检测显色,终止反应后用酶标仪(Bioteck)在490nm记录吸光值。实验结果如图15所示,图中曲线NC-293T为未转染本发明TCR的效应细胞对293T细胞系的反应;曲线NC-U266B1为未转染本发明TCR的效应细胞对U266B1细胞系的反应;曲线TCR-293T为转染本发明TCR的效应细胞对293T细胞系的反应;曲线TCR-U266B1为转染本发明TCR的效应细胞对U266B1细胞系的反应。从结果可以看出,转导本发明TCR的效应细胞对表达相关抗原的靶细胞具有杀伤作用,而对不表达相关抗原的靶细胞基本没有杀伤作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州市香雪制药股份有限公司
<120> 识别MAGE-A1抗原短肽的T细胞受体
<130> P2017-0068
<150> CN201610190650.6
<151> 2016-03-29
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRα链可变域
<400> 1
Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala
20 25 30
Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe
35 40 45
Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala
50 55 60
Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln
100 105 110
Pro Tyr
<210> 2
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRα链可变域
<400> 2
atactgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatgttc aggagggaga cagcaccaat 60
ttcacctgca gcttcccttc cagcaatttt tatgccttac actggtacag atgggaaact 120
gcaaaaagcc ccgaggcctt gtttgtaatg actttaaatg gggatgaaaa gaagaaagga 180
cgaataagtg ccactcttaa taccaaggag ggttacagct atttgtacat caaaggatcc 240
cagcctgaag actcagccac atacctctgt gccttccctt caggaggagg tgctgacgga 300
ctcacctttg gcaaagggac tcatctaatc atccagccct at 342
<210> 3
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRα链
<400> 3
Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala
20 25 30
Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe
35 40 45
Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala
50 55 60
Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln
100 105 110
Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
195 200 205
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
210 215 220
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
225 230 235 240
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 4
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRα链
<400> 4
atactgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatgttc aggagggaga cagcaccaat 60
ttcacctgca gcttcccttc cagcaatttt tatgccttac actggtacag atgggaaact 120
gcaaaaagcc ccgaggcctt gtttgtaatg actttaaatg gggatgaaaa gaagaaagga 180
cgaataagtg ccactcttaa taccaaggag ggttacagct atttgtacat caaaggatcc 240
cagcctgaag actcagccac atacctctgt gccttccctt caggaggagg tgctgacgga 300
ctcacctttg gcaaagggac tcatctaatc atccagccct atatccagaa ccctgaccct 360
gccgtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 420
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 480
actgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 540
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 600
ttccccagcc cagaaagttc ctgtgatgtc aagctggtcg agaaaagctt tgaaacagat 660
acgaacctaa actttcaaaa cctgtcagtg attgggttcc gaatcctcct cctgaaagtg 720
gccgggttta atctgctcat gacgctgcgg ctgtggtcca gc 762
<210> 5
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRβ链可变域
<400> 5
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
35 40 45
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser
65 70 75 80
Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu
85 90 95
Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr
<210> 6
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRβ链可变域
<400> 6
gattctggag tcacacaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60
ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120
cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180
cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240
ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcgtagaagg ctacccctcc 300
tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca ca 342
<210> 7
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRβ链
<400> 7
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
35 40 45
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser
65 70 75 80
Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu
85 90 95
Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro
165 170 175
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
180 185 190
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
195 200 205
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
210 215 220
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
225 230 235 240
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
245 250 255
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
260 265 270
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
275 280 285
Lys Asp Ser Arg Gly
290
<210> 8
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCRβ链
<400> 8
gattctggag tcacacaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60
ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120
cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180
cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240
ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcgtagaagg ctacccctcc 300
tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg 360
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420
gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540
cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660
gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720
ggtagagcag actgtggctt cacctccgag tcttaccagc aaggggtcct gtctgccacc 780
atcctctatg agatcttgct agggaaggcc accttgtatg ccgtgctggt cagtgccctc 840
gtgctgatgg ccatggtcaa gagaaaggat tccagaggc 879
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗原短肽
<400> 9
Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α CDR1
<400> 10
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α CDR2
<400> 11
Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> α CDR3
<400> 12
Ala Phe Pro Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr
1 5 10
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β CDR1
<400> 13
Ser Gly Asp Leu Ser
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β CDR2
<400> 14
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu
1 5
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> β CDR3
<400> 15
Ala Ser Ser Val Glu Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α CDR1
<400> 16
tccagcaatt tttatgcc 18
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α CDR2
<400> 17
atgactttaa atggggatga a 21
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> α CDR3
<400> 18
gccttccctt caggaggagg tgctgacgga ctcacc 36
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β CDR1
<400> 19
tctggagacc tctct 15
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β CDR2
<400> 20
tattataatg gagaagag 18
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β CDR3
<400> 21
gccagcagcg tagaaggcta cccctcctac gagcagtac 39
<210> 22
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有前导序列的TCRα链
<400> 22
Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His
1 5 10 15
Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser
20 25 30
Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys
50 55 60
Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys
100 105 110
Ala Phe Pro Ser Gly Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly
115 120 125
Thr His Leu Ile Ile Gln Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 23
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有前导序列的TCRα链
<400> 23
atggagaaga atcctttggc agccccatta ctaatcctct ggtttcatct tgactgcgtg 60
agcagcatac tgaacgtgga acaaagtcct cagtcactgc atgttcagga gggagacagc 120
accaatttca cctgcagctt cccttccagc aatttttatg ccttacactg gtacagatgg 180
gaaactgcaa aaagccccga ggccttgttt gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240
aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300
ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct tcccttcagg aggaggtgct 360
gacggactca cctttggcaa agggactcat ctaatcatcc agccctatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780
aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagc 828
<210> 24
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有前导序列的TCRβ链
<400> 24
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Val Glu Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 25
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有前导序列的TCRβ链
<400> 25
atgggcttca ggctcctctg ctgtgtggcc ttttgtctcc tgggagcagg cccagtggat 60
tctggagtca cacaaacccc aaagcacctg atcacagcaa ctggacagcg agtgacgctg 120
agatgctccc ctaggtctgg agacctctct gtgtactggt accaacagag cctggaccag 180
ggcctccagt tcctcattca gtattataat ggagaagaga gagcaaaagg aaacattctt 240
gaacgattct ccgcacaaca gttccctgac ttgcactctg aactaaacct gagctctctg 300
gagctggggg actcagcttt gtatttctgt gccagcagcg tagaaggcta cccctcctac 360
gagcagtact tcgggccggg caccaggctc acggtcacag aggacctgaa aaacgtgttc 420
ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480
acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540
aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600
gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660
cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720
gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780
agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840
ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900
ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggc 936
<210> 26
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可溶性TCRα链
<400> 26
Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr Ala
20 25 30
Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu Phe
35 40 45
Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser Ala
50 55 60
Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Gly Ser
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly Gly
85 90 95
Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Ile Ile Gln
100 105 110
Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
115 120 125
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
130 135 140
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
145 150 155 160
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
165 170 175
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
180 185 190
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 27
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可溶性TCRα链
<400> 27
attctgaacg tggaacaaag tcctcagtca ctgcatgttc aggagggaga cagcaccaat 60
ttcacctgca gcttcccttc cagcaatttt tatgccttac actggtacag atgggaaact 120
gcaaaaagcc ccgaggcctt gtttgtaatg actttaaatg gggatgaaaa gaagaaagga 180
cgaataagtg ccactcttaa taccaaggag ggttacagct atttgtacat caaaggatcc 240
cagcctgaag actcagccac atacctctgt gccttccctt caggaggagg tgctgacgga 300
ctcacctttg gcaaagggac tcatctaatc atccagccct atatccagaa ccctgaccct 360
gccgtgtacc agctgagaga ctctaagtcg agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 420
tttgattctc aaacaaatgt gtcacaaagt aaggattctg atgtgtatat cacagacaaa 480
tgtgtgctag acatgaggtc tatggacttc aagagcaaca gtgctgtggc ctggagcaac 540
aaatctgact ttgcatgtgc aaacgccttc aacaacagca ttattccaga agacaccttc 600
ttccccagcc cagaaagttc c 621
<210> 28
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可溶性TCRβ链
<400> 28
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
35 40 45
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser
65 70 75 80
Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu
85 90 95
Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro
165 170 175
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser
180 185 190
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe
195 200 205
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
210 215 220
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
225 230 235 240
Gly Arg Ala Asp
<210> 29
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可溶性TCRβ链
<400> 29
gatagcggcg tgacccaaac cccaaagcac ctgatcacag caactggaca gcgagtgacg 60
ctgagatgct cccctaggtc tggagacctc tctgtgtact ggtaccaaca gagcctggac 120
cagggcctcc agttcctcat tcagtattat aatggagaag agagagcaaa aggaaacatt 180
cttgaacgat tctccgcaca acagttccct gacttgcact ctgaactaaa cctgagctct 240
ctggagctgg gggactcagc tttgtatttc tgtgccagca gcgtagaagg ctacccctcc 300
tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtg 360
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420
gccacactgg tgtgcctggc caccggtttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc tgcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540
cccgccctca atgactccag atacgctctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600
tggcaggacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660
gacgagtgga cccaggatag ggccaaaccc gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720
ggtagagcag ac 732
<210> 30
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCR
<400> 30
Ala Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Asp Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu
35 40 45
Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser
50 55 60
Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Arg
65 70 75 80
Val Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Met Ile
100 105 110
Gln Pro Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ser Gly Val Thr Gln
130 135 140
Thr Pro Lys His Leu Ser Val Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg
145 150 155 160
Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser
165 170 175
Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu
180 185 190
Arg Ala Lys Gly Asn Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro
195 200 205
Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Ile Ser Ser Val Glu Pro Gly Asp Ser
210 215 220
Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu
225 230 235 240
Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 31
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCR
<400> 31
gctattctta atgttgaaca gagcccgcaa tctctgcatg tgcaggaagg tgatagtgtt 60
aacatcacct gctcctttcc gagctctaat ttctatgcgc tgcactggta ccgctgggaa 120
accgcgaaaa gcccggaagc cctgtttgtc atgacgctga acggtgacga gaaaaagaaa 180
ggccgcattt cagccaccct gaatacgaaa gaaggttatt cgtacctgta tatcaaacgt 240
gttcagccgg aagatagcgc aacctatctg tgtgcttttc cgtctggcgg tggcgcagac 300
ggtctgacct tcggtaaagg cacgcatctg atgattcaac cgggtggcgg ttcagaaggc 360
ggtggctcgg aaggtggcgg tagcgaaggc ggtggctctg aaggtggcac cggtgattca 420
ggcgtgaccc agacgccgaa acacctgtct gtcgcgaccg gtcaacgtgt gacgctgcgt 480
tgcagtccgc gttccggtga tctgtcagtt tactggtatc agcaatcgct ggaccagggc 540
ctgcaattcc tgattcagta ttacaacggt gaagaacgcg caaaaggcaa tatcccggaa 600
cgttttagtg ctcagcaatt cccggatctg cattccgaac tgaatatcag ttccgttgaa 660
ccgggtgaca gtgcgctgta tttttgtgcc tcatcggtcg aaggctaccc gagctatgaa 720
cagtacttcg gtccgggcac ccgtctgacg gttctg 756
<210> 32
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCRα链
<400> 32
Ala Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser Leu His Val Gln Glu
1 5 10 15
Gly Asp Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Phe Pro Ser Ser Asn Phe Tyr
20 25 30
Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys Ser Pro Glu Ala Leu
35 40 45
Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys Lys Gly Arg Ile Ser
50 55 60
Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ile Lys Arg
65 70 75 80
Val Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Phe Pro Ser Gly
85 90 95
Gly Gly Ala Asp Gly Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr His Leu Met Ile
100 105 110
Gln Pro
<210> 33
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCRα链
<400> 33
gctattctta atgttgaaca gagcccgcaa tctctgcatg tgcaggaagg tgatagtgtt 60
aacatcacct gctcctttcc gagctctaat ttctatgcgc tgcactggta ccgctgggaa 120
accgcgaaaa gcccggaagc cctgtttgtc atgacgctga acggtgacga gaaaaagaaa 180
ggccgcattt cagccaccct gaatacgaaa gaaggttatt cgtacctgta tatcaaacgt 240
gttcagccgg aagatagcgc aacctatctg tgtgcttttc cgtctggcgg tggcgcagac 300
ggtctgacct tcggtaaagg cacgcatctg atgattcaac cg 342
<210> 34
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCRβ链
<400> 34
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
35 40 45
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Pro Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Ile Ser Ser
65 70 75 80
Val Glu Pro Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu
85 90 95
Gly Tyr Pro Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Leu
<210> 35
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCRβ链
<400> 35
gattcaggcg tgacccagac gccgaaacac ctgtctgtcg cgaccggtca acgtgtgacg 60
ctgcgttgca gtccgcgttc cggtgatctg tcagtttact ggtatcagca atcgctggac 120
cagggcctgc aattcctgat tcagtattac aacggtgaag aacgcgcaaa aggcaatatc 180
ccggaacgtt ttagtgctca gcaattcccg gatctgcatt ccgaactgaa tatcagttcc 240
gttgaaccgg gtgacagtgc gctgtatttt tgtgcctcat cggtcgaagg ctacccgagc 300
tatgaacagt acttcggtcc gggcacccgt ctgacggttc tg 342
<210> 36
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCR连接序列
<400> 36
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly
20
<210> 37
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单链TCR连接序列
<400> 37
ggtggcggtt cagaaggcgg tggctcggaa ggtggcggta gcgaaggcgg tggctctgaa 60
ggtggcaccg gt 72