CN113755601A - 黑色素瘤分子标志物及其在早期诊断和治疗黑色素瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了黑色素瘤分子标志物及其在早期诊断和治疗黑色素瘤中的应用,黑色素瘤分子标志物包括miR‑196a、miR‑27a‑5p、miR‑27b‑5p,本发明经实验验证发现所述分子标志物miR‑196a、miR‑27a‑5p、miR‑27b‑5p应用于黑色素瘤的诊断中具有较好的诊断效能,miR‑196a、miR‑27a‑5p、miR‑27b‑5p应用于黑色素瘤的治疗中具有协同治疗的效果,本发明为黑色素瘤的诊断和治疗提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体地,本发明涉及黑色素瘤分子标志物及其在早期诊断和治疗黑色素瘤中的应用,更具体地,本发明涉及的黑色素瘤分子标志物包括miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
背景技术
皮肤黑色素瘤是全球第12大最常见的癌症,黑色素瘤是由黑色素细胞恶性转化产生,可以发生在皮肤和黏膜的所有部位,易转移,具有高度侵袭性、高度恶性导致高死亡率。黑色素瘤的诊断由临床和病理学标准相结合,包括查体、病理组织学检查和影像学检查,然而,由于其组织学形态多变,或仅有少量甚至没有任何可见色素,患者自身早期发现困难,临床有时与良性痣鉴别不易,早期诊断困难。黑色素瘤早期治疗以外科手术为主,晚期则包括化疗、靶向治疗和免疫治疗。相较于单独使用化疗治疗,靶向治疗和免疫治疗目前已明显改善晚期黑色素瘤患者的生存率,但这两种疗法通常受到耐药率的限制,且不具有普遍适用性,患者的绝对生存率仍然较低(Hamid O,Robert C,Daud A,et al.Five-yearsurvival outcomes for patients with advanced melanoma treated withpembrolizumab in KEYNOTE-001[J].Annals of Oncology,2019,30(4):582-588.),因此,早期诊断和早期治疗对提高患者的生存率和生活质量至关重要。
生物标志物是一种可以标记***、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,在生物医学领域具有非常广泛的用途,生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。生物标志物能够客观反映正常生理过程和病理过程。近年来,microRNA(微小RNA,miRNA)作为一种新型的癌症特异性生物标志物备受关注,miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的非编码小分子RNA,存在于不同生物中,在Drosha R Nase的作用下由pri-miRNA剪切成为70~100个核苷酸长度的具有茎环结构的pre-miRNA,pre-miRNA在Dicer酶作用下被剪切成19~25个核苷酸长度的成熟RNA,即miRNA。成熟miRNA通过与目标mRNA的3’端非编码区(3’untranslated region,3’UTR)特异性互补,导致mRNA翻译受到抑制。miRNA具有广泛的基因调节功能,据统计miRNA调节了人类约30%基因的功能,参与了一系列生命活动,包括细胞增殖及凋亡、器官形成、造血过程、发育进程等,与肿瘤的发生、诊断、治疗和预后等有着密切关系,肿瘤中超过50%的miRNA基因位于染色体脆性位点或染色体扩增、缺失或转位区域,相比于蛋白质标志物,miRNA表达异常出现的更早,对早期诊断更加有利,也更适合作为肿瘤的生物标志物。
因此,识别能够更好地用于黑色素瘤诊断和治疗的生物标志物对于本领域而言非常重要。鉴于此,本发明筛选了与黑色素瘤发生发展相关的miRNA标志物,并通过相关的验证实验验证了所述miRNA标志物用作黑色素瘤的预测标志物和治疗靶标的效能。
发明内容
本发明的目的在于提供黑色素瘤分子标志物及其在早期诊断和治疗黑色素瘤中的应用,所述分子标志物包括miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p,本发明经实验验证首次发现miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p三者联合对黑色素瘤具有较好的诊断效能,且具有协同治疗的效果。
本发明公开的分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的序列均可在miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)中进行查询,其中,miR-196a的序列如SEQ ID NO:17所示,miR-27a-5p的序列如SEQ ID NO:18所示,miR-27b-5p的序列如SEQ IDNO:19所示;
miR-196a的序列:
GUGAAUUAGGUAGUUUCAUGUUGUUGGGCCUGGGUUUCUGAACACAACAACAUUAAACCACCCGAUUCAC(SEQ ID NO:17)
miR-27a-5p的序列:
AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA(SEQ ID NO:18)
miR-27b-5p的序列:
AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC(SEQ ID NO:19)
进一步,本发明中所述的miR-196a包括miR-196a初始miRNA、miR-196a前体miRNA、成熟miR-196a,所述miR-196a初始miRNA在人细胞内被剪切并表达为成熟miR-196a,所述miR-196a前体miRNA在人细胞内被剪切并表达为成熟miR-196a。作为进一步的优选,所述miR-196a还包括:对miR-196a进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现:
第一方面,本发明提供了检测分子标志物的试剂在制备诊断黑色素瘤产品中的应用。
进一步,所述分子标志物为miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
进一步,所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测所述分子标志物表达水平的试剂。
进一步,通过反转录PCR检测所述分子标志物表达水平的试剂包括特异性扩增所述分子标志物的引物;
通过实时定量PCR检测所述分子标志物表达水平的试剂包括特异性扩增所述分子标志物的引物;
通过原位杂交检测所述分子标志物表达水平的试剂包括特异性识别所述分子标志物的探针。
进一步,特异性扩增所述分子标志物miR-196a的引物的序列如SEQ ID NO:9-SEQID NO:10所示;
特异性扩增所述分子标志物miR-27a-5p的引物的序列如SEQ ID NO:11-SEQ IDNO:12所示;
特异性扩增所述分子标志物miR-27b-5p的引物的序列如SEQ ID NO:13-SEQ IDNO:14所示。
第二方面,本发明提供了一种诊断黑色素瘤的产品。
进一步,所述产品包含检测分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p表达水平的试剂;
优选地,所述产品包括芯片、试剂盒;
更优选地,所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的特异性识别所述分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的探针;
更优选地,所述试剂盒包括特异性结合所述分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的引物、探针或芯片。
进一步,所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板;微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒,其直径多为微米;膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。
进一步,所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂、荧光定量PCR试剂、内参定量试剂;
优选地,所述RNA提取试剂包括TrizolLS、无水乙醇、氯仿、异丙醇、RNase-freewater;
优选地,所述逆转录试剂包括逆转录引物、逆转录酶、RNase-freewater;
优选地,所述荧光定量PCR试剂包括SYBR Green荧光定量PCR酶、RNase-freewater、cDNA、miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的正向引物和反向引物;
优选地,所述内参定量试剂包括内参U6的特异性引物;
更优选地,所述miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14所示;
更优选地,所述内参U6的特异性引物的序列如EQ ID NO:15-SEQ ID NO:16所示。
进一步,所述产品的应用方法包括如下步骤:
(1)收集来自受试者的样本作为实验组,检测受试者的样本中miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平;
(2)将非黑色素瘤的正常样本作为对照组,检测非黑色素瘤的正常样本中miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平;
(3)若所述实验组中的miR-196a的表达水平高于对照组中的miR-196a的表达水平、miR-27a-5p和miR-27b-5p的表达水平低于对照组中的miR-27a-5p和miR-27b-5p的表达水平,则判定受试者存在患黑色素瘤的风险或者已经发展成了黑色素瘤。
第三方面,本发明提供了一种用于黑色素瘤早期筛查的***。
进一步,所述***包括:
(1)黑色素瘤评估装置:包括控制单元和存储单元,用于评估受试者是否患有黑色素瘤或患有黑色素瘤的风险概率;
(2)彼此通信连接的信息通信终端装置:用于提供关于来自受试者的样本中分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平的数据;
所述黑色素瘤评估装置的控制单元包括如下四个单元:
1)数据接收单元:用于接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本中分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p表达水平的数据;
2)判别值计算单元:其基于对由所述数据接收单元接收的所述样本中分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平以及存储在所述存储单元中的作为解释变量的分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平的判别来计算判别值;
3)判别值基准评价单元:其基于由所述判别值计算单元计算的判别值,对所述受试者黑色素瘤的发生风险情况进行评价;
4)评估结果发送单元:其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
第四方面,本发明提供了分子标志物在制备治疗黑色素瘤的药物组合物中的应用。
进一步,所述分子标志物为miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
进一步,所述药物组合物包括降低miR-196a表达水平的抑制剂、升高miR-27a-5p和miR-27b-5p表达水平的促进剂;
优选地,所述降低miR-196a表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1所示;
优选地,所述升高miR-27a-5p和miR-27b-5p表达水平的促进剂的序列分别如SEQID NO:2-SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:5所示。
进一步,所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体和/或辅料。
第五方面,本发明提供了分子标志物在筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物中的应用。
进一步,所述分子标志物为miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
第六方面,本发明提供了一种筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物的方法。
进一步,所述方法包括如下步骤:
(1)将待测物质与含有或表达miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的体系接触;
(2)检测所述体系中miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平;
(3)选择可同时降低miR-196a的表达水平、升高miR-27a-5p和miR-27b-5p的表达水平的物质为预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物。
进一步,所述体系选自:细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
相对于现有技术,本发明具有的优点和有益效果:
本发明经实验验证首次发现,分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p三者联合能够用于早期黑色素瘤的诊断和治疗中,且所述miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p三者联合具有协同治疗的效果,诊断效能较高,本发明为黑色素瘤的早期诊断及早期干预和治疗提供了指导。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1显示miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p在训练集和验证集中差异表达的结果图,其中,A图:miR-196a、训练集,B图:miR-27a-5p、训练集,C图:miR-27b-5p、训练集,D图:miR-196a、验证集,E图:miR-27a-5p、验证集,F图:miR-27b-5p、验证集;
图2显示miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p在训练集和验证集中的ROC曲线结果图,其中,A图:miR-196a、训练集,B图:miR-27a-5p、训练集,C图:miR-27b-5p、训练集,D图:miR-196a、验证集,E图:miR-27a-5p、验证集,F图:miR-27b-5p、验证集;
图3显示miR-196a+miR-27a-5p+miR-27b-5p联合在训练集和验证集中的ROC曲线结果图,其中,A图:训练集,B图:验证集;
图4显示miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的相对表达量的结果图,其中,A图:miR-196a,B图:miR-27a-5p,C图:miR-27b-5p;
图5显示miR-196a inhibitor、miR-27a-5p mimics、miR-27b-5p mimics、miR-196ainhibitor+miR-27a-5p mimics+miR-27b-5p mimics联合对黑色素瘤细胞凋亡率的影响的结果统计图,其中,A图:空白对照组,B图:阴性对照组,C图:miR-196ainhibitor组,D图:miR-27a-5p mimics组,E图:miR-27b-5p mimics组,F图:miR-196a inhibitor+miR-27a-5p mimics+miR-27b-5p mimics组。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1筛选黑色素瘤中差异表达的基因
1、数据来源
本实施例中所采用的数据均来自于GEO数据库(基因表达综合数据库,GeneExpression Omnibus),从GEO数据库中下载黑色素瘤数据集GSE35579和GSE20994,所述数据集中包括基因表达数据和完整的临床注释,其中,下载的数据集GSE35579作为验证集,样本量为Case:Control=41:11,下载的数据集GSE20994作为训练集,样本量为Case:Control=35:22。
2、数据预处理
对上述从GEO数据库下载的训练集和验证集的原始数据进行了标准化处理,对标准化后的基因表达矩阵通过注释文件(Platform文件)进行注释,多个探针对应同一个基因的,取平均值作为该基因的表达量。
3、差异表达分析
采用R语言软件中的“limma”包对上述数据集GSE35579和GSE20994中的数据进行差异表达分析,差异表达基因的筛选标准为:adj.P value<0.05,|log2FC|>0.5。
4、实验结果
结果见表1和图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F,经筛选得到的差异表达miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p在训练集和验证集中呈显著性的差异表达,其中,miR-196a在黑色素瘤中的表达显著上调,miR-27a-5p在黑色素瘤中的表达显著下调,miR-27b-5p在黑色素瘤中的表达显著下调。
表1 miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p在训练集和验证集中差异表达的结果
实施例2诊断效能验证
1、实验方法
对实施例1中筛选得到的差异表达miRNA miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p,采用R包“pROC”(版本1.15.0)绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线),分析其敏感性、特异性、AUC值,以判断所述miRNA单独和联合时在训练集和验证集中的诊断效能;
在判断单独指标在训练集和验证集中的诊断效能时,直接使用所述miRNA的表达量进行分析,选择Youden指数最大的一点对应的水平作为其cutoff值,AUC在0.5<AUC<0.8的基因被用于联合分析;
在判断指标联合在训练集和验证集中的诊断效能时,对各miRNA的表达水平进行Logistics回归,通过拟合出的回归曲线计算出每个个体患病与否的概率,确定不同的概率划分阈值,根据确定的概率划分阈值,计算得出联合诊断方案的灵敏度、特异性以及准确性等。
2、实验结果
结果见表2和图2A、图2B、图2C、图2D、图2E、图2F、图3A、图3B,结果显示miRNA组合miR-196a+miR-27a-5p+miR-27b-5p联合对黑色素瘤的诊断效果显著优于单个miRNA的诊断效果,在训练集和验证集中的AUC值分别为0.843和0.942,且敏感性和特异性均较高,表明了上述miRNA组合miR-196a+miR-27a-5p+miR-27b-5p联合具有较好的诊断效能,能够应用于黑色素瘤的诊断中。
表2 miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p、miR-196a+miR-27a-5p+miR-27b-5p联合在训练集和验证集中的诊断效能结果
实施例3 miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达与黑色素瘤细胞的凋亡的关系研究
1、实验材料
实验中涉及到的主要实验器材和实验试剂及耗材见表3和表4。
表3实验中涉及的主要器材
名称 | 厂家 | 型号 |
微量移液器 | EPPendorf | 248692Z |
超净工作台 | ZJ苏州净化 | 16052007 |
CO<sub>2</sub>恒温培养箱 | YILIANG | YCP系列 |
倒置显微镜 | canon | 126281 |
低速离心机 | eppendorf | 47103 |
表4实验中涉及的主要试剂
名称 | 厂家 | 货号 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | #11668-019 |
DMEM | GIBCO | C11995500BT |
细胞培养皿、细胞培养瓶 | Corning | |
其它化学试剂 | 国产分析纯 | |
FBS | GIBCO | 10270 |
P/S solution | SCLENCELL | NO.0503 |
2、细胞来源
黑色素瘤细胞A375购自于中国科学院上海细胞生物研究所,引进后在本实验室长期培养。A375培养基为以DMEM+10%FBS+1%P/S solution,37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的条件下进行培养。
3、细胞培养
(1)A375黑色素瘤细胞复苏
细胞复苏法使用的是水浴锅内快速融化的方法。实验之前进行防护,穿戴好手套及防护面具,从液氮中取出一支A375黑色素瘤细胞冻存管,注意观察标签名称、冻存日期等信息,确定是需要的细胞,然后快速放入已经备好的37℃的水浴锅中,整个过程一定要快速,最好在1min时间内把冻存液完全融化,此时注意无菌操作防止感染,特别注意瓶盖处防护,完成融化后使用吸管把冻存的细胞转移到离心管中,加入PBS缓冲溶液均匀吹打,保证完全融入PBS缓冲溶液中,然后把离心管放入离心机中,调整转速1000rpm/min,时间维持5min左右,取出上清,保留离心管底层的物质,加入适量DMEM完全培养基重新悬浮,按照1:2种植于T25培养瓶中,每个培养瓶中加入DMEMF完全培养基5mL,于镜下可见悬浮的圆形的细胞,代表已经把细胞转移成功,然后放入含有5%CO2、37℃恒温的细胞孵育箱中进行培养;
(2)A375黑色素瘤细胞换液
A375黑色素瘤细胞开始贴壁的时间一般是大约4-6h左右,一般一天的时间就可以完全贴壁,贴壁后的细胞呈多边形,可以根据观察培养液的颜色及镜下观察情况进行换液,注意DMEM完全培养基要在37℃恒温水浴锅中提前预热,可以用巴氏管吸取上面的陈旧培养液,尽可能不要接触培养皿的下部,防止底层细胞造成划痕,细胞生长不均匀。然后沿着侧壁慢慢加入37℃水浴预热的PBS缓冲溶液进行清洗,去除一些坏死的细胞,可以用37℃水浴预热的PBS冲洗三次,最后在培养皿中加入37℃水浴预热的5mL DMEM完全培养基,放入5%CO2、37℃恒温孵育箱培养。整个过程注意无菌操作,巴氏管接触外界后要及时丢弃,过程干净利索,不宜过长时间;
(3)A375黑色素瘤细胞传代
约2-3天,A375黑色素瘤细胞就可以达到80%-100%的细胞融合,此时进行细胞传代。实验之前要进行个人防护,在提前消毒30min的超净工作台中,使用巴氏管,吸弃陈旧的培养液,使用37℃水浴预热的PBS冲洗三次,加入1mL浓度为0.25%胰蛋白酶,放入37℃恒温孵育箱中,计时1min左右,为明确细胞是否完全被消化,可以在倒置显微镜下观察,如果见圆形的细胞大部分悬浮,就可停止胰蛋白酶消化,加入1-2mL的37℃水浴预热的5-10mLDMEM/F-12完全培养基,同时及时吹打细胞,使细胞完全悬浮溶液中,然后转移到离心管中,配平离心机,调整转速1000rpm/min,离心时间5min左右,按照1:3-1:5的比例进行传代,培养皿放入5-10mL DMEM/F-12完全培养基,放入37℃、5%CO2的细胞恒温孵育箱中进行培养。
4、细胞转染
(1)取处于对数生长期的A375细胞,生长状态良好的细胞,用培养基将细胞密度调整到1×105/mL,接入6孔板,每孔2mL细胞悬液,每组各两孔,37℃培养过夜;
(2)转染前2小时,换成无血清培养基;
(3)转染步骤,对于每个转染样品,均按如下所述的方法进行准备:
1)转染前一天将细胞计数,取1mL加入6孔板中,使得孔板的细胞密度不低于2×105个;
2)对于每孔细胞,用250μL的无血清培养基稀释10μL的100nM的inhibitor或mimics,室温孵育5min;
3)对于每孔细胞,用250μL的无血清培养基稀释5μL Lipo2000,室温孵育5min;
4)将步骤2)和步骤3)中的液体混合,室温孵育20min;
5)将预先分好的贴壁细胞换成无血清培养基,加入上述复合物,在37℃,5%CO2中培养6小时,再换成加血清的生长培养基,继续在37℃,5%CO2中培养48小时。收集细胞样本,PBS洗两次,弃去液体,进行后续RNA的提取;
将实验设置为3个组:空白对照组(A375黑色素瘤细胞)、阴性对照组(inhibitor-NC或mimics-NC组)和实验组(inhibitor或mimics组)。
其中,针对miR-196a的inhibitor的序列信息如下:
5’-CCCAACAACAUGAAACUACCUA-3’(SEQ ID NO:1)
针对miR-27a-5p的mimics的序列信息如下:
正义链为5’-AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA-3’(SEQ ID NO:2)
反义链为5’-UGCUCACAAGCAGCUAAGCCCU-3’(SEQ ID NO:3)
针对miR-27b-5p的mimics的序列信息如下:
正义链为5’-AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC-3’(SEQ ID NO:4)
反义链为5’-GUUCACCAAUCAGCUAAGCUCU-3’(SEQ ID NO:5)
inhibitor-NC的序列信息如下:
5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3’(SEQ ID NO:6)
mimics-NC的序列信息如下:
正义链为5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’(SEQ ID NO:7)
反义链为5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3’(SEQ ID NO:8)
5、QPCR检测细胞中miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平
(1)样本总RNA的提取(Trizol法)
1)取适量待测样本加入液氮后研磨粉碎;
2)用1mL Trizol将研磨样本转移到1.5mL EP管中;
3)向1.5mL EP管中加入500μL酚氯,仿振荡混匀后,静止5分钟;
4)4℃12000rpm离心10分钟,小心吸取上清于一新的1.5mL EP管中;
5)向分离出的上清中加入700μL异丙醇,充分混匀;
6)4℃12000rpm离心10分钟,小心弃上清;
7)用75%乙醇洗涤沉淀一次,室温晾干;
8)50μL DEPC水溶解RNA沉淀;
9)琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)总RNA质量检测
1)使用核酸浓度测定仪测定RNA浓度和纯度,测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零,操作方法如下:抬起样品臂,把样品加到检测基座上;放下样本臂,使用电脑上的软件开始吸光值检测。在上下两个光纤之间会自动拉出一个样品柱,然后进行检测;当检测完成后,抬起样品臂,并用干净的无尘纸把上下基座上的样品擦拭干净;
2)浓度测定:260nm处读值为1表示40ng RNA/μL。样品RNA浓度计算公式为:A260 X40ng/μL;
3)纯度检测:RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法,比值范围1.8到2.1。
(3)逆转录合成cDNA
逆转录使用invitrogen的逆转录试剂盒superscript III;
反应体系1的建立见表5,混匀,离心,65℃,5分钟,结束后置于冰上;
表5反应体系1的组成
反应体系1组成 | 各组分含量 |
RNA | 200ng(10μL) |
Oligo-dT | 1μL |
反应体系2的建立见表6;
表6反应体系2的组成
反应体系2组成 | 各组分含量 |
反应体系1 | 12μL |
dNTP(10μM) | 1μL |
0.1M DTT | 2μL |
5X Buffer | 4μL |
RT酶 | 1μL |
混匀,离心,置于42℃,水浴60分钟;取出后置于85℃,反应10分钟,灭活逆转录酶,反应结束后将产物置于-20℃待用。
(4)实时荧光定量检测
首先设计QPCR的扩增引物,具体引物序列如下:
miR-196a:
正向引物为5’-TAGGTAGTTTCATGTTGTTG-3’(SEQ ID NO:9);
反向引物为5’-CTCAACTGGTGTCGTG-3’(SEQ ID NO:10);
miR-27a-5p:
正向引物为5’-AGGGCTTAGCTGCTTGTGA-3’(SEQ ID NO:11);
反向引物为5’-CTCAACTGGTGTCGTG-3’(SEQ ID NO:12);
miR-27b-5p:
正向引物为5’-AGAGCTTAGCTGATTGGTG-3’(SEQ ID NO:13);
反向引物为5’-CTCAACTGGTGTCGTG-3’(SEQ ID NO:14);
U6内参引物:
正向引物为5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’(SEQ ID NO:15);
反向引物为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(SEQ ID NO:16);
Real time PCR反应体系建立见表7;
表7 Real time PCR反应体系
反应体系组成 | 各组分含量 |
cDNA | 2μL |
PCR mix | 10μL |
primer F | 1μL |
primer R | 1μL |
ddH<sub>2</sub>O | 6μL |
体系混匀后,瞬离,置于荧光定量PCR仪上,按照表8所述的条件反应;
表8 Realtime PCR反应条件
对各组样本的相对定量结果进行分析,其中,miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p相对表达量的计算公式如下:
ΔCtq=待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值
ΔCtcb=对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值
6、细胞凋亡实验
本实施例中采用流式细胞术检测miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p、miR-196a+miR-27a-5p+miR-27b-5p的表达对A375黑色素瘤细胞凋亡的影响,首先收集未经转染、转染miR-196a inhibitor、转染miR-27a-5p mimics、转染miR-27b-5p mimics、同时转染miR-196a inhibitor和miR-27a-5p mimics和miR-27b-5p mimics的A375黑色素瘤细胞,对细胞进行洗涤后用乙醇进行固定,并进行细胞的重悬和细胞过滤,并采用PI染液进行染色,之后采用流式细胞仪进行检测;
其中,在细胞凋亡检测中,流式细胞术检测结果图中的不同象限代表不同的意义,Q1-1(AnnexinV-FITC)-/PI+代表坏死细胞,Q1-2(AnnexinV+FITC)+/PI+代表中晚期凋亡的细胞,Q1-4(AnnexinV-FITC)+/PI-代表早期凋亡的细胞,Q1-3(AnnexinV-FITC)-/PI-代表正常的活细胞,各象限的百分数分别代表对应细胞所占的比例,细胞总凋亡率=中晚期凋亡率+早期凋亡率。
7、实验结果
转染的结果显示,以空白对照组miR-196a的表达水平作为参比设为1,相比于空白对照组miR-196a的表达量(相对表达量为1)与转染inhibitor-NC的阴性对照组(NC组)miR-196a的表达量,转染miR-196a inhibitor的实验组的miR-196a的表达量显著下调,且差异具有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异(见图4A);
转染的结果显示,以空白对照组miR-27a-5p的表达水平作为参比设为1,相比于空白对照组miR-27a-5p的表达量(相对表达量为1)与转染mimics-NC的阴性对照组(NC组)miR-27a-5p的表达量,转染miR-27a-5p mimics的实验组的miR-27a-5p的表达量显著上调,且差异具有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异(见图4B);
转染的结果显示,以空白对照组miR-27b-5p的表达水平作为参比设为1,相比于空白对照组miR-27b-5p的表达量(相对表达量为1)与转染mimics-NC的阴性对照组(NC组)miR-27b-5p的表达量,转染miR-27b-5p mimics的实验组的miR-27b-5p的表达量显著上调,且差异具有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组之间无显著差异(见图4C);
细胞凋亡实验的结果显示,转染miR-196a inhibitor的实验组的细胞的总凋亡率(10.11%)显著高于空白对照组(3.06%)和阴性对照组(3.16%)(见表9和图5A、图5B、图5C),表明miR-196a能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力,抑制miR-196a的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡;
细胞凋亡实验的结果显示,转染miR-27a-5p mimics的实验组的细胞的总凋亡率(10.00%)显著高于空白对照组(3.06%)和阴性对照组(3.16%)(见表9和图5A、图5B、图5D),表明miR-27a-5p能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力,升高miR-27a-5p的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡;
细胞凋亡实验的结果显示,转染miR-27b-5p mimics的实验组的细胞的总凋亡率(10.32%)显著高于空白对照组(3.06%)和阴性对照组(3.16%)(见表9和图5A、图5B、图5E),表明miR-27b-5p能够影响黑色素瘤细胞的凋亡能力,升高miR-27b-5p的表达水平可促进黑色素瘤细胞的凋亡;
细胞凋亡实验的结果显示,共同转染miR-196a inhibitor和miR-27a-5p mimics和miR-27b-5p mimics的实验组的细胞的总凋亡率(39.99%)显著高于单独转染miR-196ainhibitor的实验组(10.11%)和单独转染miR-27a-5p mimics的实验组(10.00%)和单独转染miR-27b-5p mimics的实验组(10.32%)(见表9和图5C、图5D、图5E、图5F);
此外,对各组的细胞抑制率进行计算,计算得到的结果见表10,利用金氏公式表达式q=EA+B+C/(EA+EB+EC-EA×EB×EC)判断三者联合使用后的效果是否具有协同的效果,其中,EA+B+C为miR-196a inhibitor+miR-27a-5p mimics+miR-27b-5p mimics对黑色素瘤细胞的抑制率,EA为miR-196a inhibitor 对黑色素瘤细胞的抑制率,EB为miR-27a-5p mimics对黑色素瘤细胞的抑制率,EC为miR-27b-5p mimics对黑色素瘤细胞的抑制率;若q=0.85-1.15之间为单纯叠加,1.15<q<20为协同,q>20为显著协同,q<0.85为拮抗,即q>1.15时即可判定miR-196a inhibitor、miR-27a-5p mimics、miR-27b-5p mimics三者对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果,而非单纯叠加;
根据表10计算得到的细胞抑制率的结果,利用金氏公式计算增效q值,评价miR-196a inhibitor、miR-27a-5p mimics、miR-27b-5p mimics三者联合的效应是否为协同效应,代入计算得到的细胞抑制率的结果可知,q=EA+B+C/(EA+EB+EC-EA×EB×EC)=0.3693/(0.0705+0.0694+0.0726-0.0705×0.0694×0.0726)=1.742,即q=1.742,q>1.15,表明了miR-196a inhibitor、miR-27a-5p mimics、miR-27b-5pmimics三者联合对黑色素瘤细胞的凋亡促进作用为协同效果,进一步证明了mi R-196a inhibitor、miR-27a-5p mimics、miR-27b-5p mimics三者联合为协同治疗,而非单纯的叠加效果。
表9细胞凋亡实验的结果统计
表10各组的细胞抑制率的计算结果
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 康泰医学检验服务河北有限公司
北京百奥思科生物医学技术有限公司
<120> 黑色素瘤分子标志物及其在早期诊断和治疗黑色素瘤中的应用
<141> 2021-10-13
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccaacaaca ugaaacuacc ua 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agggcuuagc ugcuugugag ca 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ugcucacaag cagcuaagcc cu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagcuuagc ugauugguga ac 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
guucaccaau cagcuaagcu cu 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caguacuuuu guguaguaca aa 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uuuguacuac acaaaaguac ug 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caguacuuuu guguaguaca aa 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taggtagttt catgttgttg 20
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcaactggt gtcgtg 16
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agggcttagc tgcttgtga 19
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctcaactggt gtcgtg 16
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agagcttagc tgattggtg 19
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctcaactggt gtcgtg 16
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcttcggcag cacatatact aaaat 25
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcttcacga atttgcgtgt cat 23
<210> 17
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gugaauuagg uaguuucaug uuguugggcc uggguuucug aacacaacaa cauuaaacca 60
cccgauucac 70
<210> 18
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agggcuuagc ugcuugugag ca 22
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agagcuuagc ugauugguga ac 22
Claims (10)
1.检测分子标志物的试剂在制备诊断黑色素瘤产品中的应用,其特征在于,所述分子标志物为miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测所述分子标志物表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,通过反转录PCR检测所述分子标志物表达水平的试剂包括特异性扩增所述分子标志物的引物;
通过实时定量PCR检测所述分子标志物表达水平的试剂包括特异性扩增所述分子标志物的引物;
通过原位杂交检测所述分子标志物表达水平的试剂包括特异性识别所述分子标志物的探针。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,特异性扩增所述分子标志物miR-196a的引物的序列如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10所示;
特异性扩增所述分子标志物miR-27a-5p的引物的序列如SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12所示;
特异性扩增所述分子标志物miR-27b-5p的引物的序列如SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14所示。
5.一种诊断黑色素瘤的产品,其特征在于,所述产品包含检测分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p表达水平的试剂;
优选地,所述产品包括芯片、试剂盒;
更优选地,所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的特异性识别所述分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的探针;
更优选地,所述试剂盒包括特异性结合所述分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的引物、探针或芯片。
6.一种用于黑色素瘤早期筛查的***,其特征在于,所述***包括:
(1)黑色素瘤评估装置:包括控制单元和存储单元,用于评估受试者是否患有黑色素瘤或患有黑色素瘤的风险概率;
(2)彼此通信连接的信息通信终端装置:用于提供关于来自受试者的样本中分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平的数据;
所述黑色素瘤评估装置的控制单元包括如下四个单元:
1)数据接收单元:用于接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本中分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p表达水平的数据;
2)判别值计算单元:其基于对由所述数据接收单元接收的所述样本中分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平以及存储在所述存储单元中的作为解释变量的分子标志物miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平的判别来计算判别值;
3)判别值基准评价单元:其基于由所述判别值计算单元计算的判别值,对所述受试者黑色素瘤的发生风险情况进行评价;
4)评估结果发送单元:其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
7.分子标志物在制备治疗黑色素瘤的药物组合物中的应用,其特征在于,所述分子标志物为miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药物组合物包括降低miR-196a表达水平的抑制剂、升高miR-27a-5p和miR-27b-5p表达水平的促进剂;
优选地,所述降低miR-196a表达水平的抑制剂的序列如SEQ ID NO:1所示;
优选地,所述升高miR-27a-5p和miR-27b-5p表达水平的促进剂的序列分别如SEQ IDNO:2-SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4-SEQ ID NO:5所示。
9.分子标志物在筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物中的应用,其特征在于,所述分子标志物为miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p。
10.一种筛选用于预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)将待测物质与含有或表达miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的体系接触;
(2)检测所述体系中miR-196a、miR-27a-5p、miR-27b-5p的表达水平;
(3)选择可同时降低miR-196a的表达水平、升高miR-27a-5p和miR-27b-5p的表达水平的物质为预防和/或治疗黑色素瘤的候选药物。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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