CN112094913B - 结直肠癌生物标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，涉及一种结直肠癌生物标志物及其用途。具体地，本发明涉及一种核酸分子组合，其包括如下的核酸分子：（1）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO:1所示序列的第30位的G替换为C。本发明的生物标志物能够有效地诊断结肠癌和/或直肠癌，特别是早期结肠癌风险和/或早期直肠癌，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种结直肠癌生物标志物及其用途。
背景技术
结直肠癌（CRC）是最常见的消化***恶性肿瘤之一，目前其在全球的发病率与致死率都高居前列，仅2018年新发病人数达到近200万，而致死人数将近90万人。拥有众多人口的中国随着这些年经济的快速增长，结肠癌患者人数也呈现显著上升趋势。由于结直肠癌起病隐匿，早期不易发现，患者确诊时已处于中晚期，就目前的医疗手段，晚期转移性结直肠癌患者的5年生存率不到10%。
结直肠癌筛查对于其治疗至关重要，同时也影响着患者的有效治愈率。疾病发现的越早能够被治愈的机会就越大，早期结直肠癌不仅治愈率高，并且目前有较为明确的治疗方式：一般手术治疗或再加以辅助化疗即可，治疗费用相对会低。因此，早期筛查是必要的，而筛查的全面性，精准度对于结直肠癌早期筛查同样很重要。
结直肠癌多发现于中老年人群中，但发病年轻化趋势明显。目前已有证据表明，老年及年轻癌症患者中基因突变频率存在明显差别，但目前还未有针对关于年轻癌症患者的基因突变频率方面的研究。因此，目前市场上已有的诊断试剂盒也未针对老年人和年轻人进行区分设计，一些年轻患者中特有的高频变异基因并未包含在诊断试剂盒中。
中国发明专利CN103080334B公开了用于诊断早期结直肠癌及高级腺瘤的微RNA生物标记及方法。虽然该专利提供鉴别早期结直肠癌的指征，但是该发明仍可能存在以下缺点：1、并不针对年轻人；2、指征较多，不够简洁。
miR-8078是microRNA 8078（小RNA8078）的简称，是20-24nt的短非编码RNA，通过影响mRNA的稳定性和翻译来参与多细胞生物中基因表达的转录后调控。miRNA被RNA多聚酶II转录为封端和多腺苷酸化的初级转录物（pri-miRNA）的部分，该转录物可以是蛋白质编码的也可以是非编码的。该初级转录物被Drosha核糖核酸酶III切割以生成一个接近70nt茎环前体miRNA（pre-miRNA），且能进一步被细胞质Dicer核糖核酸酶切割以生成成熟miRNA和反义miRNA星（miRNA*）产品。该成熟miRNA被掺入至RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，能通过和miRNA的不完全碱基配对来识别靶mRNA，最常引起的是翻译抑制或靶mRNA不稳定。
SCD是stearoyl-CoA desaturase 的简称，译为硬脂酰基辅酶A脱氢酶或硬脂酰基辅酶A去饱和酶。SCD是蛋白编码基因，该基因对参与脂肪酸（主要是油酸）生物合成的酶进行编码。SCD的mRNA序列请参见GenBank中的Sequence ID: NM_005063.5。
人类SCD有两种，SCD1 和SCD5，其中对人类SCD1的研究多一些，对人类SCD5的了解要少得多。在有丝***的细胞周期过程中，SCD1刺激脂质生物合成，为膜生物形成提供新的磷脂是必需的。近十年来，SCD1在癌症研究中得到了广泛的研究，被认为是广谱肿瘤的一个新的分子靶点。随着脂肪酸生物合成的减少和饱和度的降低SCD1活性和mRNA表达的降低而损害细胞膜脂质的形成，导致肿瘤细胞停止增殖，诱导细胞凋亡。
在许多肿瘤病变中发现，抑制SCD1可有效抑制肿瘤细胞特别是结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡；有文献报道，结直肠癌细胞的体外研究表明，抑制SCD1活性可促进细胞凋亡，其原因是线粒体功能障碍、活性氧(ROS)上调、线粒体跨膜电位改变和线粒体蛋白细胞色素C易位（Qin, X.-Y.; Kojima, S. Inhibition of Stearoyl-CoA Desaturase-1 Activity Suppressed SREBP Signaling in Colon Cancer Cells and Their Spheroid Growth. Gastrointest. Disord. 2019, 1, 191-200；Chen, L., Ren, J., Yang, L. et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 mediated cell apoptosis in colorectal cancer by promoting ceramide synthesis. Sci Rep 6, 19665 (2016)；Ran, H., Zhu, Y., Deng, R. t al. Stearoyl-CoA desaturase-1 promotes colorectal cancer metastasis in response to glucose by suppressing PTEN. J Exp Clin Cancer Res 37, 54 (2018)）。
目前，尚需要开发针对结直肠癌特别是早期结直肠癌或者针对年轻人的结直肠癌有效筛查手段。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了miR-8078的突变体。本发明人惊奇地发现，这些miR-8078的突变核酸分子能够作为结直肠癌生物标志物，具有应用于检测或者诊断结直肠癌特别是年轻人中的早期结直肠癌的潜力。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种核酸分子组合，其包括如下的核酸分子：
（1）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第30位的G替换为C。
在本发明的一些实施方式中，所述的核酸分子组合，其还包含选自如下核酸分子（2）-（5）中的任意1种、2种、3种或者全部4种：
（2）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第15位的C替换为G；
（3）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第71位的G替换为T；
（4）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第50位的C替换为T；
（5）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第46位的A替换为T。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合包含核酸分子（1），以及选自核酸分子（2）-（5）中的任意1种、2种、3种或者全部4种。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合由上述核酸分子（1）-（5）组成。
在本发明的一些实施方式中，所述的核酸分子组合，其还包含选自如下核酸分子（6）-（11）中的任意1种、2种、3种、4种、5种或者全部6种：
（6）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第23位的G替换为C或A；
（7）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第45位的A替换为T；
（8）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第67位的T替换为G；
（9）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第59位的C替换为G；
（10）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第73位的G替换为A；
（11）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第43位的G替换为A。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合包含核酸分子（1），以及选自核酸分子（6）-（11）中的任意1种、2种、3种、4种、5种或者全部6种。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合包含核酸分子（1）-（5），以及选自核酸分子（6）-（11）中的任意1种、2种、3种、4种、5种或者全部6种。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合由上述核酸分子（1）-（11）组成。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合由上面任一项所述的核酸分子组成。当仅包括1种上述的核酸分子时，此时的核酸分子组合只有1种核酸分子组成，仍然在本发明的“核酸分子组合”的范围内。在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子组合由上述第（1）种核酸分子组成。
本发明的另一方面涉及一种引物或探针，其能够特异性地结合本发明中所述的核酸分子组合中的核酸分子；
优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光报告基团选自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；
优选地，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的引物或探针。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的核酸分子组合、检测本发明中任一项所述的核酸分子组合的试剂或者本发明的引物或探针在制备检测或诊断结直肠癌的药物中的用途。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，如果所述核酸分子组合中的任意一种或者多种核酸分子检测结果为阳性，判断结直肠癌的风险较高。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述结直肠癌为早期结直肠癌。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述结直肠癌为结肠癌和/或直肠癌。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，被检测或被诊断的对象为55周岁以下的人，优选为50周岁以下的人，更优选为47周岁以下的人。
本发明的再一方面涉及一种检测或者诊断结直肠癌的方法，包括检测本发明中任一项所述的核酸分子组合中的核酸分子的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述的检测或者诊断结直肠癌的方法，其中，如果所述核酸分子组合中的任意一种或者多种核酸分子检测结果为阳性，判断结直肠癌的风险较高。
在本发明的一些实施方式中，所述的检测或者诊断结直肠癌的方法，其中，所述结直肠癌为早期结直肠癌。
在本发明的一些实施方式中，所述的检测或者诊断结直肠癌的方法，其中，所述结直肠癌为结肠癌和/或直肠癌。
在本发明的一些实施方式中，所述的检测或者诊断结直肠癌的方法，其中，被检测或被诊断的对象为55周岁以下的人，优选为50周岁以下的人，更优选为47周岁以下的人。
本发明的再一方面涉及核酸分子或者提高该核酸分子表达水平的试剂在制备治疗和/或预防结直肠癌的药物中的用途，其中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NOs: 1-4中的任一序列所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述提高该核酸分子表达水平的试剂包括包含所述核酸分子的重组载体，可选地，还包括转染试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述的用途，其中，所述结直肠癌为结肠癌和/或直肠癌。
本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防结直肠癌的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的核酸分子或者提高该核酸分子表达水平的试剂的步骤，其中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NOs: 1-4中的任一序列所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的方法，其中，所述提高该核酸分子表达水平的试剂包括包含所述核酸分子的重组载体，可选地，还包括转染试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述的方法，其中，所述结直肠癌为结肠癌和/或直肠癌。
结直肠癌发病部位涉及结肠、直肠。按照TNM分类，早期结直肠癌为Ⅰ期，中期结直肠癌为Ⅱ期和Ⅲ期，晚期结直肠癌为Ⅳ期。
本发明涉及预测年轻人的早期结直肠癌风险或诊断年轻人是否患有早期结直肠癌，年轻人优选指＜50岁的人。
发明的有益效果
本发明的生物标志物能够有效地检测或诊断结肠癌和/或直肠癌，特别是检测或诊断年轻人的早期结肠癌和/或早期直肠癌。
附图说明
图1： miR-8078在检测样本和正常人群中突变频率统计图。
图2: (A), miR-8078 wt对结直肠癌细胞HCT8活力的影响示意图。
(B), miR-8078 wt对结直肠癌细胞KM12活力的影响示意图。
图3：miR-8078 wt在不同细胞系中的表达水平示意图。
图4：miR-8078的靶基因mRNA表达水平示意图。
图5：miR-8078的靶基因蛋白表达水平示意图。
本发明中涉及部分序列：
序列1：miR-8078基因序列
miR-8078 Gene Sequence基因序列：
CCGCTGTGTGGAGTCTCTCACCGGGCCTAGACCTAGAAGGCAGGAATCCCAGGCCGGTCAGCCCGGTGGAGGGGGCGGGGCGGA （SEQ ID NO: 1）
序列2：miR-8078基因的miR-8078 RNA前体序列
UCCGCCCCGCCCCCUCCACCGGGCUGACCGGCCUGGGAUUCCUGCCUUCUAGGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUCCACACAGCGG （SEQ ID NO: 2）
序列3：miRNA-8078成熟序列（hsa-miR-8078）
GGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUC （SEQ ID NO: 3）
序列4：miR-8078成熟体部分序列（对应于序列1的下划线部分）
GAGTCTCTCACCGGGCCTAGACC（SEQ ID NO: 4）
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例用到的部分实验材料和试剂如下：
（1）miR-8078 相关mimics（模拟物），如下：
miR-8078 wt（野生型）：GGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUC （SEQ ID NO: 3）
miR-8078 m1：GGUCUAGACCCGGUGAGAGACUC （SEQ ID NO: 5）
miR-8078 m2：GGUGUAGGCCCGGUGAGAGACUC （SEQ ID NO: 6）
miR-8078 m1+2：GGUGUAGACCCGGUGAGAGACUC （SEQ ID NO: 7）
均由广州锐博生物科技有限公司（RiboBio）合成。
（2）阴性对照NC（Non-target Control）：指不针对任何基因序列的对照序列，由锐博公司提供和合成。产品名称miCroON mimic NC#22，产品编号miR1N0000001-1-5。
（3）细胞样品
结直肠癌细胞系HCT8细胞、KM12细胞、HCT116细胞、SW480、SW620细胞均可购自ATCC；
结直肠正常上皮细胞NCM460细胞购自American Type Culture Collection(ATCC) 货号：ata-cl1041。
（4）培养基
gioco-DMEM（货号C1199500BT）和RPMI1640（货号C11875500BT）购自ThermoFisher。
实施例1：检测筛选突变位点
1.实验样品
本实施例中的29对样品（29个结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织样本）由UMMSCancer Center Tissue Bank提供，每对样品分别源自1个早期结直肠癌患者和1个同龄健康者，具体信息如表1。早期结直肠癌患者均为年轻的早期结直肠癌患者，年龄在21-49岁之间，如表1和表2。
表1：样品信息汇总表
| 样本编号 | 年龄 | 样本编号 | 年龄 | 样本编号 | 年龄 | 样本编号 | 年龄 | 样本编号 | 年龄 |
| 1039N | 47 | 2317N | 48 | 410N | 40 | 5224N | 45 | 6762N | 40 |
| 1039T | 47 | 2317T | 48 | 410T | 40 | 5224T | 45 | 6762T | 40 |
| 1317N | 35 | 2350N | 44 | 4154N | 49 | 5479N | 48 | 6791N | 44 |
| 1317T | 35 | 2350T | 44 | 4154T | 49 | 5479T | 48 | 6791T | 44 |
| 1370N | 46 | 2628N | 39 | 4161N | 38 | 547N | 37 | 7412N | 48 |
| 1370T | 46 | 2628T | 39 | 4161T | 38 | 547T | 37 | 7412T | 48 |
| 1479N | 40 | 2765N | 49 | 4412N | 21 | 5573N | 49 | 7959N | 49 |
| 1479T | 40 | 2765T | 49 | 4412T | 21 | 5573T | 49 | 7959T | 49 |
| 1955N | 45 | 2930N | 44 | 5129N | 40 | 5601N | 47 | 8189N | 41 |
| 1955T | 45 | 2930T | 44 | 5129T | 40 | 5601T | 47 | 8189T | 41 |
| 2223N | 33 | 2962N | 49 | 5180N | 46 | 6046N | 46 | - | - |
| 2223T | 33 | 2962T | 49 | 5180T | 46 | 6046T | 46 | - | - |
注：样本编号中的N代表健康者，T代表结直肠癌患者。
表2：样品年龄分布
| 年龄段 | ≤35 | 35-40 | 41-45 | 46-49 |
| 对数 | 3 | 7 | 6 | 13 |
2. 实验方法
（1）对样品组织处理得到DNA：新鲜剥离样品，快速清洗，分割，对于进行DNA提取的样品，须置于无DNase器皿中，速冻存于-20℃以下。提前冰上预冷生理盐水或PBS；从活体切取所需组织，置于冰上平皿内；加入预冷的生理盐水或PBS至淹没组织，漂洗去除血渍污物，重复1次；用滤纸吸干样品表面液滴，剪成约0.3cm左右的小块；液氮速冻后用封口膜封口（组织离体后至液氮速冻，操作时间不宜超过3min）。
（2）核酸抽提与质检：采用离心柱试剂盒法对样品进行抽提（试剂为美吉D3018），并用凯奥K5500和Agarose Gel Electrophoresis进行样品质检，Qubit检测样品浓度。Qubit检测标准为：样品片段为320±50 bp，浓度>10nmol的文库可用于上机。
（3）文库构建及测序
通过质检的样品，使用Agilent SureSelect human all exon V6+COSMIC试剂盒对外显子区域进行捕获，并按照illumina平台仪器对应User Guide中所述的方法进行上机样本制备。所采用试剂为NEBNext® Ultra™DNA Library Prep Kit for Illumina进行文库构建，后续使用Hiseq3000***进行双端150碱基测序。
3. 实验结果
本次共在15个结直肠癌样品中检测到miR-8078的变异，碱基的突变频率总共为31次。miR-8078的基因序列为SEQ ID NO: 1，总长84个碱基。miR-8078的基因突变位点详见下表3 (MAF格式介绍：https://docs.gdc.cancer.gov/Data/File_Formats/MAF_Format/)。
表3：miR-8078基因突变位点及基因型汇总
a参考等位基因：参考基因组上的等位基因，指SEQ ID NO:1中该位置上的碱基。
b肿瘤序列等位基因1：肿瘤样本中该位点对应的主等位基因，指肿瘤样本中SEQID NO:1的该位置上如果发生突变，突变后出现频率最高的碱基。
c肿瘤序列等位基因2：肿瘤样本中该位点对应的次等位基因，指肿瘤样本中SEQID NO:1的该位置上如果发生突变，突变后出现频率次高的碱基。
结合UMSS数据库及ExAC数据库挖掘，进行突变频率分析。在上述31个突变位点中，有11个位点突变频率在正常人群中的突变频率＜5%，所检测11个位点的突变情况：SEQ IDNO: 1中的112270(15)位C突变为G、112278(23)位G突变为C或A、112285(30)位G突变为C、112298(43)位G突变为A、112300(45)位A突变为T、112301(46)位A突变为T、112305(50)位C突变为T、112314(59)位C突变为G、112322(67)位T突变为G、112326(71)位G突变为T和112328(73)位G突变为A。11个位点的频率统计见表4和图1。
其中UMMS数据库是美国麻省大学（University of Massachusetts）癌症中心组织库，该组织库中包含737个结直肠癌病人样本，其中有167例样本包含配对正常组织样本。在这167对样本中，有29对样品属于早期发病患者，用于后续测序分析。
正常人的突变频率主要来源于1000Genome及ExAC数据库，主要以ExAC数据库中频率为主。
表4：11个位点以及在检测样本和正常人中的突变情况
| 按照在检测样本中的突变频率排序 | 在chr18中的位置 | SEQ ID NO: 1中的位置 | 在检测样本中的突变频率 | 在正常人中的突变频率 | 检测到的突变 |
| 1 | 112285 | 30 | 20.69% | 0.57% | 由G突变为C |
| 2 | 112270 | 15 | 20.69% | 0.03% | 由C突变为G |
| 3 | 112326 | 71 | 10.34% | 0.00% | 由G突变为T |
| 4 | 112305 | 50 | 10.34% | 0.14% | 由C突变为T |
| 5 | 112301 | 46 | 10.34% | 2.22% | 由A突变为T |
| 6 | 112278 | 23 | 6.90% | 2.68% | 由G突变为C或A |
| 7 | 112300 | 45 | 3.45% | 0.00% | 由A突变为T |
| 8 | 112322 | 67 | 3.45% | 0.00% | 由T突变为G |
| 9 | 112314 | 59 | 3.45% | 0.08% | 由C突变为G |
| 10 | 112328 | 73 | 3.45% | 0.40% | 由G突变为A |
| 11 | 112298 | 43 | 3.45% | 0.97% | 由G突变为A |
由表4可见，11个位点中有5个位点的突变频率显著高于数据库中正常人群变异频率，突变频率＞10%。其中chr18:112285位点在人群的突变频率为（0.57%），而在本次结果中突变频率高达20.69%（共在6个样品中检测到G突变为C），且该位点所检测到有突变的患者大都是46岁以下病人。该变异位点位于miRNA的种子区域中，可能会影响其与靶基因结合，并进一步影响其功能的发挥。
实施例2：miR-8078 wt对结直肠癌细胞活力的影响
1. 实验方法
采用Cell Titer实验方法检测miR-8078 wt转染后对细胞活力的影响。转染前一天将细胞接种于96孔板，5000个/孔，第二天将miR-8078 wt和阴性对照NC分别以终浓度为50nM的体系转染进细胞。采用Lipofectamine2000 (Thermo Fisher Cat# 11668019)脂质体和opti-MEM(Reduced Serum Medium)（life technologies Cat#31985-070）进行转染。转染后通过miR8078表达的检测，确认转染阳性并且是过表达。转染6-8小时后进行补加培养基100μl/well，转染24小时后更换培养基100μl/well，直到72小时后采用CellTiter2.0进行细胞活力检测；进行三次独立Cell Titer Assay细胞活力实验。
2. 实验结果
如图2(A)和（B）所示。
结果显示，HCT8和KM12细胞中转染miR-8078 wt后，这两种结直肠癌细胞的活力显著降低，说明miR-8078（SEQ ID NO: 3）能抑制结直肠癌细胞活力。
实施例3：miR-8078 wt在不同细胞系的表达情况
1. 实验方法
从液氮罐中取出结直肠癌细胞系（HCT1116, HCT8, KM12, SW480, SW620）和从ATCC购买的结直肠正常上皮细胞(NCM460)，置于42℃水浴快速融化进行复苏。分别用含10%胎牛血清、链霉素（100μg/ml）和盘尼西林（100μg/ml）的RPMI Medium1640（HCT8、NCM460）和DMEM（HCT116、KM12、SW480、SW620）的培养基中培养这些细胞，细胞生长在含5%二氧化碳的37℃培养箱中。细胞进行传代，用于收集的细胞培养在6厘米培养皿中，一次传4皿，其中1皿用于传代，另外3皿培养三天后进行收集于-80℃冰箱中用于RNA提取。所有的细胞均进行3次独立的收集。
细胞收集结束后分别从-80度各取出一皿加入1.8ml Trizol，在摇床上冰浴10分钟，吹打混匀并平分成三份吸到1.5ml离心管，其中一份用于RNA提取和检测miR-8078 wt的表达，另外两份冻存于-80℃备用。其中RNA提取方法如下：
(1)细胞铺于24孔细胞培养板，根据要求进行转染或者加药处理;(2)弃去细胞培养基，每孔细胞加入700 μl Trizol，用移液枪吹打3-5次，充***解细胞；(3)室温放置3-5分钟；(4)转移至新的1.5 ml离心管中，加入140 μl（1/5体积Trizol体积）氯仿；(5)涡旋震荡15s至充分均匀，静止2-3 min；(6)12000rpm 4℃ 离心15 min；(7)吸取透明水相至新的1.5 ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀；(8)-20℃静置至少30 min；(9)12000rpm 4℃ 离心15 min，沉淀RNA；(10)弃去上清，加入1 ml 75%乙醇，稍微颠倒离心管，12000rpm 4℃ 离心5 min，再重复一次；(11)弃去乙醇，小心吸弃残留液体，空气干燥10-15min。(12)加入无RNA酶水溶解RNA。
RNA提取后利用特异的反转录引物进行反转录成cDNA，将cDNA稀释10倍并进行定量PCR检测miR-8078 wt在不同细胞系中的表达（具体操作参照实施例4）。
2.实验结果
如图3所示。
结果显示，除了HCT116细胞表达上调外，与正常上皮细胞相比，其它结直肠癌细胞系中miR-8078 wt（SEQ ID NO: 3）的表达是下调且KM12细胞中下调最明显。
实施例4：miR-8078的潜在靶基因的mRNA表达水平研究
1. 实验方法
采用定量PCR实验筛选miR-8078作用的潜在靶基因。首先在KM12和HCT8细胞中过表达miR-8078 wt, 其次收取RNA，最后检测mRNA表达水平。具体步骤如下：
转染前一天，将细胞以50000个/孔的密度接种于12孔板，第二天将NC（阴性对照），miR-8078 wt以终浓度为50nM的体系转染细胞（转染方法参照实施例2），转染6-8小时后补加培养基至1ml，转染24小时后更换培养基1ml/well，直至转染72小时进行RNA样品收集。RNA样品利用Trizol试剂进行RNA提取并反转录成cDNA，最后采用定量PCR检测与增殖和凋亡相关潜在靶基因的mRNA表达水平。其中：
RNA提取：转染72小时后将细胞拿出，吸去培养基，用PBS (Thermo FisherC10010500BT )1ml/well洗涤后向每孔中加入500μl TRIzol试剂盒（life technologiesCat#15596018）摇匀，冰上摇15分钟，将每孔溶液吸如1.5ml无RNA酶的离心管中，再根据比例氯仿：TRIzol=1:5向每管中加入100μl氯仿震荡混匀室温静置2分钟，4℃ 12000rpm 离心15分钟，吸取上清部分到新的1.5ml离心管，然后加入与上清等体积的异丙醇混匀冰上静置1小时进行沉淀RNA。4℃ 12000rpm 离心15分钟，弃上清加入1ml/管75%无水乙醇4℃12000rpm 离心5分钟，弃上清加入1ml/管100%无水乙醇4℃ 12000rpm 离心5分钟，弃上清再4℃ 12000rpm 离心5分钟用10μl枪尖吸净无水乙醇，无菌超净台中晾10分钟，根据每管RNA的量加入对应量的无RNA酶的水溶解RNA，混匀利用微量分光光度计测量RNA浓度。
反转录（所有操作均在冰上进行）：根据上述RNA浓度采用cDNA Moloney MurineLeukemia Virus Reverse Transcriptase (Cat#M1705, Promega)进行cDNA合成:体系如下：
总体系：20μl
体系1: 10μl 体系2: 10μl
RNA(2μg): 2μl RNase-free H2O: 2
RNase-free H2O: 5μl 5×RT Buffer： 4
5uMmiR8078-RT Primer: 1μl dNTPs: 3.2
25mM Random: 1μl RNase Inhibitor: 0.4
10uM oligdT: 1μl M-MLV: 0.4
先将体系1在70℃反应5分钟，取出立即放冰上静置2分钟。然后将体系2的10μl体积加入体系1中混匀离心在Bio-Rad-C100仪器中进行PCR反应。温度体系如下：
RT-qPCR反应：将反转录结束后的cDNA稀释10倍即向20μl体系中各加入180μlRNase-free H2O混匀，然后采用SYBR Green Supermix (Cat#LS2062, Promega)试剂盒在Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR system中进行定量PCR。
体系：10μl
2×Mix: 5
Primers: 0.3
cDNA: 4.7
程序：
95℃ for 2:20，
95℃ for 0:10，
61℃ for 0:30，
70℃ for 0:01，
GOTO 2 – 40 more times
Melt Curve 70℃ to 94℃ increment 0.3℃for 0:05 END。
实验过程中涉及的潜在靶基因的引物序列如下：
miR8078RTPrimer:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGgAGTCTCTCAC （SEQID NO: 8）
miR8078-qF:ACACTGCAGCTGGTCTAGGCCCGGTGA （SEQ ID NO: 9）
miR8078-qR:CTCAACTGGTGTCGTGGAGT （SEQ ID NO: 10）
CDKN1A-3’UTRqF:TCCTGGCACTAACGTTGAGC （SEQ ID NO: 11）
CDKN1A-3’UTRqR:TGGAAGGTGTTTGGGGTCAG （SEQ ID NO: 12）
CDKN1B-3’UTRqF:CCAAAGTGGCATGTTTTGTGC （SEQ ID NO: 13）
CDKN1B-3’UTRqR:ACTTGGCTCAGTATGCAACCT （SEQ ID NO: 14）
LATS2-3’UTRqF:AGCAAGGTGATGATGTGGCT （SEQ ID NO: 15）
LATS2-3’UTRqR:ACCTGCTGTGAATGGCAAGA （SEQ ID NO: 16）
PDCD4-3’UTRqF:GCTGCTGTTGAGATACTGTGC （SEQ ID NO: 17）
PDCD4-3’UTRqR:TCCAGCCACCTTTTACTTAACTGT （SEQ ID NO: 18）
SCD-3’UTRqF:AGCAGCTGGTCAGTCTTTGC （SEQ ID NO: 19）
SCD-3’UTRqR:GCTCACAACAGCTCAAGGAA （SEQ ID NO: 20）
SCD-3’UTRqF1:GTGTGACCCTGGGCAAGT （SEQ ID NO: 21）
SCD-3’UTRqR1:GGCTAGTTATCCACCGCTTCTC （SEQ ID NO: 22）
SCD-ORFqF:CGATATGCTGTGGTGCTTA （SEQ ID NO: 23）
SCD-ORFqR:TGAAGAATGTGGTGAAGTTGA （SEQ ID NO: 24）
2. 实验结果
如图4所示。
结果显示，经miR-8078 mimics转染后，HCT8和KM12细胞系中的SCD的mRNA表达水平明显降低，HCT116细胞系中的SCD的mRNA表达水平基本持平，可初步认为SCD是潜在的靶基因，miR-8078可通过调控SCD来调控结直肠癌细胞的增殖。
实施例5：miR-8078的靶基因的蛋白表达水平研究
1. 实验方法
采用Western Blot实验筛选miR-8078作用的潜在靶基因。首先在KM12和HCT8细胞中过表达野生型和突变型miR-8078 mimics（与前面的实施例4操作相同），然后收取蛋白样品，最后检测蛋白表达水平。具体步骤如下：
转染前一天，将细胞以50000个/孔的密度接种于12孔板，第二天将NC(阴性对照)，野生型和突变型miR-8078 mimics分别以终浓度为50nM的体系转染细胞，转染6-8小时后补加培养基至1ml，转染24小时后更换培养基1ml/well，直至转染72小时进行蛋白样品收集。蛋白样品利用SDS-Loading 缓冲液裂解样品并在100度水浴中煮10分钟，混匀离心进行Western Blot实验检测潜在靶基因SCD的蛋白表达变化。
3. 实验结果
如图5所示。
结果显示，经野生型miR-8078 mimics转染后，不同细胞系中的SCD的表达水平相对下降；经突变型miR-8078 mimics转染后，不同细胞系中的SCD的表达水平比经野生型miR-8078 mimics转染后的细胞SCD表达水平高，进一步证明SCD是潜在的靶基因，miR-8078可通过调控SCD来调控结直肠癌细胞的增殖。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
<120> 结直肠癌生物标志物及其用途
<130> IDC200391
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccgctgtgtg gagtctctca ccgggcctag acctagaagg caggaatccc aggccggtca 60
gcccggtgga gggggcgggg cgga 84
<210> 2
<211> 84
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uccgccccgc ccccuccacc gggcugaccg gccugggauu ccugccuucu aggucuaggc 60
ccggugagag acuccacaca gcgg 84
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggucuaggcc cggugagaga cuc 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gagtctctca ccgggcctag acc 23
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggucuagacc cggugagaga cuc 23
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gguguaggcc cggugagaga cuc 23
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gguguagacc cggugagaga cuc 23
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggagt ctctcac 47
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acactgcagc tggtctaggc ccggtga 27
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcaactggt gtcgtggagt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctggcact aacgttgagc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggaaggtgt ttggggtcag 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaaagtggc atgttttgtg c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acttggctca gtatgcaacc t 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcaaggtga tgatgtggct 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acctgctgtg aatggcaaga 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctgctgttg agatactgtg c 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tccagccacc ttttacttaa ctgt 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agcagctggt cagtctttgc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctcacaaca gctcaaggaa 20
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<212> DNA
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<400> 21
gtgtgaccct gggcaagt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggctagttat ccaccgcttc tc 22
<210> 23
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<212> DNA
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<400> 23
cgatatgctg tggtgctta 19
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgaagaatgt ggtgaagttg a 21
Claims (9)
1.检测核酸分子的试剂在制备检测或诊断结直肠癌的试剂中的用途，其中，所述核酸分子包括如下的核酸分子：
（1）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第30位的G替换为C。
2.检测核酸分子组合的试剂在制备检测或诊断结直肠癌的试剂中的用途，其中，所述核酸分子组合包括如下的核酸分子：
（1）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第30位的G替换为C；
所述核酸分子组合还包含选自如下核酸分子（2）-（5）中的任意1种、2种、3种或者全部4种：
（2）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第15位的C替换为G；
（3）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第71位的G替换为T；
（4）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第50位的C替换为T；
（5）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第46位的A替换为T。
3.根据权利要求2所述的用途，所述核酸分子组合还包含选自如下核酸分子（6）-（11）中的任意1种、2种、3种、4种、5种或者全部6种：
（6）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第23位的G替换为C或A；
（7）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第45位的A替换为T；
（8）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第67位的T替换为G；
（9）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第59位的C替换为G；
（10）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第73位的G替换为A；
（11）核酸分子，其序列为将SEQ ID NO: 1所示序列的第43位的G替换为A。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中，如果所述核酸分子或所述核酸分子组合中的任意一种或者多种核酸分子检测结果为阳性，判断结直肠癌的风险较高。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述结直肠癌为早期结直肠癌。
6.根据权利要求4所述的用途，其中，所述结直肠癌为结肠癌和/或直肠癌。
7.根据权利要求4所述的用途，其中，被检测或被诊断的对象为55周岁以下的人。
8.根据权利要求4所述的用途，其中，被检测或被诊断的对象为50周岁以下的人。
9.根据权利要求4所述的用途，其中，被检测或被诊断的对象为47周岁以下的人。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Biliang Inventor after: Cheng Nan Inventor after: Ye Yidong Inventor after: Cheng Meidie Inventor before: Zhang Biliang Inventor before: Cheng Nan Inventor before: Ye Yidong |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |