CN113759112A - 一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于脑特异性蛋白产物9.5保存技术领域，具体涉及一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法。所述冻干方法包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，所述缓冲液的组成包括以下组分：4‑吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖。能够有效保存脑特异性蛋白产物9.5，冻干品复融后可有效保存其活性，提高检测灵敏度；所述冻干保护方法对脑特异性蛋白产物9.5的保存具有较好的保存效果，可以使得PGP9.5在4‑8℃储存期达到18个月、在‑20℃储存期达到3年。

Description

一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法
技术领域
本发明属于脑特异性蛋白产物9.5保存技术领域，具体涉及一种缓冲液及脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法。
背景技术
泛素-蛋白酶体途径是调控细胞内蛋白活性的一个重要途径。其调控的对象主要是细胞内结构受损或需要及时清除的功能蛋白。泛素-蛋白酶体途径的调节与细胞周期、信号转导、发育分化、物质代谢等很多过程密切相关，目前认为泛素-蛋白酶体***主要通过泛素化酶和去泛素化酶来实现对目的蛋白快速精确的调控。
脑特异性蛋白产物9.5(protein gene product 9.5，PGP9.5)，又名泛素羧基端水解酶(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase，UCH-L1)，是由223个氨基酸组成的一类半胱氨酸水解酶，分子量约为24800Da。UCH-L1在TBI发生后的1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清UCH-L1显著升高。对TBI的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。如中国专利申请CN201880020489.5公开的使用早期生物标记物泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)帮助诊断和评价已遭受或可能已遭受对头部的损伤、诸如轻度或中度至重度创伤性脑损伤(TBI)的人类受试者的方法。在此还公开了帮助基于UCH-L1的水平确定已遭受或可能已遭受对头部的损伤的受试者是否将受益于并因此接受头部计算机断层(CT)扫描的方法。这些方法涉及在人类受试者已遭受或可能已遭受对头部的损伤后24小时内的时间点取自所述受试者的一个或多个样品中检测UCH-L1的水平和UCH-L1水平的变化。
因此，泛素羧基端水解酶的保存具有及其重要的意义。但现有技术中并没有针对性的保存方法，现有方法中，并不能很好地提高泛素羧基端水解酶的保存效果，其复融后的活性以及检查灵敏度等性能均受到不同程度的影响。
本发明的目的旨在提供一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，以提高使脑特异性蛋白产物9.5的保存活性，以期更好的发展脑特异性蛋白产物9.5的检测技术。
发明内容
为克服以上技术问题，本发明提供了一种缓冲液，该缓冲液能够有效提高PGP9.5的活性、提高抗原冻干品的检测灵敏度，同时能够有效延长PGP9.5的保存期限。
为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液包括以下组分：4-吗啉乙磺酸、NaCl(氯化钠)、ZnCl2(氯化锌)、MgCl2·6H2o(六水合氯化镁)、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖。
优选地，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸5-30份、NaCl8-12份、ZnCl2 0.01-0.5份、MgCl2·6H2o 0.1-15份、牛血清白蛋白2-50份、酪蛋白2-50份、甘氨酸1-15份、聚乙二醇0.2-25份、海藻糖10-100份。
优选地，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10-20份、NaCl 9-10份、ZnCl2 0.01-0.1份、MgCl2·6H2o 0.1-5份、牛血清白蛋白5-10份、酪蛋白5-10份、甘氨酸1-5份、聚乙二醇0.2-5份、海藻糖10-30份。
优选地，所述缓冲液中还包括表面活性剂。
优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80中的任一种或多种，优选为吐温20；
优选地，所述缓冲液的pH值为5.8-7.5。
本发明的另一目的在于提供所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值并定容，过滤，即可。
优选地，所述表面活性剂在缓冲液中的体积分数为0.02-1％。
优选地，所述过滤使用0.2-0.5μm的滤膜进行，优选0.22μm的滤膜。
本发明的另一目的还在于提供所述缓冲液在保存脑特异性蛋白产物9.5中的应用。
本发明的目的还在于提供一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：将样品舱的真空度在降至0-5帕斯卡(pa)；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：将样品舱真空度维持在0-5pa；设置温度终点25℃，从-5℃提升至25℃；在25℃下持续保温。
优选地，步骤(1)，所述预冷冻段，
常温降温至4℃过程中，降温速率为1-5℃/min，在4℃保温10-30min，优选为30min；；
4℃降温至-40℃过程中，降温速率为0.4-1℃/min，在-40℃保温40-80min；优选为60min；
-40℃升温至-20℃过程中，升温速率为0.5-1℃/min，在-20℃保温30-60min；优选为30min；-20℃降温至-55℃过程中，降温速率为0.25-0.5℃/min，在-55℃保温100-150min，优选为120min；
优选地，步骤(2)，所述升华干燥段，
-55℃升至-40℃过程中，升温速率为0.5-1℃/min，在-40℃保温40-80min，优选为60min；
-40℃升温至-25℃过程中，升温速率为0.2-0.5℃/min，在-25℃保温80-100min，优选为90min；
-25℃升温至-15℃过程中，升温速率为0.25-0.5℃/min，在-15℃保温100-150min，优选为120min；
-15℃升温至-5℃过程中，升温速率为0.10-0.25℃/min，在-5℃保温100-150min，优选为120min；
优选地，步骤(3)中，所述解析干燥段，以5-10℃/h的升温速率将样本从-5℃提升至25℃；在25℃下持续保温时间为60-360分钟。
与现有技术比，本发明的技术优势在于：
(1)本发明提供了一种脑特异性蛋白产物9.5的保存方法，能够有效保存脑特异性蛋白产物9.5，能够使脑特异性蛋白产物9.5检测过程中的抗压冻干品复融后有效保存其活性，提高检测灵敏度。
(2)本发明提供的冻干保护方法对脑特异性蛋白产物9.5的保存具有较好的保存效果，可以使得PGP9.5在4-8℃储存期达到18个月、在-20℃储存期达到3年。
(3)本发明中4-吗啉乙磺酸、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖等组分具有较好的协同作用，能有效提高缓冲液的对脑特异性蛋白产物9.5的保存效果，提高生物活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl2 0.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；
冻干程序，如下表1：
表1实施例1的冻干程序
Figure BDA0003282419540000051
实施例2
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸20g、NaCl 10g、ZnCl2 0.01g、MgCl2·6H2o 5g、牛血清白蛋白5g、酪蛋白10g、甘氨酸1g、聚乙二醇5g、海藻糖10g，吐温60 0.2ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至5.8并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；
冻干程序，如下表2：
表2实施例2的冻干程序
Figure BDA0003282419540000061
实施例3
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸5g、NaCl 8g、ZnCl2 0.5g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白2g、酪蛋白15g、甘氨酸5g、聚乙二醇0.2g、海藻糖30g，吐温80 10ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.5并定容至1000ml，使用0.45μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；
冻干程序，如下表3：
表3实施例3的冻干程序
Figure BDA0003282419540000071
实施例4
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 12g、ZnCl2 0.01g、MgCl2·6H2o 10g、牛血清白蛋白13g、酪蛋白2g、甘氨酸1g、聚乙二醇7g、海藻糖10g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至7.0并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系升温至-20℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-25℃，保温；再升温至-15℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；
冻干程序，如下表4：
表4实施例4冻干程序
Figure BDA0003282419540000081
对比例1
与实施例1相比，区别在于将4-吗啉乙磺酸替换为三羟甲基氨基甲烷。
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：三羟甲基氨基甲烷10g、NaCl 9g、ZnCl2 0.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入三羟甲基氨基甲烷、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，区别在于将海藻糖替换为蔗糖。
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl2 0.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、蔗糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、蔗糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，区别在于将甘氨酸替换为甘油。
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl2 0.1g、MgCl2·6H2o 0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘油10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘油、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，区别在于将MgCl2·6H2o替换为酶法水解明胶。
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液，包括以下组分：包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10g、NaCl 9g、ZnCl2 0.1g、酶法水解明胶0.1g、牛血清白蛋白10g、酪蛋白5g、甘氨酸10g、聚乙二醇0.2g、海藻糖20g，吐温20 5ml。
所述缓冲液的制备方法，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、酶法水解明胶、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.5并定容至1000ml，使用0.22μm的滤膜过滤，即可。
所述脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，区别在于升温程序不同。
一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：调节样品舱的真空度；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：调节样品舱真空度；设置温度终点25℃；在25℃下持续保温；其中冻干程序，见下表：
表5对比例5冻干程序
Figure BDA0003282419540000101
效果评价
检测效果评价
使用实施例1-4及对比例1-5制成的缓冲液，配制不同浓度的PGP9.5冻干品，并进行冻干。免疫反应相关检测采用北京美联泰科生物技术有限公司自研的全自动化学发光免疫分析仪进行。
检测指标
1.含水量
取浓度为160pg/mL、1280pg/mL的冻干品各5瓶。将冻干品去除顶盖和胶塞后称重，记为M1n(n＝1、2、3……10)。将其在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，再次称重，记为M2n(n＝1、2、3……10)。将这些装有样品的冻干瓶将依次清洗干净，在200℃条件下进行烘干，直至质量不再发生变化为止，对这些冻干瓶依次称重，记为M3n(n＝1、2、3……10)。按公式进行计算含水量。冻干品含水量应小于2％。
含水量＝[(M1n-M3n)/(M2n-M3n)-1]×100％
使用上述方法测试实施例1-4及对比例5对应冻干品的平均含水量，结果见表6。
表6含水量
试验组 含水量％
实施例1 0.59
实施例2 1.15
实施例3 0.99
实施例4 1.42
对比例5 5.24
2.准确度
将浓度约为3000pg/mL(允许偏差±10％)的脑特异性蛋白产物9.5(PGP9.5)液(A)加入到浓度范围0pg/mL-80pg/mL的血清样本(B)中，所加入PGP9.5抗原与样本B之间的体积比例为1:9，使用冻干品和配套的脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒(磁微粒化学发光法)进行检测。根据下式计算回收率R，其回收率应在85％～115％范围内。
Figure BDA0003282419540000111
式中：R为回收率；V为样品A液的体积；V0为血清样品B液的体积；C为血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；C0为血清样品B液的3次测量平均值；CS为样品A液的浓度。
3.线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成5个浓度，分别为160pg/mL、320pg/mL、640pg/mL、1280pg/mL、2560pg/mL，。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。
按下式计算线性回归的相关系数(r)，在[80,2560]pg/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。
Figure BDA0003282419540000121
式中：r为相关系数；xi为稀释比例；yi为各个样本测定结果均值；
Figure BDA0003282419540000122
为稀释比例的均值；
Figure BDA0003282419540000123
为样本测定结果总均值。
4.重复性
重复测试浓度为320pg/mL的冻干品10次，计算10次测试结果的平均值
Figure BDA0003282419540000124
和标准差SD。
按下式计算变异系数(CV)，结果CV应≤8％。
Figure BDA0003282419540000125
式中：S为样本测试值的标准差；
Figure BDA0003282419540000126
为样本测试值的平均值。
5.灵敏度
将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值
Figure BDA0003282419540000127
和标准差(SD)。平均值
Figure BDA0003282419540000128
即为空白限，结果应＜80pg/mL的要求。
6.批间差
用3个批号的试剂盒分别重复测试浓度为640pg/mL的质控品10次。，计算30次测试结果的平均值
Figure BDA0003282419540000129
和标准差SD，根据下列公式得出变异系数(CV)，结果应≤15％。
Figure BDA00032824195400001210
式中：s为样本测试值的标准差；
Figure BDA00032824195400001211
为样本测试值的平均值。
采用以上方法对冻干品冻干保存0个月、18个月、20个月、36个月、39个月的各项性能指标进行评价，结果如下。
表7检测数据(常温0月)
Figure BDA00032824195400001212
Figure BDA0003282419540000131
表8稳定性效果数据(4-8℃保存18个月)
试验组 线性区间r 准确度％ 重复性CV 灵敏度(pg/mL)
实施例1 0.9961 88.56 6.27 62.99
实施例2 0.9958 87.61 8.61 76.90
实施例3 0.9962 91.93 8.50 70.48
实施例4 0.9955 94.14 4.39 75.88
对比例1 0.9632 83.41 20.72 190.22
对比例2 0.9638 84.67 16.77 177.58
对比例3 0.9725 81.58 17.59 191.85
对比例4 0.9693 83.63 22.53 128.19
对比例5 0.9673 74.67 19.29 205.74
表9稳定性效果数据(4-8℃保存20个月)
Figure BDA0003282419540000132
Figure BDA0003282419540000141
表10稳定性效果数据(-20℃保存36个月)
试验组 线性区间r 准确度％ 重复性CV 灵敏度(pg/mL)
实施例1 0.9973 87.88 7.26 65.06
实施例2 0.9906 85.47 6.68 70.31
实施例3 0.9915 86.69 7.33 64.69
实施例4 0.9932 88.81 7.15 77.73
对比例1 0.9854 78.33 11.95 106.67
对比例2 0.9796 84.08 13.67 129.84
对比例3 0.9826 79.57 19.36 149.01
对比例4 0.9722 75.04 14.64 170.61
对比例5 0.9759 83.35 14.68 151.95
表11稳定性效果数据(-20℃保存39个月)
Figure BDA0003282419540000142
Figure BDA0003282419540000151
由此可知，本发明提供的缓冲液及冻干方法能够有效保存PGP9.5，能够使胶质纤维酸性蛋白检测过程中的抗压冻干品复融后有效保存其活性，提高检测灵敏度。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种脑特异性蛋白产物9.5的冻干方法，包括以下步骤：取脑特异性蛋白产物9.5和缓冲液配制成溶液，设置冻干程序进行冻干，其中，所述缓冲液的组成包括以下组分：4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖。
2.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸5-30份、NaCl 8-12份、ZnCl2 0.01-0.5份、MgCl2·6H2o 0.1-15份、牛血清白蛋白2-50份、酪蛋白2-50份、甘氨酸1-15份、聚乙二醇0.2-25份、海藻糖10-100份。
3.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，按照重量份数计，所述缓冲液，包括以下组分：4-吗啉乙磺酸10-20份、NaCl 9-10份、ZnCl2 0.01-0.1份、MgCl2·6H2o 0.1-5份、牛血清白蛋白5-10份、酪蛋白5-10份、甘氨酸1-5份、聚乙二醇0.2-5份、海藻糖10-30份。
4.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，所述缓冲液中还包括表面活性剂，所述表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80中的任一种或多种，优选为吐温20。
5.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为5.8-7.5。
6.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：称取表面活性剂加入纯化水中，再依次加入4-吗啉乙磺酸、NaCl、ZnCl2、MgCl2·6H2o、牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸、聚乙二醇、海藻糖，搅拌至完全溶解，调节pH值并定容，过滤，即可。
7.如权利要求6所述的冻干方法，其特征在于，所述表面活性剂在缓冲液中的体积分数为0.02-1％；所述过滤使用0.2-0.5μm的滤膜进行，优选0.22μm的滤膜。
8.如权利要求1所述的冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预冷冻段：在常温下，将脑特异性蛋白产物9.5放入权利要求1-5任一所述的缓冲液中，制成含有脑特异性蛋白产物9.5的缓冲液体系，将缓冲液体系放置样品舱中，先将缓冲液体系降温至4℃，保温；再将缓冲液体系降温至-40℃，保温，再将缓冲液体系降温至-55℃，保温；
(2)升华干燥段：将样品舱的真空度降至0-5pa；再温度升至-40℃，保温；再升温至-30℃，保温；再升温至-20℃，保温；再升温至-10℃，保温；再升温至-5℃，保温；
(3)解析干燥段：将样品舱真空度维持在0-5pa；设置温度终点25℃，从-5℃提升至25℃；在25℃持续保温。
9.如权利要求8所述的冻干方法，其特征在于，
步骤(1)，所述预冷冻段，
常温降温至4℃过程中，降温速率为1-5℃/min，在4℃保温10-30min；
4℃降温至-40℃过程中，降温速率为0.4-1℃/min，在-40℃保温40-80min；
-40℃升温至-20℃过程中，升温速率为0.5-1℃/min，在-20℃保温30-60min；
-20℃降温至-55℃过程中，降温速率为0.25-0.5℃/min，在-55℃保温100-150min，
步骤(2)，所述升华干燥段，
-55℃升至-40℃过程中，升温速率为0.5-1℃/min，在-40℃保温40-80min；
-40℃升温至-25℃过程中，升温速率为0.2-0.5℃/min，-25℃保温80-100min；
-25℃升温至-15℃过程中，升温速率为0.25-0.5℃/min，-15℃保温100-150min；
-15℃升温至-5℃过程中，升温速率为0.10-0.25℃/min，-5℃保温100-150min；
步骤(3)中，所述解析干燥段，以5-10℃/h的升温速率将样本从-5℃提升至25℃；在25℃下持续保温时间为60-360分钟。
10.如权利要求8所述的冻干方法，其特征在于，
步骤(1)，所述预冷冻段，在4℃保温10-30min；在-40℃保温60min；在-20℃保温30min；在-55℃保温120min；
步骤(2)，所述升华干燥段，在-40℃保温60min；在-25℃保温90min；在-15℃保温120min；在-5℃保温120min。
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