CN113801000A - 一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的化合物及其制备方法和应用。本发明公开的化合物为对映‑贝壳杉烷型二萜新化合物，鉴定为16β‑17‑hydroxy‑18‑nor‑ent‑kaurane‑4β‑ol，其分子式为C19H32O2。本发明通过大量实验筛选，对番荔枝果皮的有效成分进行深入研究，通过渗漉提取、正相硅胶柱色谱分离得到具有显著抗癌活性的对映‑贝壳杉烷型二萜新化合物。本发明提供的制备工艺，设计合理，可操作性强，可以实现废弃番荔枝果皮的资源利用，具有重要的应用价值。

Description

一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药提取分离方法和应用，具体涉及一种从番荔枝果皮中分离得到的具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜新化合物。
背景技术
肝癌是我国发病率最高的癌种，因其隐匿性高，发现时多已到达晚期，具有高死亡率的特点。介入疗法(局部化疗)是治疗中晚期肝癌的重要手段，但是化疗药的毒副作用严重危害了患者的健康，因此，挖掘具有抗肝癌活性的天然药物成为肝癌研究的重要方向。
热带著名水果番荔枝，又名释迦、佛头果，文献记载其可治疗恶疮肿痛。番荔枝种子作为广东省地方中药，广泛用于肿瘤的治疗，包括肝癌。前期研究发现，番荔枝果皮提取物具有很好的抗肝癌活性，其活性成分主要集中在小极性部位。
番荔枝果皮作为潜在抗肝癌药材，一直作为废弃物丢弃，为了使废弃物变废为宝，本发明对番荔枝果皮小极性成分进行分离，并筛选出其抗肝癌活性成分。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的在于从番荔枝果皮中分离得到一个新的对映-贝壳杉烷型二萜新化合物16β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol，分子式为C19H32O2,结构式为：
Figure BDA0003257738320000011
本发明的第二个目的在于提供从番荔枝果皮提取分离新化合物16β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的制备方法，包括以下步骤：
(1)取风干的番荔枝果皮并粉碎成粗粉，润湿后转移至渗漉筒中，采用乙醇室温下渗漉提取，合并渗漉提取液，置于旋转蒸发器中，减压浓缩，得到浸膏；
(2)将乙醇浸膏用乙酸乙酯溶解后，以硅胶拌样成干燥细粉，采用硅胶湿法装柱，上样后，以石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，薄层分析展板检测合并相同流分，得到15个部位段，依次编号为F1～F15；
(3)取F5部位，经干法拌样后，装入硅胶柱并以石油醚：丙酮***洗脱，再次分为5个段，分别为F5-1，F5-2，F5-3，F5-4和F5-5；将F5-1和F5-2合并，以石油醚-丙酮梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜新化合物。
作为优选方案，从番荔枝果皮提取分离新化合物16β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的制备方法，包括以下步骤：
(1)取风干的番荔枝果皮8kg并粉碎成粗粉，适当润湿后转移至渗漉筒中，采用10倍体积的95％EtOH室温下渗漉提取三次。合并提取液，于旋转蒸发器中减压浓缩提取液得到乙醇浸膏400g。
(2)将400g乙醇浸膏用乙酸乙酯溶解后，以400g硅胶(100-200目)拌样成干燥细粉，采用2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，上样后，以石油醚-乙酸乙酯(1:0，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1)、乙酸乙酯-甲醇(100:1，50:1，10:1，0:1)梯度洗脱，每1L作为一个流分，薄层分析展板检测合并相同流分，得到15个部位段，依次编号为F1～F15。
(3)取F5部位，经干法拌样后，装入硅胶柱并以石油醚：丙酮***洗脱，再次分为5个段，分别为F5-1，F5-2，F5-3，F5-4和F5-5。F5-1和F5-2段量相对较少且重叠较多，故合并，以石油醚-丙酮(100:1～20:1)梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜新化合物6β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol。
本发明的第三个目的是把上述化合物和药学上可接受的载体制成片剂，胶囊剂，喷雾剂，注射剂，或透皮控释贴剂，用于口服或外用，实现上述新化合物预防和治疗肝癌方面的药物用途。
有益效果：
本发明通过大量实验筛选，对番荔枝果皮的有效成分进行深入研究，通过渗漉提取、正相硅胶柱色谱分离得到具有显著抗癌活性的对映-贝壳杉烷型二萜新化合物6β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol。本发明提供的制备工艺，设计合理，可操作性强，可以实现废弃番荔枝果皮的资源利用，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为新化合物的HMBC图；
图2为新化合物的NOESY图；
图3为新化合物的HRESI-MS图；
图4为新化合物的1H NMR图；
图5为新化合物的13C NMR图；
图6为新化合物的HSQC图；
图7为新化合物的HMBC图；
图8为新化合物的NOESY图。
具体实施例
下列实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
番荔枝果皮中对映-贝壳杉烷型二萜新化合物6β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol的提取分离方法，包括以下步骤：
(1)取风干的番荔枝果皮8kg并粉碎成粗粉，适当润湿后转移至渗漉筒中，采用10倍体积的95％EtOH室温下渗漉提取三次。合并提取液，于旋转蒸发器中减压浓缩提取液得到乙醇浸膏400g。
(2)将400g乙醇浸膏用乙酸乙酯溶解后，以400g硅胶(100-200目)拌样成干燥细粉，采用2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，上样后，以石油醚-乙酸乙酯(体积比1:0，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1)、乙酸乙酯-甲醇(体积比100:1，50:1，10:1，0:1)梯度洗脱，每1L作为一个流分，薄层分析展板检测合并相同流分，得到15个部位段，依次编号为F1～F15。
(3)取F5部位，经干法拌样后，装入硅胶柱并以石油醚：丙酮***洗脱，再次分为5个段，分别为F5-1，F5-2，F5-3，F5-4和F5-5。F5-1和F5-2段量相对较少且重叠较多，故合并，以石油醚-丙酮(体积比100:1～20:1)梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜新化合物6β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol。
运用核磁共振谱(1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC、NOESY)和高分辨质谱鉴定该化合物的结构。
该化合物为白色粉末，易溶于甲醇，mp.223～224℃。HRESI-MS m/z＝293.248 0([M+H]+，Calcd.For C19H33O2，293.2481)，由此推断其分子式为C19H32O2，不饱和度Ω＝4。如图1～8，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)显示有两个甲基δH0.92(s,3H,H-20),0.96(s,3H,H-19)。结合13C NMR(100MHz,DMSO-d6)和HSQC可确认有19个碳信号，包括2个甲基，10个亚甲基，4个次甲基以及3个季碳。HMBC谱中，根据OH(δH3.89)对C-3(δC43.0)、C-4(δC70.4)、C-5(δC57.2)和C-19(δC22.9)的相关可以推断出OH位于C-4上；OH(δH4.28)与C-17(δC62.4)的相关可以推断出CH2OH的存在；H-13(δH2.08)和H-15(δH1.00)对C-17(δC62.4)的相关可以推断出CH2OH为17位。同样，根据HMBC谱中其他数据间的相关可对化合物各碳的数值进行归属。从NOESY谱中可知，OH(δH3.89)/H-3(δH1.46,1.59)的相关信号表明C-4位的OH在平面上方，为β型，CH3在19位，为α型；H-17(δH3.45)/H-13(δH2.08)，H-17(δH3.45)/H-14(δH2.04)的相关信号表明C-17在平面下，为α型。综合以上分析，该化合物鉴定为16β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol，经SciFinder数据库***检索，该化合物未见相关文献报道，表明该化合物为一新的对映-贝壳杉烷型二萜。
表1化合物的氢、碳核磁共振波谱数据
碳位 δ<sub>H</sub> δ<sub>C</sub> 碳位 δ<sub>H</sub> δ<sub>C</sub>
C-1 CH<sub>2</sub>,0.70,1.69,m 39.57 C-11 CH<sub>2</sub>,1.60,m 19.60
C-2 CH<sub>2</sub>,1.79,m 18.97 C-12 CH<sub>2</sub>,1.39,1.54,m 25.90
C-3 CH<sub>2</sub>,1.46,1.59,m 43.02 C-13 CH,2.08,m 36.95
C-4 70.45 C-14 CH<sub>2</sub>,1.25,2.04,m 42.84
C-5 CH,0.79,m 57.20 C-15 CH<sub>2</sub>,1.00,1.44,m 44.16
C-6 CH<sub>2</sub>,1.17,m 19.15 C-16 CH,0.84,m 43.94
C-7 CH<sub>2</sub>,0.93,m 40.41 C-17 CH<sub>2</sub>,3.45,m 62.35
C-8 - 41.67 C-18 OH,3.89,s -
C-9 CH,1.00,m 57.07 C-19 CH<sub>3</sub>,0.96,s 22.91
C-10 - 39.79 C-20 CH<sub>3</sub>,0.92,s 17.48
。
实施例2：化合物6β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol对SMMC-7721细胞的细胞毒活性。
将指数***期的SMMC-7721肝癌细胞均匀接种到96孔板中，每孔8000个细胞，24h后，给药不同浓度的新化合物6β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol(最高浓度200μg/mL)，并设置空白对照，48h后，每孔加20μL的MTT溶液，孵育4h后，除去培养液，加150μLDMSO，摇匀后于酶标仪上490nm下检测吸光度值，计算IC50值。以上实验重复三次，最终得IC50为382.17μmol/L。显示具有较好的抗肿瘤活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物，其特征在于：该化合物的分子式为C19H32O2，结构式为：
Figure FDA0003257738310000011
2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)取风干的番荔枝果皮并粉碎成粗粉，润湿后转移至渗漉筒中，采用乙醇室温下渗漉提取，合并渗漉提取液，置于旋转蒸发器中，减压浓缩，得到浸膏；
(2)将乙醇浸膏用乙酸乙酯溶解后，以硅胶拌样成干燥细粉，采用硅胶湿法装柱，上样后，以石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，薄层分析展板检测合并相同流分，得到15个部位段，依次编号为F1～F15；
(3)取F5部位，经干法拌样后，装入硅胶柱并以石油醚：丙酮***洗脱，再次分为5个段，分别为F5-1，F5-2，F5-3，F5-4和F5-5；将F5-1和F5-2合并，以石油醚-丙酮梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜新化合物。
3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)取风干的番荔枝果皮并粉碎成粗粉，润湿后转移至渗漉筒中，采用10倍体积的95％乙醇室温下渗漉提取1～3次，合并渗漉提取液，置于旋转蒸发器中，减压浓缩，得到浸膏；
(2)将乙醇浸膏用乙酸乙酯溶解后，以硅胶拌样成干燥细粉，采用硅胶湿法装柱，上样后，以体积比为1:0，50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，0:1的石油醚-乙酸乙酯和体积比为100:1，50:1，10:1，0:1的乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，每1L作为一个流分，薄层分析展板检测合并相同流分，得到15个部位段，依次编号为F1～F15；
(3)取F5部位，经干法拌样后，装入硅胶柱，并以体积比为50:1～1:1的石油醚：丙酮***洗脱，再次分为5个段，分别为F5-1，F5-2，F5-3，F5-4和F5-5；将F5-1和F5-2合并，以体积比100:1～20:1石油醚-丙酮梯度洗脱后，得对映-贝壳杉烷型二萜新化合物。
4.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物在制备治疗抗肿瘤的药物中的应用。
5.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的对映-贝壳杉烷型二萜化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，将化合物和药学上可接受的载体制成片剂、胶囊剂、喷雾剂、注射剂或透皮控释贴剂。
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