CN113831331A - 用于多模态成像及诊疗的近红外二区聚集诱导发光分子及其应用 - Google Patents

用于多模态成像及诊疗的近红外二区聚集诱导发光分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及有机荧光材料的设计，具体地，本发明涉及了一类具有聚合诱导发光特性的分子，其具有明亮的近红外二区发射、高活性氧产生能力和出色的光热转换效率。这类聚合诱导发光分子可以充分利用其激发态能量，在辐射跃迁和非辐射跃迁之间保持完美的平衡，以满足近红外二区荧光成像(FLI)/光声成像(PAI)/光热成像(PTI)三模态成像，并且能够实现光动力疗法(PDT)/光热疗法(PTT)的抗肿瘤协同疗法。

Description

用于多模态成像及诊疗的近红外二区聚集诱导发光分子及其 应用
技术领域
本发明涉及有机荧光材料的开发，具体地，涉及了一类具有聚合诱导发光特性的分子，及其用于近红外二区荧光成像(FLI)/光声成像(PAI)/光热成像(PTI)多模态成像的用途，以及通过多模态成像结合光动力疗法(PDT)/光热疗法(PTT)的抗肿瘤用途。
背景技术
癌症作为近几十年来的主要死亡原因之一，由于其低存活率和在世界范围的流行，一直受到密切关注。传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗、化学疗法、靶向治疗以及以上几种方法的结合，这些传统的肿瘤治疗方法或多或少会带来一系列不可避免的副作用。因此，寻找对癌症患者造成最小损害和非侵入性的疗法是十分必要的。在这种背景下，光诱导诊疗学已经成为一种流行的前沿技术。光诱导诊疗学将成像和治疗相结合以同时实现对肿瘤位置的识别和对肿瘤的特异性消融，对于提高肿瘤诊疗的时空分辨率和高精度是十分有利的。其中，光诱导的多模态诊疗是一种公认更为先进的策略，它通过组合多种成像模式和/或治疗模式来促进疾病的精确诊断和有效治疗。由于每种成像方式都有其自身的优缺点，因此多模态诊疗平台能够克服单模态的局限性，并提供互补的成像信息和更好的治疗效果。但是，这样的多模态诊疗平台远非理想，有待探索。
至今已经有各种各样的光诊疗剂被开发出来，其中有机荧光小分子由于具有更好的生物相容性和生物降解性、更小的细胞毒性和体内毒性、以及易于修饰的结构和光学性质等特点而脱颖而出。对于有些具有平面结构的传统荧光分子，它们具有很多缺点，例如聚集诱导猝灭(ACQ)效应、小的斯托克斯位移、差的光稳定性等，这些缺点极大地妨碍了它们的实际使用。直到2001年唐本忠等人首次提出聚集诱导发光(AIE)，聚集诱导猝灭的问题才得到了完美解决。与聚集诱导淬灭荧光分子相反，具有聚集诱导发光特性的荧光分子在溶液中几乎不发光，但聚集时由于分子内运动受限(RIM)原理而会产生强发射。聚集诱导发光分子具有高亮度、较大的斯托克斯位移和高抗光漂白性等优势。许多聚集诱导发光分子构造在具有足够多分子转子的螺旋桨状结构上，这些分子转子可以在溶液状态下耗散能量。聚集诱导发光分子的自由旋转和振动会促进热量和光热转化声波的产生。出于这个原因，当聚集诱导发光分子以单分子形式存在时，它们被认为适用于光声成像(PAI)、光热成像(PTI)和光热疗法(PTT)。而且，聚集诱导发光分子已被证明是出色的活性氧(ROS)产生剂，尤其是在聚集时，因此可以应用于光动力疗法(PDT)。总结来说，聚集诱导发光分子已经成为能够满足多模态成像指导治疗的全能诊疗材料。尽管如此，在近红外二区窗口中具有长发射波长的聚集诱导发光分子仍然很少。考虑到近红外二区荧光成像的优势，包括更深的穿透力、较小的组织散射和自发荧光、以及出色的成像分辨率，期望的基于聚集诱导发光分子的诊疗***仍有待探索。
发明内容
如上所述，本领域期望开发一种聚集诱导发光分子，其在近红外二区中具有较高的发光强度，适合用于包括近红外二区荧光成像(FLI)、光声成像(PAI)和光热成像(PTI)的多模态成像，能够实现肿瘤消融，并且能够将多模态成像与光热疗法和/或光动力疗法结合用于非侵入性的抗肿瘤治疗。
基于此，本发明的发明人通过合理的分子设计合成了一系列基于吖啶及其鎓盐和喹啉及其鎓盐的新型聚集诱导发光分子，这些聚集诱导发光分子由强电子给体(D)和受体(A)部分组成，以最大程度地使吸收光谱和发射光谱红移。本发明的分子中的三苯胺片段不仅能够用作电子给体，还通过其非平面结构扩展了分子间距离，确保了聚集体中的强发射。同时，三苯胺中苯环的自由旋转有助于分子在溶液中的非辐射弛豫，并使得这些分子具有潜在的聚集诱导发光活性。由此，本发明人发现，所设计的新型聚集诱导发光分子能够在辐射衰减和非辐射衰减之间保持完美平衡，使得其在近红外二区发射、活性氧产生能力和光热转换效率方面具有最佳性能，能够用于近红外二区荧光成像(FLI)、光声成像(PAI)和光热成像(PTI)的多模态成像，是一种满足多模态成像引导治疗的全能诊疗材料，被证明是理想的多模态诊疗一体化平台。
因此，在本发明的第一方面，提供了由下式(I)表示的化合物：
Figure BDA0003104321290000031
其中，n为0-5的整数；
R1是分子转子，选自
Figure BDA0003104321290000032
X是键或共轭部分；
R2选自
Figure BDA0003104321290000033
或其鎓盐
Figure BDA0003104321290000034
或其鎓盐
Figure BDA0003104321290000035
R3和R4为苯环任意位置的取代基，各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5和R6各自独立地选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
在本发明的第二方面，提供了一种聚集诱导发光分子，其包括本发明第一方面的化合物。
在本发明的第三方面，提供了一种用于成像的探针，其包括：本发明第一方面的化合物、或者本发明第二方面的聚集诱导发光分子；其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。
在本发明的第四方面，提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括本发明第一方面的化合物。
在本发明的第五方面，提供了一种光诊疗剂，所述光诊疗剂包括：本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、或者本发明第四方面的抗肿瘤药物。
在本发明的第六方面，提供了一种进行体内生物成像的方法，所述方法包括：将本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或本发明第三方面的探针一次地或者多次地施用于有此需要的受试者；其中，所述体内生物成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。
在本发明的第七方面，提供了一种用于成像的试剂盒，所述试剂盒包括：
本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或本发明第三方面的探针；以及
用于指导成像的说明书；
其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。
在本发明的第八方面，提供了本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或本发明第三方面的探针在制备抗肿瘤药物中的用途。
在本发明的第九方面，提供了一种多模态诊疗***，所述***包括：
a.本发明第一方面的化合物、本发明第二所述的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂；
b.用于激光照射的激光源；以及
c.成像***，其中所述成像***包括荧光成像***、光声成像***、光热成像***、或其任意组合；
其中，在所述激光源的照射下，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂能够通过所述成像***识别肿瘤所在位置和监控肿瘤消融，并且能够通过光热疗法和/或光动力疗法对抗肿瘤。
在本发明的第十方面，提供了一种***患者的方法，所述方法包括：将本发明第一方面的化合物、本发明第二所述的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂一次地或者多次地施用于所述肿瘤患者；并且
对所述肿瘤患者进行一次或者多次激光照射。
在本发明的第十一方面，提供了本发明第一方面的化合物、本发明第二所述的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂，其用于***。
本发明的有益之处在于：
本发明提供了一种具有聚集诱导发光性质的化合物，其具有高的发光强度(尤其是强的近红外二区荧光)、较大的斯托克斯位移和高抗光漂白性等优势，兼具生物相容性和安全性，能够用于包括人在内的受试者体内；
本发明的化合物与激光照射结合使用，可以作为荧光成像(尤其是近红外二区荧光成像)、光声成像(PAI)和光热成像(PTI)的多模态成像剂，克服单模态成像各自的不足，提供互补的成像信息，实现对癌症的诊断、识别和监控，提高癌症诊断的准确性，为协同的光动力疗法和光热疗法提供指导；
本发明的化合物已被证明是出色的活性氧(ROS)产生剂，尤其是在聚集时，因此可以应用于光动力疗法(PDT)。另外，本发明的化合物还可以产生热量，因此可以应用于光热疗法中。也就是说，本发明的化合物本身也可以作为光动力疗法和光热疗法的协同的抗肿瘤剂，抑制原发性肿瘤的进展和肿瘤转移。因此，本发明的化合物、聚集诱导发光分子、探针、抗肿瘤药物、光诊疗剂以及多模态诊疗***提供了癌症治疗的多模态诊疗平台，能够促进对肿瘤的精确诊断和有效治疗。
附图说明
本发明附图与本发明的实施例一起提供了对本发明的进一步解释，并且构成说明书的一部分。显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施方案，而并不构成对本发明的限制。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1分别示出了A)(E)-9-(4-(二苯氨基)苯乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TAM)、(E)-9-(2-(2-(5-(4-(二苯氨基)苯基)噻吩-2-基)乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TSAM)和(E)-9-(2-(5'-(4-(二苯基氨基)苯基)-[2,2'-并噻吩]-5-基)乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TSSAM)的化学结构和合成路线；B)固态薄膜形式的TAM、TSAM和TSSAM的吸收光谱；C)TAM、TSAM和TSSAM聚集体的荧光光谱(浓度为10μM)；以及D)TAM、TSAM和TSSAM在含有不同甲苯含量(fT)的二甲亚砜(DMSO)/甲苯混合溶剂中的光致发光强度(I/I0)的变化情况(浓度为10μM)。
图2分别示出了A)TAM、B)TSAM和C)TSSAM在含有不同甲苯含量(fT)的DMSO/甲苯混合溶液中的光致发光光谱图。
图3示出了使用动态光散射(DLS)方法测量的水性溶液中的TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒的尺寸分布。
图4示出了相同浓度(0.1mM)的TAM、TSAM和TSSAM的光致发光光谱，其中A)为TAM纳米颗粒和TAM的DMSO溶液的光致发光光谱，B)为TSAM纳米颗粒和TSAM的DMSO溶液的光致发光光谱，以及C)为TSSAM纳米颗粒和TSSAM的DMSO溶液的光致发光光谱。
图5示出了TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒在白光照射下的活性氧产生情况，其中使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为指示剂。
图6示出了TAM、TSAM和TSSAM的光热效应，其中：A)示出了TAM、TSAM和TSSAM的DMSO溶液(浓度200μM)在660nm激光照射下(激光强度为0.3W cm-2)的光热效应；B)示出了TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒(浓度200μM)在660nm激光照射下(激光强度为0.3W cm-2)的光热效应；C)示出了不同功率密度(激光强度)下的TSSAM纳米颗粒的光热效应；以及D)示出了在660nm激光照射(激光强度为0.3W cm-2)下不同浓度的TSSAM纳米颗粒(200μL)的光热效应。
图7示出了分别用Hoest33342、LysoTracker Green和TSSAM纳米颗粒染色的4T1细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像和合并的图像。
图8示出了A)通过CCK-8分析试剂盒检测的在不同浓度的TSSAM纳米颗粒作用下的4T1细胞存活率；B)光照条件下，使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为指示剂的4T1细胞内的活性氧产生；C)使用荧光素二乙酸盐(FDA)和碘化丙啶(PI)分别作为活细胞和死细胞的指示剂，在不同处理条件下(磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸盐缓冲液+激光、TSSAM纳米颗粒、TSSAM纳米颗粒+激光)的4T1细胞的存活/死亡分析，其中红色和绿色荧光分别表示活细胞和死细胞。
图9示出了A)瘤内注射TSSAM纳米颗粒(1mM，20μL)后对4T1荷瘤小鼠进行的近红外二区荧光成像(600nm激发，1000nm LP)和光声成像；B)瘤内注射TSSAM纳米颗粒12小时后对4T1荷瘤小鼠分别进行2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟的激光照射(660nm，0.3W cm-2)的红外热成像；C)左图：分别接受不同处理(PBS、PBS+激光照射、TSSAM纳米颗粒、以及TSSAM纳米颗粒(1mM，20μL)+激光照射)后，小鼠(n＝6)的异种移植4T1肿瘤的生长曲线，其中，***表示p＜0.001；右图：从经过左图所述处理的小鼠中取出的4T1肿瘤照片；D)经过不同处理后的肿瘤组织的苏木精伊红(H&E)、TUNEL、CD31染色分析结果；以及E)在经过如图C所示的处理后，异种移植的4T1荷瘤小鼠的体重曲线。
图10示出了分别经过PBS、PBS+激光照射、TSSAM纳米颗粒、以及TSSAM纳米颗粒+激光照射处理15天后的4T1荷瘤小鼠的代表性图像。
图11示出了分别经PBS、PBS+激光照射、TSSAM纳米颗粒、以及TSSAM纳米颗粒+激光照射处理后15天的4T1荷瘤小鼠的A)肝功能标志物和B)肾功能标志物的血液生化测试。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
如本文所使用的，术语“λex”是指激发波长。
如本文所使用的，短语“聚集引起猝灭”或“ACQ”是指π-共轭荧光团的聚集显著降低荧光团的荧光强度的现象。聚集体形成会导致荧光团的光发射“猝灭”。
如本文所使用的，短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指化合物以无定形或结晶(固体)状态聚集时表现出显著增强的光发射而在稀溶液中表现出弱发射或几乎无发射的现象。
如本文所使用的，术语“发光强度”是指通常由荧光光谱仪或荧光显微镜测量获得的荧光/磷光的大小；本文所使用的术语“荧光团”或“荧光分子”是指表现出荧光的分子；本文所使用的术语“发光分子”或“发光团”是指表现出发光的分子；本文所使用的术语“AIEgen”或者“聚集诱导发光分子”是指表现出聚集诱导发光(AIE)特征的分子。
如本文所使用的，术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴及碘。
在本文中，当某个基团用表述“Cm-Cn”进行限定时，表示具有范围为m至n中的任何整数个碳原子的该基团。例如，“C2-C5”烯基表示乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基。
如本文所使用的，术语“烷基”是指直链或支链的饱和烃基。烷基的实例包括C1-C6烷基，例如，甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如正丙基及异丙基)、丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如正戊基、异戊基、戊基)、己基等。在本发明中，烷基可具有1至40个碳原子(即C1-C40烷基)，例如1至30个碳原子(即C1-C30烷基)。在一些实施方案中，烷基可具有1至6个碳原子(C1-C6烷基)，并且可被称为“低级烷基”。低级烷基的实例包括甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)及丁基(例如正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在一些实施方案中，烷基可以如本文所述地被取代。烷基通常不被另一烷基、烯基或炔基取代。
如本文所使用的，术语“不饱和烷基”是指具有一个或者多个碳碳双键和/或碳碳三键的直链或者直链烷基，具体地可以包括烯基和炔基。
如本文所使用的，术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各实施方案中，烯基可具有2至40个碳原子(即C2-C40烯基)，例如2至20个碳原子(即C2-C20烯基)。在另一些实施方案中，所述烯基可以为C2-C6烯基，例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基。在一些实施方案中，烯基可以如本文所述地被取代。烯基通常不被另一个烯基、烷基或炔基取代。
如本文所使用的，术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烷基。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、丁二炔基、戊二炔基、己二炔基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(例如在2-丁烯中)或末端的(例如在1-丁烯中)。在各实施方案中，炔基可具有2至40个碳原子(即C2-C40炔基)，例如2至20个碳原子(即C2-C20炔基)。在另一些实施方案中，所述炔基可以为C2-C6炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基。在一些实施方案中，炔基可以如本文所述地被取代。炔基通常不被另一个炔基、烷基或炔基取代。
如本文所使用的，“杂原子”是指除碳或氢以外的任意其它元素的原子，包括(例如)氮、氧、硅、硫、磷及硒。
如本文所使用的，“芳基”是指芳香族单环烃环体系或多环体系，在所述多环体系中，两个或更多个芳香族烃环稠合在一起(例如具有一个共用键)或至少一个芳香族单环烃环与一个或多个环烷基环和/或环杂烷基环稠合。芳基在其环体系中可具有6至24个碳原子(例如C6-C24芳基)，其可包含更多个稠合环。在一些实施方案中，多环芳基可具有8至24个碳原子。芳基的任一适合的环位置可共价连接于定义的化学结构。只具有一个或多个芳香族碳环的芳基的例子包括苯基、1-萘基(双环)、2-萘基(双环)、蒽基(三环)、菲基(三环)、并五苯基(五环)等。至少一个芳香族烃环与一个或多个环烷基环和/或环杂烷基环稠合的多环体系的例子包括环戊烷的苯衍生物(即茚基，其为5,6-双环烷基/芳香族环体系)、环己烷的苯衍生物(即四氢萘基，其为6,6-双环烷基/芳香族环体系)、咪唑啉的苯衍生物(即苯并咪唑啉基，其为5,6-双环环杂烷基/芳香族环体系)及吡喃的苯衍生物(即苯并吡喃基，其为6,6-双环环杂烷基/芳香族环体系)。芳基的其他例子包括苯并二恶烷基、苯并二氧基(benzodioxolyl)、苯并二氢吡喃基、吲哚啉基等。在一些实施方案中，芳基可以如本文所述地被取代。在一些实施方案中，芳基可具有一个或多个的卤素取代基，并可被称为“卤芳”基。卤芳基的定义中包括全卤芳基(perhaloaryl)，即芳基中所有的氢原子皆被卤原子取代(例如–C6F5)。在某些实施方案中，芳基由另一芳基取代，并且可被称为双芳基。双芳基的各芳基可以如本文所述地被取代。
如本文所使用的，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)及硒(Se)中的环杂原子的芳香族单环体系或环体系中存在的至少一个环为芳香族的并含有至少一个环杂原子的多环体系。多环杂芳基包括具有两个或更多个稠合在一起的杂芳环的多环杂芳基，以及具有至少一个稠合到一个或多个芳香族碳环、非芳香族碳环和/或非芳香族环杂烷基环的单环杂芳环的多环杂芳基。杂芳基作为整体可具有(例如)5至24个环原子，并含有1至5个环杂原子(即5至20元的杂芳基)。杂芳基可在任一杂原子或碳原子处连接至定义的化学结构，只要能得到稳定的结构即可。通常，杂芳基环不含有O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的实例包括(例如)以下示出的5元或6元的单环及5元至6元双环体系：其中T为O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳烷基)(例如N-苯甲基)、SiH2、SiH(烷基)、Si(烷基)2、SiH(芳烷基)、Si(芳烷基)2或Si(烷基)(芳烷基)。这样的杂芳基环的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、***基、四唑基、吡唑基、咪唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基、异恶唑基、恶唑基、恶二唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、2-甲基喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、苯并***基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并异恶唑基、苯并二唑基、苯并恶唑基、噌啉基、1H-吲唑基、2H-吲唑基、吲哚嗪基、异苯并呋喃基、萘啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、恶唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡啶并嘧啶基、吡啶并吡嗪基、吡啶并哒嗪基、噻吩并噻唑基、噻吩并恶唑基、噻吩并咪唑基等。另外，杂芳基的例子包括4,5,6,7-四氢吲哚基、四氢喹啉基、苯并噻吩并吡啶基、苯并呋喃并吡啶基等。在一些实施方案中，杂芳基可以如本文所述地被取代。
如本文所使用的，“给体”材料是指具有空穴作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米颗粒材料。
如本文所使用的，“受体”材料是指具有电子作为主要电流或电荷载流子的有机材料，例如有机纳米颗粒材料。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在整个申请中，各种实施方案的描述使用“包含”语言。然而，本领域技术人员将理解，在一些特定情况中，实施方案可以替代地使用语言“基本上由……组成”或“由……组成”进行描述。
为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
如上所述，本领域亟需一种能够用于更先进的光引导多模态诊疗的聚集诱导发光分子，以提供对癌症患者造成最小损害和非侵入性的疗法，即，将成像和治疗相结合以同时实现肿瘤位置的识别和对肿瘤的特异性消融的疗法，进而提高肿瘤诊疗的时空分辨率和高精度。
因此，在本发明的第一方面，提供了由下式(I)表示的化合物：
Figure BDA0003104321290000131
其中，n为0-5的整数；
R1是分子转子，选自
Figure BDA0003104321290000132
X是键或共轭部分；
R2选自
Figure BDA0003104321290000133
或其鎓盐
Figure BDA0003104321290000134
或者
Figure BDA0003104321290000135
或其鎓盐
Figure BDA0003104321290000136
R3和R4为苯环任意位置的取代基，各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5和R6各自独立地选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
在本文中，n可以为0、1、2、3、4或5。在一个优选的实施方案中，n为2。
在另一个优选的实施方案中，X为键，例如单键、任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、或-C＝C-。
在本文中，短语“任选取代的”是指后面所列举基团可以被其他取代基取代，也可以不被其他取代基所取代，视情况而定。在本发明中，与X相关的苯基或者杂芳基可以被氢、C1-C4烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基、卤素如氟、氯、溴、碘等所取代，但不限于此。
在又一个优选的实施方案中，R3和R4为N的对位取代基。
对于R3和R4基团，与其相关的C1-C6烷基、C2-C6不饱和烷基可以被C1-C4烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基、卤素如氟、氯、溴、碘等所取代，与其相关的C3-C6环烷基和C3-C6杂环烷基可以被C1-C4烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基、卤素如氟、氯、溴、碘等所取代，与其相关的C6-C10芳基和C5-C10杂芳基可以被C1-C4烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基等所取代，但不限于此。
另外，在本发明中，基团中包含的杂原子可以为氧(O)、硫(S)氮(N)、硅(Si)和/或硒(Se)。例如，所述杂烷基、所述杂环烷基和所述杂芳基可以包含O、S、N、Si和Se中的一个或者多个，如两个、三个、四个、五个等。
在一个具体的实施方案中，所述鎓盐是三氟甲基磺酸盐、六氟磷酸盐、或四氟化硼盐。
在一个优选的实施方案中，所述鎓盐是三氟甲基磺酸盐。
在又一个具体的实施方案中，所述化合物由下式(II)表示：
Figure BDA0003104321290000151
其中，R3和R4各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
在又一个具体的实施方案中，所述化合物由下式(III)-(VI)中任一项表示：
Figure BDA0003104321290000152
Figure BDA0003104321290000153
Figure BDA0003104321290000161
Figure BDA0003104321290000162
其中，X是键或共轭部分；
R3和R4各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
在一个优选的实施方案中，X是键、任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、或-C＝C-。对于此处提及的杂芳基而言，如上所述，其可以包含O、S、N、Si和Se中的一个或者多个，如两个、三个、四个、五个等。
在又一个具体的实施方案中，所述化合物由下式(VII)-(XI)中任一项表示：
Figure BDA0003104321290000171
Figure BDA0003104321290000172
Figure BDA0003104321290000173
Figure BDA0003104321290000174
Figure BDA0003104321290000175
在一个优选的实施方案中，所述化合物其由下式(VII)表示：
Figure BDA0003104321290000181
在进一步具体的实施方案中，所述化合物为式(XII)所示的化合物：
Figure BDA0003104321290000182
其中，n为0-5的整数。
在本文中，n可以为0、1、2、3、4或5。在一个优选的实施方案中，n为2。根据本申请可知，式(XII)所表示的化合物为一种中间体，用于合成在聚集诱导发光分子。
在本发明的第二方面，提供了一种聚集诱导发光分子，其包含本发明第一方面的化合物。
在一个具体的实施方案中，所述聚集诱导发光分子为纳米颗粒形式。在一个优选的实施方案中，所述聚集诱导发光分子是平均尺寸为50-200nm的纳米颗粒。在一个更优选的实施方案中，所述聚集诱导发光分子是平均尺寸为100-150nm的纳米颗粒。在一个最优选的实施方案中，所述聚集诱导发光分子是平均尺寸为154nm的纳米颗粒。
在本发明的第三方面，提供了一种用于成像的探针，其包括：本发明第一方面的化合物、或者本发明第二方面的聚集诱导发光分子；其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。
在一个优选的实施方案中，所述成像是包括荧光成像如近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
在一个优选的实施方案中，所述荧光成像是近红外二区的荧光成像。如本文所使用的，术语“近红外二区”是指900nm至1700nm的近红外区域，简写为NIR-II。
本文中使用的术语“光声成像”(PAI)是近年来发展起来的一种非入侵式和非电离式的新型生物医学成像方法。当激光照射到生物组织时，组织的光吸收域将产生超声信号，这种由光激发产生的超声信号为光声信号。生物组织产生的光声信号携带了该生物组织的光吸收特征信息，通过探测光声信号即能重建出组织中的光吸收分布图像。
本文中使用的术语“光热成像”(PTI)是指利用红外线热成像仪对物体散发出的红外线进行感光，光热成像通过检测物体表面的热辐射的红外线信号，将该信号转换成图像并显示出温度值。
在一个具体的实施方案中，所述探针为纳米颗粒形式。在一个优选的实施方案中，所述探针是平均尺寸为50-200nm的纳米颗粒。在一个更优选的实施方案中，所述探针是平均尺寸为100-150nm的纳米颗粒。在一个更优选的实施方案中，所述探针是平均尺寸为154nm的纳米颗粒。
在又一个具体的实施方案中，所述探针是注射制剂。
在本发明的第四方面，提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括本发明第一方面的化合物。
如本文所使用的，术语“抗肿瘤药物”是指用于***的一类药物，这里提及的治疗是抑制肿瘤的生长或转移、或者消除肿瘤的过程。
如本文所使用的，术语“肿瘤”主要指的是实体瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，而恶性肿瘤又包括原位癌和癌转移。因此，在一个实施方案中，所述肿瘤可以包括良性肿瘤和恶性肿瘤，例如原位癌和癌转移。在一个进一步的实施方案中，所述原位癌包括乳腺癌；所述癌转移包括乳腺癌转移。
在一个实施方案中，所述抗肿瘤药物为纳米颗粒形式。在一个优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为50-200nm的纳米颗粒。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为100-150nm的纳米颗粒。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为154nm的纳米颗粒。
在一个实施方案中，所述抗肿瘤药物能够产生分别用于光热治疗和光动力治疗的热量和活性氧。
本文中使用的术语“活性氧”简写为ROS(Reactive Oxygen Species)是机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，包括：激发态的氧分子，即单重态氧或称单线态氧；含氧的自由基，如羟自由基；过氧化物，如过氧化氢等。顾名思义，“活性氧”具有高氧化活性，具有细胞毒性作用，以细胞膜、线粒体等部位对其最为敏感，能与细胞中多种生物大分子发生作用，通过与分子结合造成细胞膜***的损伤。因此，当其被产生并作用于肿瘤细胞时，能够氧化损伤肿瘤，达到抑制肿瘤生长或者消除肿瘤的目的。
在一个具体的实施方案中，所述抗肿瘤药物为注射制剂。例如，所述注射制剂可以为瘤内注射制剂。
在又一个具体的实施方案中，所述抗肿瘤药物靶向肿瘤细胞中的溶酶体。溶酶体是细胞内中很重要的细胞器，负责分解从外界进入细胞内的物质，也可以消化自身的细胞质或细胞器。当溶酶体破裂时可以释放出水解酶导致整个细胞死亡。因此，如果能够通过光热或者光动力治疗破坏溶酶体结构，那么将对癌细胞造成有效的杀伤。
在本发明的第五方面，提供了一种光诊疗剂，所述光诊疗剂包括：本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、或者本发明第四方面的抗肿瘤药物。
在一个具体的实施方案中，所述光诊疗剂为注射制剂。例如，所述注射制剂为瘤内注射制剂。
在又一个具体的实施方案中，所述光诊疗剂靶向肿瘤细胞中的溶酶体。
在本发明的第六方面，提供了一种进行体内生物成像的方法，所述方法包括：将本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或者本发明第三方面的探针一次地或者多次地施用于有此需要的受试者；其中，所述体内生物成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。所述多次包括两次、三次、四次、五次等，但不限于此。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括仅将本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或者本发明第三方面的探针一次地施用于有此需要的受试者。
在又一个优选的实施方案中，所述体内生物成像是包括荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。在进一步优选的实施方案中，所述体内生物成像是包括近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
如本文所用的，“有此需要的受试者”是指需要进行体内生物成像的对象。在一个具体的实施方案中，所述受试者为哺乳动物如人类和非人类动物例如小鼠、大鼠、兔子等，但不限于此。
在又一个具体的实施方案中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子或所述探针通过注射施用于所述有此需要的受试者。
在本发明的第七方面，提供了一种用于成像的试剂盒，所述试剂盒包括：
本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或者本发明第三方面的探针；以及
用于指导成像的说明书；
其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。
在一个优选的实施方案中，所述成像是包括荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。在进一步优选的实施方案中，所述体内生物成像是包括近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
在本发明的第八方面，提供了本发明第一方面的化合物、本发明第二方面的聚集诱导发光分子、或者本发明第三方面的探针在制备抗肿瘤药物中的用途。
在一个实施方案中，所述肿瘤为实体瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，例如乳腺癌。
在又一个实施方案中，所述抗肿瘤药物为纳米颗粒形式。在一个优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为50-200nm的纳米颗粒。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为100-150nm的纳米颗粒。在一个进一步优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为154nm的纳米颗粒。
在又一个具体的实施方案中，所述抗肿瘤药物为注射制剂形式。
在一个具体的实施方案中，所述抗肿瘤药物与激光照射联合使用。在一个优选的实施方案中，所述激光照射的激光波长为600-700nm、优选660nm，激光强度为0.2-0.5W/cm2、优选0.3W/cm2，每次照射5-15分钟、优选10分钟。
在一个实施方案中，所述抗肿瘤药物用于光热治疗和/或光动力治疗中。在一个优选的实施方案中，所述抗肿瘤药物用于协同的光热治疗和光动力治疗中。
在又一个具体的实施方案中，所述抗肿瘤药物是成像引导的抗肿瘤药物，其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。在一个进一步优选的实施方案中，所述成像是包括荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。在一个更进一步优选的实施方案中，所述成像是近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
在本发明的第九方面，提供了一种多模态诊疗***，所述***包括：
a.本发明第一方面的化合物、本发明第二所述的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂；
b.用于激光照射的激光源；以及
c.成像***，其中所述成像***包括荧光成像***、光声成像***、光热成像***、或其任意组合；
其中，在所述激光源的照射下，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂能够通过所述成像***识别肿瘤所在位置和监控肿瘤消融，并且能够通过光热疗法和/或光动力疗法对抗肿瘤。
如本文所使用的，术语“对抗肿瘤”、“抗肿瘤”和“***”在本文中可以互换使用、是指抑制肿瘤的生长或转移、或者消除肿瘤。
如本文所使用的，术语“光热疗法”(PTT)是指用特定波长的光照射光热剂，使得光热剂升温从而杀死肿瘤细胞。本文中的“光热剂”可以为本发明第一方面的化合物、本发明第二的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂。
如本文所使用的，术语“光动力疗法”(PDT)是用光敏剂和激光***或疾病的一种新方法，其是在有氧存在的环境中，在特定波长照射下，利用光敏剂产生活性氧等从而杀伤肿瘤细胞。本文中的“光敏剂”可以为本发明第一方面的化合物、本发明第二的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂。
从上文描述可以知晓，本发明第一方面的化合物、本发明第二的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂兼具光热剂和光敏剂之功效。
在一个优选的实施方案中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂为注射制剂。例如，所述注射制剂为瘤内注射制剂。
在一个优选的实施方案中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂为纳米颗粒形式。在一个具体的实施方案中，它们为平均尺寸为50-200nm的纳米颗粒。在一个优选的实施方案中，它们为100-150nm的纳米颗粒。在一个更优选的实施方案中，它们为154nm的纳米颗粒。
在一个具体的实施方案中，所述激光照射的激光波长为600-700nm，激光强度为0.2-0.5W/cm2，每次照射5-15分钟。在一个优选的实施方案中，所述激光照射的激光波长为660nm，激光强度0.3W/cm2，每次照射10分钟。
在又一个优选的实施方案中，所述成像是包括荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。在更进一步优选的实施方案中，所述成像是近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
在一个更优选的实施方案中，所述***能够通过协同的光热疗法和光动力疗法对抗肿瘤。
在又一个具体的实施方案中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物、或者所述光诊疗剂靶向肿瘤细胞中的溶酶体。
在本发明的第十方面，提供了一种***患者的方法，所述方法包括：将本发明第一方面的化合物、本发明第二所述的聚集诱导发光分子、本发明第三方面的探针、本发明第四方面的抗肿瘤药物、或者本发明第五方面的光诊疗剂一次地或者多次地施用于所述肿瘤患者；并且
对所述肿瘤患者进行一次或者多次激光照射。
在一个具体实施方案中，所述“一次地或者多次地施用于所述肿瘤患者”可以为一次地或者多次地施用于所述肿瘤患者的肿瘤位点。在本申请中，所述“多次地施用”可以包括两次、三次、四次、五次或更多次施用。优选地，所述施用仅进行一次。
在另一个具体实施方案中，所述“对所述肿瘤患者进行一次或者多次激光照射”可以为对所述肿瘤患者的肿瘤位点进行一次或者多次激光照射。在本申请中，所述“多次激光照射”可以包括两次、三次、四次、五次或者更多次激光照射。优选地，所述激光照射仅进行一次。
在一个具体的实施方案中，所述激光照射的激光波长为600-700nm，激光强度为0.2-0.5W/cm2，每次照射5-15分钟。在一个优选的实施方案中，所述激光照射的激光波长为660nm，激光强度为0.3W/cm2，每次照射10分钟。
在一个实施方案中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂为注射制剂。例如，所述注射制剂为瘤内注射制剂。
在另一个实施方案中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂为纳米颗粒形式，例如为平均尺寸为50-200nm、优选为100-150nm、更优选为154nm的纳米颗粒。
在一个具体的实施方案中，所述方法还包括通过成像来对识别肿瘤所在位置和监控肿瘤消融。
在进一步具体的实施方案中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。在一个优选的实施方案中，所述成像是包括荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。在一个进一步优选的实施方案中，所述成像是近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
在又一个具体的实施方案中，所述肿瘤患者为患有乳腺癌的患者。
在本发明的第十一方面，提供了第一方面所述的化合物、第二方面所述的聚集诱导发光分子、第三方面所述的探针、第四方面所述的抗肿瘤药物、或者第五方面所述的光诊疗剂，其用于***患者。
在一个具体的实施方案中，所述肿瘤可以为实体瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，例如原位癌和癌转移。在一个进一步的实施方案中，所述原位癌为乳腺癌，但不限于此；所述癌转移为乳腺癌转移，但不限于此。
在又一个具体的实施方案中，所述治疗包括将所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物、或所述光诊疗剂施用于肿瘤患者体内。
在一个进一步的具体实施方案中，所述“施用于肿瘤患者”可以为施用于肿瘤患者的肿瘤位点处。
在又一个进一步具体的实施方案中，所述施用通过一次或者多次注射进行，所述多次包括两次、三次、四次、五次等，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述施用仅通过一次注射进行。
在又一个具体的实施方案中，所述治疗还包括进行一次或者多次激光照射。所述多次包括两次、三次、四次、五次等，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述治疗还包括仅进行一次激光照射。在一个更优选的实施方案中，所述激光照射的激光波长为600-700nm，激光强度为0.2-0.5W/cm2，每次照射5-15分钟。在一个进一步优选的实施方案中，所述激光照射是激光波长660nm，激光强度0.3W/cm2，每次照射10分钟。
在一个具体的实施方案中，通过成像来对识别肿瘤所在位置和监控肿瘤消融，其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合。
在一个进一步的实施方案中，所述成像是包括荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。优选地，所述成像是近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
本发明的有益之处在于：
本发明提供了一种具有明亮的近红外二区发射、高活性氧产生能力和出色的光热转换效率的聚集诱导发光分子，其能够与激光照射结合使用，充分利用其激发态能量，在辐射跃迁和非辐射跃迁之间保持完美的平衡。由此，本发明的聚集诱导发光分子既可以作为荧光成像(尤其是近红外二区荧光成像)、光声成像(PAI)和光热成像(PTI)的多模态成像的试剂，其本身也可以作为光动力疗法(PDT)和光热疗法(PTT)的协同的抗肿瘤剂，抑制原发性肿瘤的进展和肿瘤转移。多模态成像克服了单模态成像各自的不足，提供互补的成像信息，实现对癌症的诊断、识别和监控，提高了癌症诊断的准确性，为协同的光动力疗法和光热疗法提供指导。因此，本发明的化合物、聚集诱导发光分子、探针、抗肿瘤药物、光诊疗剂提供了用于癌症治疗的多模态诊疗平台，能够促进疾病的精确诊断和有效治疗。
实施例
下述实施例将以两亲性TAM、TSAM和TSSAM三种聚集诱导发光分子为实验对象，验证根据本发明设计的聚集诱导发光分子在近红外二区的高亮度发射、活性氧产生能力和光热转换效率。如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
材料
所有的化学药品和试剂都是从化学来源购买的。
9-甲基吖啶、无水乙酸、乙酸酐、碳酸钠、2,6-二叔丁基吡啶、三氟甲磺酸甲酯和各溶剂均购自Meryer,J&K或Sigma Aldrich，这些无需进一步纯化即可直接使用。
磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)、2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、荧光素二乙酸盐(FDA)和碘化丙啶(PI)购自Sigma-Aldrich。
溶酶体绿色荧光探针LysoTracker Green购自Thermo Fisher Scientific。
细胞计数试剂盒8(CCK-8)和Hoechst 33342购自Dojindo Laboratories。
RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco。
活性氧(ROS)检测试剂盒购自Beyotime。
测量
核磁共振(NMR)光谱：使用Bruker ARX 400NMR光谱仪，以CDCl3或DMSO-d6作为溶剂记录1H和13C NMR光谱。
质谱(MS)：使用GCT premier CAB048质谱仪高在MALDI-TOF模式下记录高分辨率质谱(HRMS)。
吸收光谱：使用Milton Roy Spectronic 3000阵列分光光度计测量。
稳态荧光光谱：使用Perkin-Elmer LS 55分光荧光计测量。
绝对荧光量子产率(PLQY)：由滨松量子产率光谱仪C11347Quantaurus QY测定。
动态光散射(DLS)：使用90Plus粒度分析仪(购自布鲁克汉文仪器公司，美国)测量尺寸分布。
荧光成像：通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(ZEISS，型号为LSM880，德国)拍摄。
光热和光动力研究：通过使用660nm红外半导体激光器(长春镭光电技术)进行。
温度变化：使用E6红外热像仪(FLIR Systems)记录。
细胞计数：在BioTek酶标仪上进行CCK-8测定。
TAM、TSAM和TSSAM的合成路线图：
Figure BDA0003104321290000291
实施例1：(E)-9-(4-(二苯氨基)苯乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TAM)的制备
将9-甲基吖啶(1.5mmol)、乙酸酐(1.5mL)和乙酸(3mL)在配备有回流冷凝器的圆底烧瓶中搅拌并加热。当温度达到50℃左右时，将醛底物TCHO(4-二苯胺基苯甲醛，1mmol)加入混合物中；然后将混合物在氮气下回流搅拌过夜。冷却后，将得到的混合物用碳酸钠中和，并用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥并真空蒸发。将该固体在硅胶上进一步色谱分离，获得纯产物(E)-4-(2-(吖啶-9-基)乙烯基)-N,N-二苯基苯胺(TA)，其为黄色固体，产率为72％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.35(dd,J＝8.8,1.3Hz,2H),8.24(d,J＝8.7Hz,2H),7.83–7.74(m,3H),7.58–7.49(m,4H),7.35–7.27(m,4H),7.21–7.12(m,6H),7.11–7.05(m,2H),7.00(d,J＝16.5Hz,1H)。13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ149.00,147.48,139.26,130.08,130.05,129.54,127.97,126.11,125.60,124.95,124.68,123.59,123.30,120.09。C33H25N2 +[M+H]+的HRMS(ESI)理论值为：449.2012，实测值为：449.2121。
接着，向1mmol吖啶衍生物TA的10mL无水二氯甲烷溶液中加入4mmol的2,6-二叔丁基吡啶和5mmol三氟甲磺酸甲酯。将该溶液在室温搅拌3小时。滤出沉淀物，并用二氯甲烷洗涤。真空蒸发滤液至约3mL，并用***稀释。进一步过滤沉淀物并在真空下干燥。得到***固体(E)-9-(4-(二苯氨基)苯乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TAM)，产率为89％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.69(dd,J＝8.7,1.4Hz,2H),8.59(d,J＝9.1Hz,2H),8.33(ddd,J＝8.8,6.8,1.4Hz,2H),8.04(d,J＝16.0Hz,1H),7.85(dd,J＝8.7,6.7Hz,2H),7.66–7.60(m,2H),7.40–7.33(m,4H),7.27(s,1H),7.23–7.11(m,8H),4.88(s,3H)。13CNMR(101MHz,Chloroform-d)δ158.25,151.02,148.22,146.57,141.36,138.63,129.82,128.92,128.01,127.40,125.90,124.85,124.81,121.40,118.83,116.69,77.48,77.16,76.84。C34H27N2 +[M-CF3SO3]+的HRMS(ESI)理论值为：463.2169，实测值为：463.2319。
实施例2：(E)-9-(2-(2-(5-(4-(二苯氨基)苯基)噻吩-2-基)乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TSAM)的制备
将9-甲基吖啶(1.5mmol)、乙酸酐(1.5mL)和乙酸(3mL)在配备有回流冷凝器的圆底烧瓶中搅拌并加热。当温度达到50℃左右时，将醛底物TSCHO(5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛，1mmol)加入混合物中；然后将混合物在氮气下回流搅拌过夜。冷却后，将得到的混合物用碳酸钠中和，并用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥并在真空下蒸发。将该固体在硅胶上进一步色谱分离，获得纯产物(E)-4-(5-(2-(吖啶-9-基)乙烯基)噻吩-2-基)-N,N-二苯基苯胺(TSA)，橙色固体，产率为61％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.36(d,J＝8.8Hz,2H),8.24(d,J＝9.5Hz,2H),7.78(t,J＝7.7Hz,2H),7.70(d,J＝16.2Hz,1H),7.54(t,J＝7.0Hz,4H),7.30(t,J＝7.8Hz,4H),7.14(dd,J＝12.6,8.0Hz,8H),6.99(t,J＝9.1Hz,2H),6.80(dd,J＝25.0,5.3Hz,1H)。13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ148.97,147.47,132.90,130.09,129.52,129.42,129.37,126.75,125.91,125.78,124.88,124.62,124.51,123.50,123.42,122.87,120.73。C37H27N2S+[M+H]+的HRMS(MALDI-TOF)理论值为：531.1889,实测值为：531.2090。
接着，向1mmol吖啶衍生物TSA的10mL无水二氯甲烷溶液中加入4mmol的2,6-二叔丁基吡啶和5mmol三氟甲磺酸甲酯。将该溶液在室温搅拌3小时。滤出沉淀物，并用二氯甲烷洗涤。真空蒸发滤液至约3mL，并用***稀释。进一步过滤沉淀物并在真空下干燥，得到深蓝色固体(E)-9-(2-(2-(5-(4-(二苯氨基)苯基)噻吩-2-基)乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TSAM)，产率为87％。1H NMR(400MHz,DMSO-d)δ8.81(d,J＝8.7Hz,2H),8.67(d,J＝9.2Hz,2H),8.43–8.30(m,2H),7.95(t,J＝7.7Hz,2H),7.75–7.49(m,5H),7.34(t,J＝7.7Hz,4H),7.15–7.01(m,6H),6.99(d,J＝8.3Hz,2H),4.73(s,3H)。13C NMR(101MHz,DMSO-d)δ156.57,147.89,147.79,146.54,140.82,140.22,139.13,137.82,134.22,129.75,128.86,127.19,126.84,124.80,124.15,123.99,123.93,122.17,118.90,118.74,38.61。C38H29N2S+[M-CF3SO3]+的HRMS(MALDI-TOF)理论值为：545.2046,实测值为：545.2037。
实施例3：(E)-9-(2-(5'-(4-(二苯基氨基)苯基)-[2,2'-联噻吩]-5-基)乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TSSAM)的制备
将9-甲基吖啶(1.5mmol)、乙酸酐(1.5mL)和乙酸(3mL)在配备有回流冷凝器的圆底烧瓶中搅拌并加热。当温度达到50℃左右时，将醛底物TSSCHO(5'-(4-(二苯氨基)苯基)-[2,2'-联噻吩]-5-甲醛，1mmol)加入混合物中；然后将混合物在氮气下回流搅拌过夜。冷却后，将得到的混合物用碳酸钠中和并用二氯甲烷萃取，有机层用硫酸钠干燥并在真空下蒸发。将该固体在硅胶上进一步色谱分离，获得纯产物(E)-4-(5'-(2-(吖啶-9-9-基)乙烯基)-[2,2'-联噻吩]-5-基)-N,N-二苯基苯胺(TSSA)，红色固体，产率为78％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.36(d,J＝8.8Hz,2H),8.24(d,J＝9.5Hz,2H),7.78(t,J＝7.7Hz,2H),7.70(d,J＝16.2Hz,1H),7.54(t,J＝7.0Hz,4H),7.30(t,J＝7.8Hz,4H),7.14(dd,J＝12.6,8.0Hz,8H),6.99(t,J＝9.1Hz,2H),6.80(dd,J＝25.0,5.3Hz,1H)。13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ148.97,147.47,132.90,130.09,129.52,129.42,129.37,126.75,125.91,125.78,124.88,124.62,124.51,123.50,123.42,122.87,120.73。C37H27N2S+[M+H]+的HRMS(MALDI-TOF)理论值为：531.1889,实测值为：531.2090。
接着，向1mmol吖啶衍生物TSSA的10mL无水二氯甲烷中的溶液中加入4mmol 2,6-二叔丁基吡啶和5mmol三氟甲磺酸甲酯。将该溶液在室温搅拌3小时。滤出沉淀物，并用二氯甲烷洗涤。真空蒸发滤液至约3mL，并用***稀释。将沉淀物进一步过滤并真空干燥。得到蓝黑色固体(E)-9-(2-(5'-(4-(二苯基氨基)苯基)-[2,2'-并噻吩]-5-基)乙烯基)-10-甲基吖啶-10-鎓,三氟甲磺酸盐(TSSAM)，产率为90％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.65(d,J＝8.7Hz,2H),8.56(d,J＝9.2Hz,2H),8.31(t,J＝8.0Hz,2H),7.92–7.80(m,3H),7.49–7.34(m,4H),7.34–7.26(m,5H),7.16(dd,J＝14.0,5.8Hz,5H),7.08(dt,J＝7.4,3.2Hz,4H),4.84(s,3H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ156.39,147.31,146.68,143.87,140.81,140.56,139.69,139.42,137.86,134.02,129.70,128.85,127.24,126.81,126.59,126.49,125.01,124.55,124.15,124.01,123.70,122.58,122.28,119.28,119.07,118.90,39.94,39.73,39.52,39.31,39.10,30.00。C42H31N2S2 +[M-CF3SO3]+的HRMS(MALDI-TOF)理论值为：627.1923，实测值为：627.1934。
实施例4：TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒的制备
分别将1mg前述实施例中制备的TAM、TSAM或TSSAM化合物完全溶解在1mL DMSO中，然后将各自得到的溶液加入至9mL去离子水中。随后，用微尖端探针超声仪(XL2000，Misonix Incorporated，NY)以45％的输出功率进行连续2分钟的超声处理。之后，使用透析管(MWCO：3500Da)将所得分散液在去离子水中透析24小时。在透析过程中，约每4小时用新鲜的去离子水替换一次去离子水，以完全去除DMSO。获得的溶液在使用前通过超滤浓缩。最终得到纳米颗粒形式的TAM、TSAM或TSSAM(于水中)。
然后，使用90Plus粒度分析仪通过动态光散射(DLS)法测量TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒的尺寸分布，其结果如图3所示。该动态光散射结果显示，纳米颗粒形式的TAM、TSAM和TSSAM的平均直径分别为377nm、182nm和154nm。
实施例5：TAM、TSAM和TSSAM的光谱表征
对TAM、TSAM和TSSAM的光物理性质进行了表征。前述实施例1-3中制备的固态薄膜形式的TAM、TSAM和TSSAM荧光分子的吸收光谱通过Milton Roy Spectronic 3000阵列分光光度计测量，结果如图1B所示。从该图中可以看出，尽管噻吩单元的数目不同，但是这三种分子在640nm附近表现出相似的最大吸收，吸收峰延伸至1000nm。并且，固态薄膜形式的TAM、TSAM和TSSAM分子的吸收光谱的峰值大致相同，但相比TAM和TSAM，具有两个噻吩单元的TSSAM分子的吸收光谱具有显著更宽的半峰宽。
实施例4中制备的纳米颗粒形式的TAM、TSAM和TSSAM(浓度10μM)在700nm至1200nm的荧光光谱通过Perkin-Elmer LS 55分光荧光计测量，结果如图1C所示。从该图中可以看出，相比TAM和TSAM，纳米颗粒形式的TSSAM的荧光光谱出现了大约100nm的红移，使得其在近红外二区(图1C中的1000nm-1200nm区域)具有显著较高的荧光强度。这可以这归因于噻吩单元的电子效应。
为了研究TAM、TSAM和TSSAM的聚集诱导发光特性，发明人进一步测量了这三种荧光分子(浓度10μM)在具有不同体积百分比的甲苯的DMSO/甲苯混合溶剂中的荧光强度变化，结果如图1D和图2所示。从该图中可以看出，随着溶剂中甲苯体积含量的增加(体积百分比(fT)从0％增至95％)，在溶剂中形成了聚集体，因此这三种分子的荧光强度均得以提高，并在甲苯分数达到95％时荧光强度达到最大值，这代表了典型的聚集诱导发光特征。
图4示出了相同浓度(0.1mM)的TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒以及TAM、TSAM和TSSAM的DMSO溶液的荧光光谱(光致发光光谱)。从该图中可以看出，与于DMSO中相比，纳米颗粒形式的这三种聚集诱导发光分子均具有显著增强的发光强度。而在这三种聚集诱导发光分子中，又以聚集状态下的TSSAM纳米颗粒的发射波长最长，为950nm，而DMSO中的TSSAM的发射波长在1022nm，这使得TSSAM分子在近红外二区的荧光成像中具有潜在的应用前景。此外，相比TSSAM于DMSO溶液中的最大吸收峰595nm，其荧光光谱显示出令人难以置信的427nm斯托克斯位移。
使用滨松量子产率光谱仪C11347 Quantaurus QY，以例如出版物(Nat.Comm.2014,5,4206)相似的方式测量于DMSO溶剂中的和纳米颗粒形式的TAM、TSAM和TSSAM的荧光量子产率(QY)。使用IR-26作为参考(ΦPL＝0.05％)。为了进行参考校准，将一系列溶解于1,2-二氯乙烷(DCE)中的IR-26进一步稀释，以制备在808nm处的吸光度值为～0.10、～0.08、～0.06、～0.04和～0.02的五个样品。使用1000nm单通滤光片收集发射光并滤掉激发光，并将荧光强度积分对参考和样品的吸光度作图。根据下式(XIII)计算量子产率(QY)：
Figure BDA0003104321290000341
其中，n代表折射率，A代表吸光度，I代表荧光强度积分。
结果发现，纳米颗粒形式的TAM、TSAM和TSSAM的绝对量子产率分别高达0.9％、0.6％和0.5％，远高于其溶液态的量子产率(约0.1％)。总而言之，本发明的聚集诱导发光纳米颗粒如TSSAM的明亮发射使它们能够胜任荧光生物成像。
实施例6：纳米颗粒的活性氧产生性能的检测
为了进一步研究本发明的聚集诱导发光纳米颗粒的活性氧产生性能，使用常用的活性氧(ROS)指示剂2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)监测纳米颗粒的活性氧产生效率。DCFH-DA是一种非荧光分子，但水解为DCFH后可以与活性氧反应，进而发出绿色荧光，由此能够表征活性氧的产生。
在660nm激光照射(0.3W/cm2)下检测纳米颗粒形式的TAM、TSAM和TSSAM的活性氧产生。简而言之，首先通过将DCFH-DA(1×10-3M，0.5mL)的乙醇溶液添加到2mL NaOH(1×10-2M)中，并在室温下搅拌10分钟，将DCFH-DA水解为DCFH。30分钟后，将10mL PBS(pH 7.4)添加到混合物中以终止水解，并保持在黑暗中直至使用。随后，将活化的ROS指示剂(DCFH，4×10-5M)在含有浓度为0.1μM的TAM、TSAM或TSSAM纳米颗粒的样品溶液中进一步稀释至10μM。在660nm激光照射期间，使用光致发光设备(爱丁堡FS5)在不同时间间隔测量由聚集诱导发光分子TAM、TSAM或TSSAM敏化的活性氧而触发的指示剂的荧光。荧光光谱在488nm激发下测量，并在490nm至600nm范围收集发射光。使用每次照射的最大光致发光强度(I)和无照射的初始光致发光强度(I0)计算活性氧产生效率(I/I0-1)。
结果如图5所示，单独的DCFH-DA和单独的聚集诱导发光纳米颗粒在连续的激光照射下均未显示出荧光强度增强。但是，在同时存在DCFH-DA和聚集诱导发光纳米颗粒的情况下，荧光强度随着照射时间的延长而迅速增加，这表明聚集诱导发光纳米颗粒产生了活性氧。从荧光强度来看，活性氧产生效率按TSSAM>TSAM>TAM的顺序排列，其中TSSAM的活性氧产生效率I/I0-1高达100％，这强大的活性氧产生能力可能与其窄带隙有关。
实施例7：光热性质的表征
将TAM、TSAM和TSSAM的DMSO溶液(浓度为200μM)和TAM、TSAM和TSSAM纳米颗粒(于水中，浓度为200μM)暴露于660nm激光照射(0.3W/cm2)下，持续6分钟。在相同的照射条件下用纯DMSO和水作对照。在照射期间同时监测和采集样品管的实时温度和相应的红外热图像，结果如图6A-6B所示。
就光热转换行为而言，由图6A-6B可知，相比TAM和TSAM，TSSAM无论是在DMSO中，还是以纳米颗粒形式存在，均表现出更优的光热效应。在DMSO中的三种聚集诱导发光分子的温度迅速升高，并在激光照射180秒后达到平稳状态。具体来说，在DMSO中的TSSAM的温度最高达到了70℃，温度升高了45℃(ΔT)，高于TSAM(ΔT≈40℃)和TAM(ΔT≈33℃)。以纳米颗粒形式的聚集诱导发光分子也表现出类似的光热转换能力：TSSAM(ΔT≈37℃)>TSAM(ΔT≈31℃)>TAM(ΔT≈25℃)。这种光热转化的趋势可能归因于噻吩单元的数量不同。TSSAM带有两个可旋转的噻吩单元，能够将更多的光能转化为非照射弛豫，从而产生更多的热量。而且，由于紧密堆积的纳米颗粒中的分子运动受到限制，纳米颗粒的光热转换效率要比溶液中的单分子态低。总体而言，无论是溶液态还是以纳米颗粒形式存在，TSSAM均具有三种聚集诱导发光分子中最高的光热转换能力。经计算，TSSAM纳米颗粒的光热转换效率(η)为40.1％，与许多已报到光热剂相比，该效率相当地高。
此外，还通过与上述类似的步骤研究了激光照射功率和TSSAM纳米颗粒浓度对温度变化的影响。图6C示出了不同照射功率密度下TSSAM纳米颗粒的光热效应。图6D示出了在660nm激光照射下不同浓度的TSSAM纳米颗粒的光热效应。
由图6C和图6D可知，增加激光照射功率和/或纳米颗粒浓度都可以导致体系的温度升高，这表明可以容易地控制体系中的热量产生。以上表明，TSSAM是一种具有高光热转换效率的全方位聚集诱导发光分子。由于光声信号与光热性能密切相关，因此可以预料TSSAM是有望实现光声成像的化合物。TSSAM代表了一种在照射衰减和非照射衰减之间保持完美平衡的范例，其中高亮度的近红外二区荧光、光热成像和潜在的光声成像可以为协同的光动力治疗和光热治疗提供指导。因此，TSSAM作为癌症治疗的多模态诊疗平台，具有巨大的潜力。
实施例8：TSSAM纳米颗粒的体外协同光治疗功效
为了进一步研究TSSAM纳米颗粒在细胞水平上的体外协同光诱导治疗性能，依次进行了以下实验：
细胞培养：小鼠乳腺癌细胞4T1购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将4T1细胞在含有10％FBS和1％抗生素(青霉素-链霉素)的1640培养基中于5％二氧化碳的潮湿环境中于37℃进行培养。
细胞内化和细胞内追踪：对于TSSAM纳米颗粒的细胞摄取和亚细胞定位，首先将4T1细胞接种并培养于玻璃皿中。细胞贴壁24小时后，将培养基替换为1mL含有TSSAM纳米颗粒(TSSAM浓度为5μM)的新鲜培养基。孵育3小时后，将细胞用PBS洗涤，并进一步用溶酶体绿色荧光探针LysoTracker Green(浓度为1μM)和核酸染料Hoechst 33342(浓度为5μg/mL)染色30分钟。然后，除去培养基，并用PBS洗涤细胞3次。通过共聚焦荧光显微镜捕获相应的荧光图像，实验条件如下：激发波长：对于Hoechst 33342为405nm，对于LysoTracker Green为488nm，对于TSSAM纳米颗粒为633nm；发射光滤光片：对于Hoechst 33342为410nm至500nm，对于LysoTracker Green为500nm至550nm，并且对于TSSAM纳米颗粒为650nm至750nm。
结果如图7所示，观察到TSSAM纳米颗粒与溶酶体绿色荧光探针LysoTrackerGreen有明显的共定位信号，这表明TSSAM主要定位在溶酶体上。
细胞毒性评估：使用CCK-8活力测定法在4T1肿瘤细胞上检测TSSAM纳米颗粒的细胞毒性测试。将细胞以5×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并使其生长24小时。然后除去生长培养基，替换为含有不同浓度(0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM和5μM)的TSSAM纳米颗粒的新鲜培养基，接着再孵育12小时。随后，将细胞暴露于660nm激光照射(0.3W/cm2)，持续5分钟。同时，在相同的实验条件下，还对未经激光照射的TSSAM纳米颗粒孵育的细胞进行了暗细胞毒性研究。进一步孵育12小时后，将细胞用PBS洗涤，然后与含有10％CCK-8的无FBS培养基在黑暗中孵育2小时。最后，通过酶标仪测量450nm处的吸光度，并通过以下公式计算相对细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(OD样本-OD本底)/(OD对照组-OD本底)×100％。
结果如图8A所示。从该图中可知，在黑暗条件下孵育24小时后的细胞活力的降低可忽略不计，表明TSSAM纳米颗粒对细胞仅具有极小的暗毒性。然而，在660nm激光照射下，4T1细胞存活率显著下降，在浓度为5μM的TSSAM纳米颗粒的孵育下，仅剩下约20％。经计算，TSSAM纳米颗粒对4T1细胞的半数最大抑制浓度(IC50)低至0.87μM，证明了其对4T1细胞的优异杀伤力。
细胞内活性氧检测：为了验证光动力治疗是否在光疗功效中发挥重要作用，使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为指示剂评估了细胞内活性氧的产生。具体步骤如下：首先接种4T1细胞，并将其在玻璃皿中培养24小时。然后，将原始培养基替换为1mL带有或不带有TSSAM纳米颗粒的新鲜培养基(浓度为5μM)，然后孵育12小时。接下来洗涤细胞并进一步用1mL含10μM DCFH-DA的无FBS培养基再孵育20分钟，然后用660nm激光以0.3W/cm2照射负载了TSSAM纳米颗粒的细胞5分钟。在37℃下孵育最后0.5小时后，在488nm处激发TSSAM纳米颗粒，并收集500nm至550nm的放射光，通过共聚焦荧光显微镜对细胞进行成像。
结果如图8B所示：在激光照射下，TSSAM纳米颗粒处理过的4T1细胞表现出强烈的荧光，而对照组则未发现明显的荧光增强。该结果证明了TSSAM纳米颗粒在4T1细胞内同样具有优越的活性氧产生能力，与细胞外的活性氧产生结果非常匹配。
活/死细胞染色：通过使用双乙酸荧光素(FDA，发出绿色荧光的活细胞指示剂)和碘化丙啶(PI，发出红色荧光的死细胞指示剂)共染色细胞，进一步直观地示出TSSAM纳米颗粒的强大的光治疗能力。具体步骤如下：接种4T1细胞并将其在玻璃皿中培养24小时，然后用TSSAM纳米颗粒(浓度为5μM)处理12小时。之后，洗涤细胞并替换新鲜培养基，随后用660nm激光照射(0.3W/cm2)5分钟。在37℃下再孵育1小时后，将细胞依次用PI(60μg/mL)和FDA(100μg/mL)染色10分钟。用PBS轻轻洗涤后，通过共聚焦荧光显微镜使细胞成像。实验条件如下：激发波长：对于FDA为488nm，对于PI为534nm；发射光滤光片：对于FDA是500nm至550nm，对于PI是550nm至650nm。
活/死细胞染色结果如图8C所示。对于仅激光照射和仅TSSAM处理过的细胞，观察到的细胞死亡可忽略不计，表现为完全的绿色荧光，这表明TSSAM纳米颗粒的副作用极小。相反，在激光照射5分钟后，几乎所有TSSAM纳米颗粒孵育的癌细胞都被清除。红色荧光团证明了TSSAM纳米颗粒在癌细胞消融中具有显著的有效性和可控性。总而言之，具有强大的活性氧产生性能和光热转换效率的TSSAM纳米颗粒显示出出色的杀细胞活性和抗肿瘤潜力。
实施例9：TSSAM纳米颗粒的体内多模态成像指导的协同治疗功效
为了进一步研究TSSAM纳米颗粒在体内的多模态成像和治疗性能，依次进行了以下实验：
动物和肿瘤模型：4-5周龄的雄性BALB/c裸鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司。将小鼠饲养在无病原体的条件下，并用标准实验室水和食物喂养。通过将悬浮于PBS中的4T1细胞(5×105)经皮下注射到小鼠的右侧腹中，建立了异种移植的4T1荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到约100mm3时，使用该4T1荷瘤小鼠。参与这项工作的所有动物实验均得到深圳大学动物伦理委员会(AEWC-SZU)的批准。
体内多模态成像：评估了TSSAM纳米颗粒在4T1荷瘤小鼠体内的多模态成像，即近红外二区荧光成像、光声成像和光热成像。具体步骤如下：首先用2L/min氧气流量和2％异氟烷麻醉异种移植的4T1荷瘤小鼠，然后瘤内注射20μL TSSAM纳米颗粒(TSSAM浓度为1mM)。然后，通过商购II 900/1700系列成像***捕获在注射后预定时间间隔(1小时、6小时、12小时和24小时)的体内近红外二区荧光成像。同时，还通过自制的光声断层扫描***获得了相同时间点的体内光声成像。
图9A示出了向4T1荷瘤小鼠中肿瘤内注射TSSAM纳米颗粒之后的近红外二区荧光成像和光声成像结果。注射前，荧光成像和光声成像均未显示明显的信号，表明在1000nm长波通滤光片下的自发荧光干扰极小。注射TSSAM后，荧光成像和光声成像的信号强度在随后的12小时保持很高，并且在注射后24小时仍然持续，这表明12小时应该是随后进行体内光热治疗的最佳时间点。荧光成像和光声成像的组合能够满足彼此的互补需求，使得能够准确鉴定肿瘤组织和正常组织之间具有清晰边界的肿瘤区域，并具有较高的时空分辨率。
此外，对于体内光热成像，在瘤内注射TSSAM纳米颗粒后12小时，使用购自FLIRSystems的E6红外热像仪监测用660nm激光(0.3W/cm2)照射2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟后的肿瘤部位表面的温度变化。以在相同激光照射条件下瘤内注射PBS(20μL)的荷瘤小鼠作对照。
图9B所示出了瘤内注射TSSAM纳米颗粒后的4T1荷瘤小鼠分别进行激光照射2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟(660nm，0.3W cm-2)后的红外热成像。如图所示，光热成像揭示了肿瘤位点温度的快速升高。在激光照射后，肿瘤位点的温度在2分钟内从37.1℃升至57.6℃，显示出优异的光热转换效率。而在相同的实验条件下，经PBS处理的荷瘤小鼠的肿瘤温度仅表现出轻微的增强。
上述结果证明了TSSAM纳米颗粒能够作为近红外二区荧光成像/光声成像/光热成像三模态成像的引人注目的试剂，这将大大提高诊断的准确性，并为光疗提供指导。
体内抗肿瘤功效：为了研究TSSAM纳米颗粒的体内抗肿瘤功效，将异种移植的4T1荷瘤小鼠随机分为四组(每组n＝6)，包括：“PBS”组、“PBS+激光照射”组、“TSSAM纳米颗粒”组和“TSSAM纳米颗粒+激光照射”组。当肿瘤达到约100mm3时，向肿瘤内分别注射20μL PBS和TSSAM纳米颗粒(TSSAM浓度为1mM)。对于“PBS+激光照射”组和“TSSAM纳米粒子+激光照射”组，在注射后12小时，用660nm激光(0.3W/cm2)连续照射每组小鼠的肿瘤10分钟。并且在激光照射期间使用E6红外热像仪实时记录温度和红外图像。经过各种处理后，每3天监测并记录每只小鼠的肿瘤大小和体重。用游标卡尺测量肿瘤大小，并使用下式估算肿瘤体积(V)：V＝(长度×宽度2)/2。另外，在第0天和第15天给小鼠拍照，以肉眼观察TSSAM纳米颗粒的高效抗肿瘤作用。
结果如图9C所示，单独的激光照射和单独的TSSAM纳米颗粒都不能抑制肿瘤的生长，这与阴性对照即PBS处理组表现出相似的结果。与之形成鲜明对比的是，在经激光照射的情况下，TSSAM纳米颗粒处理组显著阻碍了肿瘤的生长，并在第3天完成了彻底的肿瘤根除，并且没有一例复发(图10)。值得注意的是，仅通过单次注射(1mM，20μL)然后进行一次激光照射(660nm，0.3W/cm2，10分钟)即可实现显著的治疗效果，且没有任何副作用，这证明了本发明的TSSAM纳米颗粒通过光动力治疗和光热治疗的协同作用表现出出色的抗肿瘤能力。
组织学分析：为了进一步验证抗肿瘤作用，通过H&E、TUNEL和CD31染色，对经过不同处理的肿瘤切片进行了组织学和免疫组化研究。具体地，在处理后第15天，收集小鼠的肿瘤和主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)，用4体积％***盐水中固定过夜，用石蜡包埋，然后以5μm厚度切片。此外，激光照射完成24小时后，获得了“TSSAM纳米颗粒+激光照射”组小鼠的肿瘤组织。对切片进行H&E、CD31和TUNEL染色，然后用倒置光学显微镜检查以进行组织病理学评估，结果如图9D所示。
H&E分析显示，经TSSAM纳米颗粒+激光照射的协同处理后，肿瘤组织明显受损，而其余组的形态和肿瘤细胞核保持正常。H&E染色结果与TUNEL分析表明的细胞凋亡水平非常吻合。同时，作为内皮细胞的标志物，CD31被用于检测微血管密度。TSSAM纳米颗粒+激光照射处理后，CD31阳性血管密度显著下降，表明肿瘤细胞诱导凋亡。综上所述，这些结果证实了TSSAM是一种能够用于光动力和光热协同治疗的药物，可以抑制原发性肿瘤的进展和肿瘤转移。
尽管在肿瘤消融方面有效，但是体内毒性仍然是需要考虑的问题。图9E示出了在经过如图9C所示的处理后，异种移植的4T1荷瘤小鼠的体重曲线。可以看出，处理15天后，与对照组相比，TSSAM处理组未发现明显的体重减轻。图10示出了分别经过PBS、PBS+激光照射、TSSAM纳米颗粒、以及TSSAM纳米颗粒+激光照射处理15天后的4T1荷瘤小鼠的代表性图像。显而易见，经TSSAM纳米颗粒+激光照射处理后的荷瘤小鼠并没有复发。
血液学分析：处理后第15天，在处死小鼠前，将所有上述小鼠的血样收集到采血管中，以进行进一步的常规血液学分析和血清生化分析，以评估血液相容性。荷瘤小鼠的肝功能标志物(BUN、CREA和UA)和肾功能标志物(ALP、ALB、ALT和AST)的血液生化测试结果如图11所示，荷瘤小鼠的常规血液指标如下表1所示。
表1.小鼠的常规血液指标
Figure BDA0003104321290000421
上述结果表明，TSSAM纳米颗粒处理组的肝肾功能指标与对照组相比无显著统计学差异，这表明荷瘤小鼠并没有因TSSAM引起严重功能障碍。在血液检查方面，用TSSAM纳米颗粒+激光照射处理后，荷瘤小鼠所有测得的参数均在正常范围内。还发现对照组的荷瘤小鼠的某些血液参数显示出明显的偏差，这是由于小鼠的体内肿瘤快速生长引起的不健康的身体状态(表1)。总的来说，以上结果证明了TSSAM具有理想的相容性和生物安全性，这对于合格的光诊疗剂至关重要。

Claims (28)

1.由下式(I)表示的化合物：
Figure FDA0003104321280000011
其中，n为0-5的整数，优选地，n为2；
R1是分子转子，选自
Figure FDA0003104321280000012
X是键或共轭部分，如任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、或-C＝C-；
R2选自
Figure FDA0003104321280000013
或其鎓盐
Figure FDA0003104321280000014
或者
Figure FDA0003104321280000015
或其鎓盐
Figure FDA0003104321280000016
R3和R4为苯环任意位置的取代基，优选为N的对位取代基，各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5和R6各自独立地选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述鎓盐是三氟甲基磺酸盐、六氟磷酸盐、或四氟化硼盐，优选为三氟甲基磺酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其由下式(II)表示：
Figure FDA0003104321280000021
其中，R3和R4各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其由下式(III)-(VI)中任一项表示：
Figure FDA0003104321280000022
Figure FDA0003104321280000031
其中，X是键或共轭部分，如任选取代的苯基、任选取代的杂芳基、或-C＝C-；
R3和R4各自独立地选自H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6不饱和烷基、任选取代的C1-C6杂烷基、任选取代的C3-C6环烷基、任选取代的C3-C6杂环烷基、任选取代的C6-C10芳基、或任选取代的C5-C10杂芳基；
R5选自H、-CH3、CH3CH2-、-CH2CH2NH2、-CH2CH2OH、-CH2CH2NH3 +。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其由下式(VII)-(XI)中任一项表示：
Figure FDA0003104321280000032
Figure FDA0003104321280000041
优选地，所述化合物其由下式(VII)表示：
Figure FDA0003104321280000042
6.根据权利要求1或2所述的化合物，其为式(XII)所示的化合物：
Figure FDA0003104321280000051
其中，n为0-5的整数；优选地，n为2。
7.一种聚集诱导发光分子，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的化合物。
8.根据权利要求7所述的聚集诱导发光分子，其中，所述聚集诱导发光分子为纳米颗粒形式；优选地，所述聚集诱导发光分子平均尺寸为50-200nm、更优选为100-150nm、最优选为154nm的纳米颗粒。
9.一种用于成像的探针，其包括：权利要求1-6中任一项所述的化合物、或者权利要求7-8中任一项所述的聚集诱导发光分子；其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合；
优选地，所述成像为包括荧光成像如近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
10.根据权利要求9所述的探针，其中，所述探针为纳米颗粒的形式；优选地，所述探针为平均尺寸为50-200nm、优选为100-150nm、最优选为154nm的纳米颗粒。
11.根据权利要求9-10中任一项所述的探针，其中，所述探针是注射制剂。
12.一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括权利要求1-6中任一项所述的化合物；
例如，所述肿瘤为实体瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤例如乳腺癌；
例如，所述抗肿瘤药物为纳米颗粒形式；优选地，所述抗肿瘤药物平均是尺寸为50-200nm、优选为100-150nm、更优选为154nm的纳米颗粒。
13.根据权利要求12所述的抗肿瘤药物，其中，所述抗肿瘤药物能够产生分别用于光热治疗和光动力治疗的热量和活性氧。
14.根据权利要求12或13所述的抗肿瘤药物，其中，所述抗肿瘤药物为注射制剂例如瘤内注射制剂。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的抗肿瘤药物，其中，所述抗肿瘤药物靶向肿瘤细胞中的溶酶体。
16.一种光诊疗剂，所述光诊疗剂包括：权利要求1-6中任一项所述的化合物、权利要求7或8所述的聚集诱导发光分子、权利要求9-11中任一项所述的探针、或者权利要求12-15中任一项所述的抗肿瘤药物。
17.根据权利要求16所述的光诊疗剂，其中，所述光诊疗剂为注射制剂例如瘤内注射制剂。
18.根据权利要求16或17所述的光诊疗剂，其中，所述光诊疗剂靶向肿瘤细胞中的溶酶体。
19.一种进行体内生物成像的方法，所述方法包括：将权利要求1-6中任一项所述的化合物、权利要求7-8中任一项所述的聚集诱导发光分子、或权利要求9-11中任一项所述的探针一次地或者多次地(优选一次地)施用于有此需要的受试者；其中，所述体内生物成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合；
优选地，所述体内生物成像是包括荧光成像如近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物如人类和非人类动物如小鼠、大鼠、兔子。
21.根据权利要求19-20中任一项所述的方法，其中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子或所述探针通过注射施用于所述有此需要的受试者。
22.一种用于成像的试剂盒，所述试剂盒包括：
权利要求1-6中任一项所述的化合物、权利要求7-8中任一项所述的聚集诱导发光分子、或权利要求9-11中任一项所述的探针；以及
用于指导成像的说明书；
其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合；
优选地，所述成像为包括荧光成像如近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
23.权利要求1-6中任一项所述的化合物、权利要求7-8中任一项所述的聚集诱导发光分子、或权利要求9-11中任一项所述的探针在制备抗肿瘤药物中的用途；
例如，所述肿瘤为实体瘤，包括良性肿瘤和恶性肿瘤，例如乳腺癌；
例如，所述抗肿瘤药物为纳米颗粒形式；优选地，所述抗肿瘤药物是平均尺寸为50-200nm、优选为100-150nm、更优选为154nm的纳米颗粒；
例如，所述抗肿瘤药物为注射制剂形式。
24.根据权利要求23所述的用途，其中，所述抗肿瘤药物与激光照射联合使用，例如，所述激光照射的激光波长为600-700nm、优选660nm，激光强度为0.2-0.5W/cm2、优选0.3W/cm2，每次照射5-15分钟、优选10分钟。
25.根据权利要求23或24所述的用途，其中，所述抗肿瘤药物用于光热治疗和/或光动力治疗中，例如用于协同的光热治疗和光动力治疗中。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的用途，其中，所述抗肿瘤药物是成像引导的抗肿瘤药物，其中，所述成像包括荧光成像、光声成像、光热成像、或其任意组合；优选地，所述成像是包括荧光成像如近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像。
27.一种多模态诊疗***，所述***包括：
a.权利要求1-6中任一项所述的化合物、权利要求7-8中任一项所述的聚集诱导发光分子、或权利要求9-11中任一项所述的探针、权利要求12-15中任一项所述的抗肿瘤药物、或者权利要求16-18中任一项所述的光诊疗剂；
优选地，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂为注射制剂，例如瘤内注射制剂；
优选地，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂为纳米颗粒形式，例如为平均尺寸为50-200nm、优选为100-150nm、更优选为154nm的纳米颗粒；
b.用于激光照射的激光源，例如，所述激光照射的激光波长为600-700nm、优选660nm，激光强度为0.2-0.5W/cm2、优选0.3W/cm2，每次照射5-15分钟、优选10分钟；以及
c.成像***，其中所述成像***包括荧光成像***、光声成像***、光热成像***、或其任意组合；优选地，所述成像***为包括荧光成像如近红外二区的荧光成像、光声成像和光热成像的三模态成像；
其中，在所述激光源的照射下，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂能够通过所述成像***识别肿瘤所在位置和监控肿瘤消融，并且能够通过光热疗法和/或光动力疗法(优选地，协同的光热疗法和光动力疗法)对抗肿瘤。
28.根据权利要求27所述的多模态诊疗***，其中，所述化合物、所述聚集诱导发光分子、所述探针、所述抗肿瘤药物或者所述光诊疗剂靶向肿瘤细胞中的溶酶体。
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