CN113789329A - 一种用于抑制二化螟钻蛀行为的rna制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，首先从二化螟中克隆二化螟表皮蛋白基因LCP16/17，并对二化螟表皮蛋白基因LCP16/17设计引物，合成了用于干扰二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的dsRNA，并创建了使用纳米载体递送dsRNA的体系，通过点滴体表将dsRNA递送到虫体内对二化螟表皮蛋白基因LCP16/17进行干扰。结果表明：dsRNA注射二化螟后，发现二化螟钻蛀行为改变，显著减少了钻蛀行为的发生，对二化螟的防治具有重要作用。本发明为害虫的分子调控提供了新的方法，也为深入理解昆虫生长发育机制、创制新的生物农药制剂提供理论基础。
Description
技术领域
本发明提供一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，具体涉及二化螟表皮蛋白LCP16/17基因、靶向dsRNA的合成和应用，属于属于农业生物技术领域。
技术背景
二化螟Chilo suppressalis属鳞翅目，螟蛾科，蛀食水稻茎秆，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，主要分布于我国长江流域及其以南的稻区。长期以来主要以化学防治为主，但农药的大量使用导致抗药性以及农药残留等问题日益严重。因此，迫切需要开发新型高效的防治方法。
昆虫表皮是抵御外来物的第一道屏障，防止体内水分散失，保护其免受外界病原物以及有害物质的侵害。表皮的化学成分主要为脂类，蛋白质和几丁质，表皮蛋白存在于上表皮层和原表皮层，上表皮层由脂类和蛋白质交联形成，不含有几丁质，几丁质仅存在于原表皮层，并与表皮蛋白交联形成原表皮层。因此，表皮蛋白是一个潜在的靶标位点。
RNA干扰技术是一种较为普遍的实验技术，通过递送dsRNA，特异沉默目的基因，进行基因的功能研究，也是疾病治疗与农业害虫防治的热门方向。纳米材料可以携带dsRNA突破体壁，基因干扰效率高，而且纳米载体对非靶标生物安全。因此，本发明采用RNAi技术，通过点滴体表，特异沉默二化螟表皮蛋白LCP16/17，发现二化螟钻蛀行为改变，显著减少了钻蛀行为的发生，对二化螟的防治具有重要作用。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供了一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，首先提供了二化螟LCP16/17基因，然后根据二化螟LCP16/17基因设计并合成其对应的靶向dsRNA。将dsRNA与纳米载体混合，挑选生长状态一致的幼虫，通过点滴法将dsRNA递送到体内。结果表明，二化螟表皮蛋白基因LCP16/17在mRNA水平的表达显著降低，幼虫的钻蛀行为显著减少，该结果对绿色防控二化螟提供了新的方法与思路。
本发明是这样实现的：一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，包括以下步骤：
步骤（1）、根据已知昆虫CPR家族蛋白序列保守区（motif），运用生物信息学分析方法在二化螟转录组数据库中搜索，得到LCP16/17基因片段；
步骤（2）、根据已知的LCP16/17基因片段，使用primer premier 5.0软件设计上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.3:ATGAAATCGATCGTATTAAT；
SEQ ID NO.4:TTATTGGACCTTTGGGATGG；
步骤（3）、提取二化螟三龄幼虫的总RNA并反转录成cDNA模板；
步骤（4）、经PCR扩增反应获得二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列，过程为：
使用步骤（3）得到的cDNA模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物，通过PCR扩增获得表皮蛋白基因LCP16/17全长片段；
通过MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）将上述PCR产物纯化，将纯化后的产物连接到pEASY-T3 Cloning Kit（Transfer 公司）,转入感受态细胞中，复苏，涂板，挑菌检测后，将菌液送往擎科生物（中国）有限公司测序，得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列；该二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的核苷酸序列为330bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，二化螟表皮蛋白基因LCP16/17对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；
步骤（5）、根据已知二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的核苷酸序列，通过Primer 5.0软件设计含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO.6和下游引物SEQ ID NO.7；
SEQ ID NO.6:TAATACGACTCACTATAGGGCAGCGAGTTCGACCAACAAC；
SEQ ID NO.7:TAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGTATCCGGTCTCATC；
步骤（6）、以步骤（3）获得的cDNA模板，用上述合成的含有T7启动子序列的上游引物SEQ ID NO.6和下游引物SEQ ID NO.7进行PCR扩增；得到一段长度为216bp基因片段；经试剂盒纯化后按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit（Thermo FisherScientific）试剂盒说明体外转录合成得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的靶向dsRNA；得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的靶向dsRNA，该靶向dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示序列；
步骤（7）、将高效树突化聚合纳米载体与dsRNA混合，得到用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂；
RNA制剂中，dsRNA与纳米载体的电荷比为1:1-1:200之间。
高效树突化聚合纳米载体是按照Jessica A. Kretzmann, Cameron W. Evans,Marck Norret, Pilar Blancafort, K. Swaminathan Iyer于2018年发表在Methods inMolecular Biology（分子生物学方法）1767卷上的文章“Non-viral Methodology forEfficient Co-transfection.（高效共转染的非病毒方法学）”所述方法合成高效树突化聚合纳米载体。
步骤（3）中，提取二化螟三龄幼虫的总RNA并反转录成cDNA模板的制备过程如下：
选取生长健康、大小一致的三龄二化螟幼虫，放入液氮冷冻；依照Takara Trizol试剂盒提取总RNA，并使用M-MLV反转录酶将所提取的总RNA反转录成第一链cDNA，从而获得PCR反应所需cDNA模板。
步骤（4）中，得到的二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列，该氨基酸序列是对SEQ IDNO.1进行生物信息学分析后预测得到；生物信息学分析表明二化螟表皮蛋白基因LCP16/17编码110个氨基酸，预测等电点为5.24，蛋白分子量为27.0kDa。
步骤（4）中，PCR体系为：2×Fast Taq酶 12.5 μL， Forward Primer 1μL，ReversePrimer 1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 9.5μL，总体积为25μL；
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min，PCR产物置于-20℃冰箱保存。
步骤（6）中，PCR扩增的体系为：2×Fast Taq酶 25μL， Forward Primer 2 μL ，Reverse Primer 2μL ，cDNA 1μL， ddH2O 20μL，总体积为50μL；
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min；
采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）将上述PCR产物纯化，按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific）试剂盒说明体外转录合成dsRNA（dsCsLCP16/17），并用NanoPhotometer微量分光光度计检测dsRNA浓度，保存于超低温冰箱备用。
一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂在防控二化螟的应用，其特征是，将dsLCP16/17与纳米载体混合，通过点滴体表递送到二化螟体内，采用不靶向二化螟任何基因的dsEGFP和空白对照组作为dsLCP16/17的阴性对照；
选取45头生长健康、大小一致的一龄幼虫进行实验；每个处理组2.5μg dsLCP16/17，将dsLCP16/17与纳米载体按比例混合，室温孵育15min，将混合液滴到幼虫背部，处理15min，每48h处理一次，连续处理三次，设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；同时选取90头虫设立dsRNA对照组和空白对照组，dsEGFP与纳米载体的用量与处理组相同，同样设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；将处理后的二化螟置于28℃恒温培养箱中饲养，培养箱中，光照：黑暗时间=16h：8h，温度28±1℃，相对湿度70±5%，处理和对照组每天饲喂新鲜的人工饲料；每天观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况；
干扰后24h提取处理组和对照组的二化螟虫体总RNA，其中，对照组包括dsEGFP对照组和空白对照组，Takara反转录试剂盒合成cDNA，采用Real-timePCR方法分别检测目的基因CsLCP16/17和管家基因EF1-a的相对表达量，计算其沉默效率；
与对照组相比，纳米载体经皮递送dsLCP16/17显著抑制了LCP16/17基因的表达量；表明该dsRNA片段可显著沉默靶基因CsLCP16/17的表达水平，dsRNA片段有效，可用于后续研究；
观察点滴处理后的二化螟生长情况，统计钻蛀情况，与对照组相比，点滴RNAi处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低46.3%；与对照组基因EGFP dsRNA相比，点滴RNAi处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低29%。因此，RNA干扰序列及基于纳米载体的点滴RNAi方法可应用于二化螟的绿色防控。
步骤（7）中，dsRNA与纳米载体的电荷比比例为1:64；
使用时，采取点滴二化螟体表的方法，将干扰LCP16/17基因的RNA制剂递送至二化螟体内，点滴处理二化螟一龄幼虫，连续处理4次，每48h处理一次，观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
由以上技术方案可知，本发明首先从二化螟中克隆二化螟表皮蛋白基因LCP16/17，并对二化螟表皮蛋白基因LCP16/17设计引物，合成了用于干扰二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的dsRNA，并创建了使用纳米载体递送dsRNA的体系，通过点滴体表将dsRNA递送到虫体内对二化螟表皮蛋白基因LCP16/17进行干扰。结果表明：dsRNA注射二化螟后，发现二化螟钻蛀行为改变，显著减少了钻蛀行为的发生，对二化螟的防治具有重要作用。本发明为害虫的分子调控提供了新的方法，也为深入理解昆虫生长发育机制、创制新的生物农药制剂提供理论基础。
附图说明
图1为显示点滴LCP16/17基因的dsRNA后，二化螟LCP16/17基因的沉默效率；其中，dsLCP16/17表示点滴LCP16/17基因dsRNA的处理组；dsEGFP表示点滴EGFP基因dsRNA的对照组；CK表示空白对照组；
图2为显示点滴LCP16/17基因的dsRNA对二化螟钻蛀行为的改变；其中，dsLCP16/17表示点滴LCP16/17基因dsRNA的处理组；dsEGFP表示点滴EGFP基因dsRNA的对照组；CK表示空白对照组。
具体实施方式
下面结合本发明实施例和附图，对本发明的技术方案进行具体、详细的说明，但并不用以限制本发明。
实施例1
二化螟表皮蛋白基因LCP16/17（CsLCP16/17）cDNA全长序列获得及其氨基酸序列分析；
1、二化螟表皮蛋白基因LCP16/17cDNA片段获得；
根据已知昆虫CPR家族蛋白序列保守区（motif），运用生物信息学分析方法在二化螟转录组数据库中搜索，得到LCP16/17基因片段。
2、二化螟表皮蛋白基因LCP16/17cDNA全长序列获得；
1）PCR扩增所需引物设计；
根据已知的LCP16/17基因片段，使用Primer 5.0软件设计上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4，引物由擎科生物（中国）有限公司合成。
2）PCR扩增所需模板制备；
选取生长健康、大小一致的三龄二化螟幼虫，放入液氮冷冻。依照Takara Trizol试剂盒提取总RNA，并使用M-MLV反转录酶将所提取的总RNA反转录成第一链cDNA，从而获得PCR反应所需模板。
3）PCR扩增反应
采用前面步骤获得的模板和引物，通过PCR扩增获得表皮蛋白基因LCP16/17全长片段。
PCR体系为：2×Fast Taq酶 12.5 μL， Forward Primer 1μL ，Reverse Primer 1μL ，cDNA 1 μL， ddH2O 9.5 μL，总体积为25 μL。
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min，PCR产物置于-20℃冰箱保存。
通过MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）将上述PCR产物纯化，将纯化后的产物连接到pEASY-T3 Cloning Kit（Transfer 公司）,转入感受态细胞中，复苏，涂板，挑菌检测后，将菌液送往擎科生物（中国）有限公司测序，得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。
3、二化螟表皮蛋白基因LCP16/17氨基酸序列分析；
利用在线软件ExPASy分析结果显示，CsLCP16/17编码110个氨基酸，预测等电点为5.24，蛋白分子量为27.0kDa。测序得到氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的序列。
实施例2
二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的靶向dsRNA的合成：
1、二化螟表皮蛋白基因LCP16/17靶向dsRNA引物的设计；
基于二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列，运用Primer 5.0软件设计其靶向dsRNA引物，在引物5’端加上T7启动子。引物的序列如下：
SEQ ID NO.6：TAATACGACTCACTATAGGGCAGCGAGTTCGACCAACAAC
SEQ ID NO.7：TAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGTATCCGGTCTCATC
2、二化螟表皮蛋白基因LCP16/17特异性dsRNA合成；
以前面步骤获得cDNA为模板，用上述合成的含有T7启动子序列的上下游引物进行PCR扩增。得到一段长度为216bp基因片段（SEQ ID NO.5）。
PCR扩增的体系为：2×Fast Taq酶 25μL， Forward Primer 2 μL ，ReversePrimer 2μL ，cDNA 1μL， ddH2O 20μL，总体积为50μL。
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）将上述PCR产物纯化，按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific）试剂盒说明体外转录合成dsRNA（dsCsLCP16/17），并用NanoPhotometer微量分光光度计检测dsRNA浓度，保存于超低温冰箱备用。
实施例3
一种dsLCP16/17在防控二化螟的应用，为了验证本发明制备的dsLCP16/17对LCP16/17基因的干扰效果，将dsLCP16/17与纳米载体混合，通过点滴体表递送到二化螟体内。采用不靶向二化螟任何基因的dsEGFP和空白对照组作为dsLCP16/17的阴性对照。
选取45头生长健康、大小一致的一龄幼虫进行实验。每个处理组2.5μg dsLCP16/17，将dsLCP16/17与纳米载体按比例混合，室温孵育15min，将混合液滴到幼虫背部，处理15min，每48h处理一次，连续处理三次，设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；同时选取90头虫设立dsRNA对照组和空白对照组，dsEGFP与纳米载体的用量与处理组相同，同样设置三个生物重复，每个生物重复15头虫。将处理后的二化螟置于28℃恒温培养箱中饲养（光照：黑暗时间=16h：8h，温度28±1℃，相对湿度70±5%），处理和对照组每天饲喂新鲜的人工饲料。每天观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况。
干扰后24h提取处理组和对照组（dsEGFP对照组和空白对照组）的二化螟虫体总RNA，Takara反转录试剂盒合成cDNA，采用Real-timePCR方法分别检测目的基因(CsLCP16/17)和管家基因(EF1-a)的相对表达量，计算其沉默效率。
如图1所示，与对照组相比，纳米载体经皮递送dsLCP16/17显著抑制了LCP16/17基因的表达量。表明该dsRNA片段可显著沉默靶基因(CsLCP16/17)的表达水平，dsRNA片段有效，可用于后续研究。
观察点滴处理后的二化螟生长情况，统计钻蛀情况，如图2所示，与对照组相比，点滴RNAi处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低46.3%；与对照组基因EGFP dsRNA相比，点滴RNAi处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低29%。因此，本发明提供的RNA干扰序列及基于纳米载体的点滴RNAi方法可应用于二化螟的绿色防控。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 二化螟(Chilo suppressalis)
<400> 1
atgaaatcga tcgtattaat cgcccttttc gtggctgtcg ccgccgccct ccccgtggag 60
caggagcccg tgaagatcct tcgcagcgag ttcgaccaac aacccgaggg aggatacgcg 120
ttcagctttg agactgagga tggtgttgaa cggtctgaaa atggagaagt gaagcaggct 180
gttgatgagg aaaacaagcc ccatgacgtc gttgtagtac gtggctccta ctcctacacc 240
aaccctgacg gccagaagga gagcgtctct tactacgctg atgagaccgg ataccacgcg 300
gagggtgact ccatcccaaa ggtccaataa 330
<210> 2
<211> 109
<212> PRT
<213> 二化螟(Chilo suppressalis)
<400> 2
Met Lys Ser Ile Val Leu Ile Ala Leu Phe Val Ala Val Ala Ala Ala
1 5 10 15
Leu Pro Val Glu Gln Glu Pro Val Lys Ile Leu Arg Ser Glu Phe Asp
20 25 30
Gln Gln Pro Glu Gly Gly Tyr Ala Phe Ser Phe Glu Thr Glu Asp Gly
35 40 45
Val Glu Arg Ser Glu Asn Gly Glu Val Lys Gln Ala Val Asp Glu Glu
50 55 60
Asn Lys Pro His Asp Val Val Val Val Arg Gly Ser Tyr Ser Tyr Thr
65 70 75 80
Asn Pro Asp Gly Gln Lys Glu Ser Val Ser Tyr Tyr Ala Asp Glu Thr
85 90 95
Gly Tyr His Ala Glu Gly Asp Ser Ile Pro Lys Val Gln
100 105
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaatcga tcgtattaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttattggacc tttgggatgg 20
<210> 5
<211> 216
<212> DNA
<213> 二化螟(Chilo suppressalis)
<400> 5
cagcgagttc gaccaacaac ccgagggagg atacgcgttc agctttgaga ctgaggatgg 60
tgttgaacgg tctgaaaatg gagaagtgaa gcaggctgtt gatgaggaaa acaagcccca 120
tgacgtcgtt gtagtacgtg gctcctactc ctacaccaac cctgacggcc agaaggagag 180
cgtctcttac tacgctgatg agaccggata ccacgc 216
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg cagcgagttc gaccaacaac 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatacgact cactataggg gcgtggtatc cggtctcatc 40
Claims (7)
1.一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，包括以下步骤：
步骤（1）、根据已知昆虫CPR家族蛋白序列保守区motif，运用生物信息学分析方法在二化螟转录组数据库中搜索，得到LCP16/17基因片段；
步骤（2）、根据已知的LCP16/17基因片段，使用primer premier 5.0软件设计上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；
SEQ ID NO.3:ATGAAATCGATCGTATTAAT；
SEQ ID NO.4:TTATTGGACCTTTGGGATGG；
步骤（3）、提取二化螟三龄幼虫的总RNA并反转录成cDNA模板；
步骤（4）、经PCR扩增反应获得二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列，过程为：
使用步骤（3）得到的cDNA模板，以SEQ ID NO.3为上游引物、SEQ ID NO.4为下游引物，通过PCR扩增获得表皮蛋白基因LCP16/17全长片段；
通过MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）将上述PCR产物纯化，将纯化后的产物连接到pEASY-T3 Cloning Kit（Transfer 公司）,转入感受态细胞中，复苏，涂板，挑菌检测后，将菌液测序，得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列；该二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的核苷酸序列为330bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，二化螟表皮蛋白基因LCP16/17对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；
步骤（5）、根据已知二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的核苷酸序列，通过Primer 5.0软件设计含有T7启动子的上游引物SEQ ID NO.6和下游引物SEQ ID NO.7；
SEQ ID NO.6:TAATACGACTCACTATAGGGCAGCGAGTTCGACCAACAAC；
SEQ ID NO.7:TAATACGACTCACTATAGGGGCGTGGTATCCGGTCTCATC；
步骤（6）、以步骤（3）获得的cDNA模板，用上述合成的含有T7启动子序列的上游引物SEQID NO.6和下游引物SEQ ID NO.7进行PCR扩增；得到一段长度为216bp基因片段；经试剂盒纯化后按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit（Thermo FisherScientific）试剂盒说明体外转录合成得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的靶向dsRNA；得到二化螟表皮蛋白基因LCP16/17的靶向dsRNA，该靶向dsRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示序列；
步骤（7）、将高效树突化聚合纳米载体与dsRNA混合，得到用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂；
RNA制剂中，dsRNA与纳米载体的电荷比为1:1-1:200之间。
2.根据权利要求1所述的一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，步骤（3）中，提取二化螟三龄幼虫的总RNA并反转录成cDNA模板的制备过程如下：
选取生长健康、大小一致的三龄二化螟幼虫，放入液氮冷冻；依照Takara Trizol试剂盒提取总RNA，并使用M-MLV反转录酶将所提取的总RNA反转录成第一链cDNA，从而获得PCR反应所需cDNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，步骤（4）中，得到的二化螟表皮蛋白基因LCP16/17序列，该氨基酸序列是对SEQ ID NO.1进行生物信息学分析后预测得到；生物信息学分析表明二化螟表皮蛋白基因LCP16/17编码109个氨基酸，预测等电点为5.24，蛋白分子量为27.0kDa。
4.根据权利要求1所述的一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，步骤（4）中，PCR体系为：2×Fast Taq酶 12.5 μL， Forward Primer 1μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 9.5μL，总体积为25μL；
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸10min，PCR产物置于-20℃冰箱保存。
5.根据权利要求1所述的一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，步骤（6）中，PCR扩增的体系为：2×Fast Taq酶 25μL， Forward Primer 2 μL ，Reverse Primer 2μL ，cDNA 1μL， ddH2O 20μL，总体积为50μL；
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min；
采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）将上述PCR产物纯化，按照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific）试剂盒说明体外转录合成dsRNA（dsCsLCP16/17），并用NanoPhotometer微量分光光度计检测dsRNA浓度，保存于超低温冰箱备用。
6.权利要求1-5任意一项权利要求所述的一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂在防控二化螟的应用，其特征是，将dsLCP16/17与纳米载体混合，通过点滴体表递送到二化螟体内，采用不靶向二化螟任何基因的dsEGFP和空白对照组作为dsLCP16/17的阴性对照；
选取45头生长健康、大小一致的一龄幼虫进行实验；每个处理组2.5μg dsLCP16/17，将dsLCP16/17与纳米载体按比例混合，室温孵育15min，将混合液滴到幼虫背部，处理15min，每48h处理一次，连续处理三次，设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；同时选取90头虫设立dsRNA对照组和空白对照组，dsEGFP与纳米载体的用量与处理组相同，同样设置三个生物重复，每个生物重复15头虫；将处理后的二化螟置于28℃恒温培养箱中饲养，培养箱中，光照：黑暗时间=16h：8h，温度28±1℃，相对湿度70±5%，处理和对照组每天饲喂新鲜的人工饲料；每天观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况；
干扰后24h提取处理组和对照组的二化螟虫体总RNA，其中，对照组包括dsEGFP对照组和空白对照组，Takara反转录试剂盒合成cDNA，采用Real-timePCR方法分别检测目的基因CsLCP16/17和管家基因EF1-a的相对表达量，计算其沉默效率；
与对照组相比，纳米载体经皮递送dsLCP16/17显著抑制了LCP16/17基因的表达量；表明该dsRNA片段可显著沉默靶基因CsLCP16/17的表达水平，dsRNA片段有效，可用于后续研究；
观察点滴处理后的二化螟生长情况，统计钻蛀情况，与对照组相比，点滴RNAi处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低46.3%；与对照组基因EGFP dsRNA相比，点滴RNAi处理组的二化螟钻蛀虫数比率降低29%；因此，RNA干扰序列及基于纳米载体的点滴RNAi方法可应用于二化螟的绿色防控。
7.根据权利要求1所述的一种用于抑制二化螟钻蛀行为的RNA制剂，其特征是，步骤（7）中，dsRNA与纳米载体的电荷比比例为1:64；
使用时，采取点滴二化螟体表的方法，将干扰LCP16/17基因的RNA制剂递送至二化螟体内，点滴处理二化螟一龄幼虫，连续处理4次，每48h处理一次，观察二化螟幼虫生长发育状况，统计二化螟幼虫钻蛀饲料的情况。
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|---|---|---|---|---|
| CN114854750A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-08-05 | 扬州大学 | 一种抑制二化螟幼虫头壳发育的干扰rna、试剂盒及使用方法 |
-
2021
- 2021-09-24 CN CN202111123788.1A patent/CN113789329A/zh not_active Withdrawn
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN114854750A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-08-05 | 扬州大学 | 一种抑制二化螟幼虫头壳发育的干扰rna、试剂盒及使用方法 |
| CN114854750B (zh) * | 2022-05-12 | 2024-04-09 | 扬州大学 | 一种抑制二化螟幼虫头壳发育的干扰rna、试剂盒及使用方法 |
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