CN113788960A - 一种高力学强度聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于关节软骨替代材料领域，提供了一种高力学强度聚乙烯醇‑丙烯酰胺‑琼脂糖水凝胶的制备方法。以聚乙烯醇和丙烯酰胺为基质材料，加入少量琼脂糖。丙烯酰胺通过化学交联剂先形成第一网络，聚乙烯醇在冷冻循环中物理交联形成第二网络。琼脂糖可以与聚乙烯醇和丙烯酰胺的分子链形成氢键，进一步提高水凝胶的机械强度。此外，琼脂糖的引入使水凝胶能够粘附软骨细胞并促进软骨细胞增殖。该方法制备的水凝胶有望应用于关节软骨置换。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，特别是关节软骨损伤的替代材料领域，具体涉及一种高力学强度的聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶材料具有高含水率、低摩擦系数、良好的化学稳定性等特点，有望用于生物组织损伤的修复。但是传统水凝胶通常由亲水聚合物的单一网络组成，力学性能差，难以满足关节软骨高力学强度的要求，限制了水凝胶在关节软骨替代材料领域的应用。与此同时，作为关节软骨替代材料还必须具有良好的生物相容性。在水凝胶中添加大量生物活性成分(如明胶、胶原蛋白、生长因子等)可以有效提高水凝胶材料的生物相容性，但这些材料的引入，通常会导致水凝胶的力学性能大幅下降。研发兼具优异力学性能和良好生物相容性的水凝胶材料仍然是一个巨大的挑战。
前人的研究表明，双网络结构可以有效提升水凝胶力学性能。聚乙烯醇水凝胶有相对较高的力学性能，而丙烯酰胺由于结构中含有大量的酰胺基，易形成氢键，适合作为共价交联网络的组分，因此聚乙烯醇-丙烯酰胺(PVA-AAm)双网络水凝胶体系成为研发高力学强度水凝胶领域的热点。尽管双网络结构可提升水凝胶材料的力学性能，但现有PVA-AAm双网络水凝胶的力学性能与关节软骨的力学性能仍有差距(Journal of MaterialsScience,2019,54,3368-3382；Journal of Materials Chemistry A,2020，8，6776-6784；Materials Letters,2018,207,53-56)。作为关节软骨材料替代材料，力学性能需要同时满足如下条件：压缩模量>0.53MPa,压缩强度>4MPa，拉伸强度>0.8MPa。此外，目前报道的这些聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶材料的生物相容性仍不明确。
本发明将琼脂糖(AG)引入聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶体系，其作用包括两方面：(1)琼脂糖可与水凝胶中聚乙烯醇、丙烯酰胺大分子链产生强氢键作用，提升水凝胶的力学性能，(2)琼脂糖具有良好的生物相容性，琼脂糖的引入可以提高水凝胶对细胞的粘附能力，促进水凝胶的生物相容性。本发明的水凝胶在压缩和拉伸两方面都表现出优异的力学性能，具有0.9MPa的压缩模量和8.17MPa的压缩极限，同时具有0.97MPa的杨氏模量和2.45MPa的拉伸极限，满足关节软骨替代材料的性能需求。此外，细胞实验表明研发的水凝胶具有良好的软骨细胞黏附性和促进细胞增殖的能力。发明的水凝胶有望应用于关节软骨损伤的替代材料。
发明内容
针对聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶力学性能差、生物相容性不佳等问题，本发明提供一种聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖(PVA-AAm-AG)水凝胶的制备方法。采用聚乙烯醇和丙烯酰胺为基体材料，通过化学交联与物理交联的冷冻解冻法结合交联成胶，该制备方法操作简单，成胶速度快，成胶后胶体力学强度优异。琼脂糖可与聚乙烯醇和丙烯酰胺的大分子链产生强氢键作用，提升水凝胶的力学性能。而且，由于在水凝胶中引入天然多糖，制备的水凝胶表现出良好的生物相容性，有望在关节软骨替代材料领域获得应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种高力学强度聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将聚乙烯醇、丙烯酰胺、琼脂糖、化学交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(NNMBA)按比例加入去离子水中，90-99℃恒温水浴加热，持续搅拌至聚乙烯醇完全溶解且其余物质均匀混合，得到混合液A；，在混合液A中，聚乙烯醇的质量分数为10～20wt.％，丙烯酰胺的质量分数为10～20wt.％，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的质量分数0.1～0.5wt.％，琼脂糖的质量分数为0.5～5wt.％；
第二步，将混合液A置于室温下持续搅拌，温度降至20～50℃后备用；在上述混合液A中加入四甲基乙二胺(TEMED)，持续搅拌至混合均匀，后在冰水浴环境下加入饱和过硫酸铵(APS)水溶液，得到混合溶液B；每100mL混合液A中，加入100～400μL四甲基乙二胺，加入3～6mL饱和过硫酸铵溶液；
第三步，将混合液B倒入模具中，对其进行冷冻解冻循环，得到聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶；冷冻解冻循环指混合液B冷冻成型后取出解冻，重复多次至形成PVA-AAm-AG水凝胶；冷冻温度为-18～-25℃，冷冻时间为12～20h，解冻温度为15～25℃，解冻时间为6～12h；循环2次以上。
本发明提出的聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶的成胶机理：将聚乙烯醇、丙烯酰胺两种基体混合加热溶解后，丙烯酰胺通过化学交联剂先形成第一网络，聚乙烯醇在冷冻循环中物理交联形成第二网络，两种基体在成胶后，形成互穿网络，该结构具有单网络水凝胶所不具备的结构优势，且两种基体的大分子链之间会反应产生共价键交联，进一步强化了水凝胶的力学性能。琼脂糖是一种天然多糖，可以与聚乙烯醇和丙烯酰胺的大分子链形成氢键，促进水凝胶分子链的聚集，提升了材料的力学强度。通过多次冷冻解冻循环，使水凝胶的结构进一步优化，大幅提升水凝胶的力学性能。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提出PVA-AAm-AG水凝胶的制备方法，通过引入琼脂糖，增强了水凝胶的力学性能，同时改善了水凝胶的生物相容性。本发明提出的方法操作简单，对聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶力学性能提升效果明显，同时，本方法制备得到水凝胶可以粘附软骨细胞，促进软骨细胞增殖，有利于其在关节软骨替代材料领域中的应用。
附图说明
图1为PVA-AAm-AG水凝胶制备流程图；
图2为PVA-AAm-AG水凝胶扫描电镜形貌图；
图3为PVA-AAm-AG水凝胶压缩模量图；
图4为PVA-AAm-AG水凝胶对软骨细胞的吸附率
图5为PVA-AAm-AG水凝胶接种细胞的增殖率图。
具体实施方式
以下将结合技术实现方案和附图说明中的图1、图2和图3，详细介绍本发明的具体实施方式。
图1是PVA-AAm-AG水凝胶制备流程图，按照流程图操作可制备得到PVA-AAm-AG水凝胶。图2是所制备水凝胶的微观形貌，将制备的水凝胶切成薄片，冷冻真空干燥后观察水凝胶的断面结构。图3是所制备水凝胶的压缩性能图，对圆柱形水凝胶样品(直径：15.3mm)进行无侧限单轴压缩试验，应变速率为30％/min。测试前用游标卡尺测量每个样品的厚度。在测试之前，顶部和底部平台用生理盐水润滑，以接近纯滑动状态，选取应变0.1-0.2段计算割线压缩模量。从图中可以看出，相比于同等浓度的纯PVA水凝胶和纯丙烯酰胺水凝胶，本方法制备所得的PVA-AAm-AG水凝胶压缩模量大幅提升，可以满足关节软骨替代材料所需的力学性能。图4是软骨细胞黏附率，以无琼脂糖的水凝胶在4小时后的黏附情况作为归一化的标准。将大鼠的关节软骨细胞重悬在培养基中，接种在水凝胶上，培养4小时后取出水凝胶并冲洗表面，通过CCK-8法检测水凝胶表面黏附的细胞含量。继续将接种有大鼠软骨细胞的水凝胶在二氧化碳培养箱中培养7天，在不同的时间间隔取出水凝胶，通过CCK-8法检测细胞在水凝胶的增殖情况。从图中可以看出，添加琼脂糖后，水凝胶黏附细胞的能力大大增加。图5是软骨细胞增殖率图，以无琼脂糖的水凝胶在1天后的软骨细胞增殖情况作为归一化的标准，可以发现在添加琼脂糖之后，软骨细胞在水凝胶中的增殖率有显著提升。
实施例1
a)将10g PVA、10gAAm、0.5g琼脂糖、0.1gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺加入79mL去离子水中，90℃恒温水浴加热，搅拌至PVA完全溶解，得到混合液A。
b)将混合液A置于室温下持续搅拌，温度降至20℃后备用。将100μL四甲基乙二胺逐滴加入上述混合液A，在冰水浴环境下加入3mL过硫酸铵饱和溶液，搅拌得到混合液B。
c)将混合液B倒入模具中，进行循环冷冻解冻，冷冻温度为-18℃，冷冻时间为12h，解冻温度为15℃，解冻时间为6h。循环次数为2次，得到聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶。
基于上述步骤制备的PVA-AAm-AG水凝胶，开展形貌观察、力学性能、生物相容性实验。具体步骤如下：
1)形貌观察：将制备的水凝胶用液氮冷冻后淬断，进行冷冻真空干燥处理，使用扫描电镜对其淬断面形貌进行观察。
2)力学性能实验：将制备的圆柱形水凝胶样品(直径：15.3mm)进行无侧限单轴压缩试验，应变速率为30％/min。测试前用游标卡尺测量每个样品的厚度。
3)生物相容性实验：将大鼠的关节软骨细胞重悬在培养基中，接种在水凝胶上，培养4小时后取出水凝胶并冲洗表面，通过CCK-8法检测水凝胶表面黏附的细胞含量。继续将接种有大鼠软骨细胞的水凝胶在二氧化碳培养箱中培养7天，在不同的时间间隔取出水凝胶，通过CCK-8法检测细胞在水凝胶的增殖情况。
实施例2
a)将20g PVA、20gAAm、5g琼脂糖、0.5gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺加入55mL去离子水中，99℃恒温水浴加热，搅拌至PVA完全溶解，得到混合液A。
b)将混合液A置于室温下持续搅拌，温度降至50℃后备用。将200μL四甲基乙二胺逐滴加入上述混合液A，在冰水浴环境下加入6mL过硫酸铵饱和溶液，搅拌得到混合液B。
c)将混合液B倒入模具中，进行循环冷冻解冻，冷冻温度为-25℃，冷冻时间为20h，解冻温度为25℃，解冻时间为12h。循环次数为4次，得到聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶。
基于上述步骤制备的PVA-AAm-AG水凝胶，开展形貌观察、力学性能、生物相容性实验，具体步骤如实施例1。
实施例3
a)将15g PVA、15gAAm、2.5g琼脂糖、0.25gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺加入67mL去离子水中，95℃恒温水浴加热，搅拌至PVA完全溶解，得到混合液A。
b)将混合液A置于室温下持续搅拌，温度降至35℃后备用。将450μL四甲基乙二胺逐滴加入上述混合液A，在冰水浴环境下加入4.5mL过硫酸铵饱和溶液，搅拌得到混合液B。
c)将混合液B倒入模具中，进行循环冷冻解冻，冷冻温度为-22℃，冷冻时间为16h，解冻温度为20℃，解冻时间为9h。循环次数为3次，得到聚乙烯醇-丙烯酰胺水凝胶。
基于上述步骤制备的PVA-AAm-AG水凝胶，开展形貌观察、力学性能、生物相容性实验，具体步骤如实施例1。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种高力学强度聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将聚乙烯醇、丙烯酰胺、琼脂糖、化学交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺按比例加入去离子水中，90-99℃恒温水浴加热，持续搅拌至聚乙烯醇完全溶解且其余物质均匀混合，得到混合液A；在混合液A中，聚乙烯醇的质量分数为10～20wt.％，丙烯酰胺的质量分数为10～20wt.％，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的质量分数0.1～0.5wt.％，琼脂糖的质量分数为0.5～5wt.％；
第二步，将混合液A置于室温下持续搅拌，温度降至20～50℃后备用；在上述混合液A中加入四甲基乙二胺，持续搅拌至混合均匀，后在冰水浴环境下加入饱和过硫酸铵水溶液，得到混合溶液B；每100mL混合液A中，加入100～400μL四甲基乙二胺，加入3～6mL饱和过硫酸铵溶液；
第三步，将混合液B倒入模具中，对其进行冷冻解冻循环，得到聚乙烯醇-丙烯酰胺-琼脂糖水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的冷冻解冻循环指混合液B冷冻成型后取出解冻，重复多次至形成PVA-AAm-AG水凝胶；冷冻温度为-18～-25℃，冷冻时间为12～20h，解冻温度为15～25℃，解冻时间为6～12h；循环2次以上。
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