CN113750255A - 环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用 - Google Patents
环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了环境响应型透明质酸‑鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用，分别为pH敏感的前药胶束和pH、还原双敏感的前药胶束。从透明质酸和鬼臼毒素为原料出发，首先用乙二胺或胱胺对透明质酸进行修饰合成胺基化的透明质酸，随后用丁二酸酐对鬼臼毒素进行羧基化处理，最后将胺基化的透明质酸和羧基化鬼臼毒素进行缩合反应获得聚合物前药。本发明所合成的前药可在水溶液自组装形成胶束，具有好的血液相容性，适用于静脉注射。本发明还提供上述前药胶束在药物递送中的应用，兼具可控的药物释放行为，对肿瘤细胞的靶向能力，好的抗肿瘤效果，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明公开了环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束及其制备方法和应用，属于新型透明质酸纳米药物载体技术领域。
背景技术
癌症已经成为严重危害人类健康的重大疾病之一，其发病率和死亡率都很高。化学药物治疗依旧是当前最为广泛应用的治疗手段。但是，现有的抗肿瘤药物对肿瘤细胞有较强杀伤作用的同时，也会对正常细胞造成严重损害，引起多重并发症，限制了抗肿瘤药物在临床上的应用与发展。目前，纳米颗粒的药物递送载体在癌症治疗中已经取得极大的进展，尤其是聚合物前药胶束。这些聚合物前药胶束可以被动的积累在肿瘤组织中，具有高的稳定性及延长的血液循环时间。然而，非特异性的靶向及在细胞内低的药物释放效率限制了他们的抗肿瘤效果。因此，开发具有特异性靶向的环境响应型前药胶束十分必要。基于pH和还原敏感的聚合物前药胶束依据肿瘤和正常细胞之间的pH值和谷胱甘肽(GSH)浓度存在明显差异可实现可控的药物传递及释放。
透明质酸(HA)是一种天然的高分子材料，可与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体特异性结合，无免疫原性，可以作为一种比较理想的药物输送载体。因此，基于透明质酸靶向的具有环境响应型的聚合物前药胶束能够实现药物在不同组织间的特异性分布，在达到高效给药目的同时降低药物对正常组织的损伤。
鬼臼毒素(PPT)是一种具有天然活性的木质素类化合物，可以有效抑制肿瘤细胞微管的组装，具有显著的抗肿瘤活性。然而，由于脱靶效应以及水溶性差等造成的严重毒副作用，限制了鬼臼毒素在肿瘤治疗中的应用。
本发明从透明质酸和鬼臼毒素为原料出发，合成了两种环境敏感的前药，分别为pH敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药(HA-NH-CO-PPT)及pH、还原双敏感的前药(HA-S-S-PPT)，可在水中自组装形成胶束，用于癌症治疗，为其他类似药物的递送及治疗提供了技术参考。
发明内容
本发明针对目前化疗药物鬼臼毒素水溶性差、非特异性积累及释放、严重的毒副作用等缺点，提供了环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT)及其制备方法和应用。本发明具有特异性靶向、可控释放药物及生物兼容性好等特点。
本发明的技术方案：
本发明的第一个目的在于提供环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT)的制备方法。
所述环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT)的制备方法，步骤如下：
(1)HA-NH2或HA-S-S-NH2的制备：将乙二胺或胱胺二盐酸盐溶在二甲基亚砜(DMSO)中，之后加入溶液1，在25℃下反应24-48小时。反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析，过滤，冻干，以获得HA-NH2或HA-S-S-NH2固体。
所述溶液1的制备方法为：将透明质酸(HA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在PBS溶液中，冰浴条件下反应1-2小时以活化HA的羧基，获得溶液1。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶在甲苯溶液中，在105-110℃条件下回流48-72小时，去除溶剂，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT的制备：将HA-NH2或HA-S-S-NH2固体溶在PBS溶液中，之后加入溶液2，在25℃下反应24-48小时。反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析，过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT固体。
所述溶液2的制备方法为：将PPT-COOH、EDC和NHS溶在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1-2小时，获得溶液2。
(4)HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT前药胶束的制备：将HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT固体溶解在超纯水中，超声处理10-20分钟，使其均匀分散，静置3-6小时，即得HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT前药胶束。
优选地，步骤(1)中，所述的HA分子量为3000-10000Da。
优选地，步骤(1)中，所述的HA、EDC和NHS的摩尔比为1:0.5:0.5-1:1:1；所述的HA与乙二胺的摩尔比为1:0.5-1:2；所述的HA与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:0.5-1:5。
优选地，步骤(2)中，所述的PPT、SA和DMAP的摩尔比为1:1:1-10:15:1。
优选地，步骤(2)中，去除溶剂的方法为：旋蒸并用无水甲醇洗涤。
优选地，步骤(3)中，所述的PPT-COOH、EDC和NHS摩尔比为1:0.5:0.5-1:1:1；所述的HA-NH2或HA-S-S-NH2和PPT-COOH摩尔比为1:0.5-1:30。
优选地，步骤(1)和(3)中，所述的PBS溶液的pH为8.0。
优选地，步骤(1)和(3)中，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析48-72小时，每3-12小时更换去离子水。
优选地，步骤(1)和(3)中，所述透析袋截留分子量为1000-2000Da。
优选地，所述的HA-NH-CO-PPT前药胶束为pH敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束，所述HA-S-S-PPT前药胶束为pH、还原双敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束。
具体地，当所述环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束为pH敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT)时，步骤如下：
(1)HA-NH2的制备：将透明质酸(HA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在pH为8.0的PBS溶液中，冰浴条件下反应1-2小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将乙二胺溶在二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24-48小时。反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析48-72小时，每3-12小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-NH2固体。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶在甲苯溶液中，在105-110℃条件下回流48-72小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-NH-CO-PPT的制备：将PPT-COOH、EDC和NHS溶在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1-2小时，获得溶液2。然后将HA-NH2溶在pH 8.0的PBS溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24-48小时。反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析48-72小时，每3-12小时更换去离子水。最后，过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT固体。
(4)HA-NH-CO-PPT前药胶束的制备：将HA-NH-CO-PPT溶解在超纯水中，超声处理10-20分钟，使其均匀分散，静置3-6小时，即得HA-NH-CO-PPT前药胶束。
当所述环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束为pH、还原双敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-S-S-PPT)时，步骤如下：
(1)HA-S-S-NH2的制备：将透明质酸(HA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在pH为8.0的PBS溶液中，冰浴条件下反应1-2小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将胱胺二盐酸盐溶在二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24-48小时。反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析48-72小时，每3-12小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-S-S-NH2固体。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶在甲苯溶液中，在105-110℃条件下回流48-72小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-S-S-PPT的制备：将PPT-COOH、EDC和NHS溶在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1-2小时，获得溶液2。然后将HA-S-S-NH2溶在pH 8.0的PBS溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24-48小时。反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析48-72小时，每3-12小时更换去离子水。最后，过滤、冻干，获得HA-S-S-PPT固体。
(4)HA-S-S-PPT前药胶束的制备：将HA-S-S-PPT溶解在超纯水中，超声处理10-20分钟，使其均匀分散，静置3-6小时，即得HA-S-S-PPT前药胶束。
本发明的第二个目的在于提供上述方法制备得到的环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT)。
本发明的第三个目的在于提供上述环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT)在制备治疗癌症药物中的应用，所述癌症为乳腺癌、肺癌或肝癌。
本发明制备的环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束，是从靶向材料透明质酸和抗癌药物鬼臼毒素出发，通过化学键连接合成两亲性的衍生物，能在水溶液中自组装形成粒径较小，且均一分散的胶束，提高了鬼臼毒素的水溶性和生物相容性，并能靶向到肿瘤组织中，pH敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-NH-CO-PPT)通过响应肿瘤微环境中低的pH而可控的释放药物，pH、还原双敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束(HA-S-S-PPT)通过响应肿瘤微环境中低的pH和高浓度的谷胱甘肽而控制释放药物，实现了高效的药物递送和强化的抗肿瘤效果。
本发明的有益效果：
本发明提供了两种环境敏感的靶向前药胶束的制备方法，分别为pH敏感的前药胶束和pH、还原双敏感的前药胶束。从透明质酸和鬼臼毒素为原料出发，首先用乙二胺或胱胺对透明质酸进行修饰合成胺基化的透明质酸(HA-NH2和HA-S-S-NH2)，随后用丁二酸酐对鬼臼毒素进行羧基化处理，最后将胺基化的透明质酸和羧基化鬼臼毒素进行缩合反应获得聚合物前药(HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT)。本发明所合成的前药可在水溶液自组装形成胶束，具有好的血液相容性，适用于静脉注射。本发明还提供上述HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束在药物递送中的应用，兼具可控的药物释放行为，对肿瘤细胞的靶向能力，好的抗肿瘤效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药的合成路线；
图2为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药的FT-IR谱图；
图3为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药的1HNMR谱图；
图4为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束的TEM照片；
图5a为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT前药胶束通过响应不同pH的粒径变化；
图5b为实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束通过响应不同pH和GSH的粒径变化；
图6为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束的体外释药行为；
图7为实施例2所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例6所制备的HA-S-S-PPT前药胶束的血液相容性；
图8为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束的靶向性；
图9为实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束的细胞毒性。
具体实施方式
下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
实施例1
(1)HA-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的乙二胺溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-NH2。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流48小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-NH-CO-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT。
(4)HA-NH-CO-PPT前药胶束的制备：取HA-NH-CO-PPT(1mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-NH-CO-PPT前药胶束。
实施例2
(1)HA-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的乙二胺溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-NH2。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流48小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-NH-CO-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT。
(4)HA-NH-CO-PPT前药胶束的制备：取HA-NH-CO-PPT(5mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-NH-CO-PPT前药胶束。
实施例3
(1)HA-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的乙二胺溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-NH2。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流72小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-NH-CO-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT。
(4)HA-NH-CO-PPT前药胶束的制备：取HA-NH-CO-PPT(1mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-NH-CO-PPT前药胶束。
实施例4
(1)HA-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的乙二胺溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-NH2。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流48小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-NH-CO-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应48小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT。
(4)HA-NH-CO-PPT前药胶束的制备：取HA-NH-CO-PPT(1mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-NH-CO-PPT前药胶束。
实施例5
(1)HA-S-S-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的胱胺二盐酸盐溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-S-S-NH2固体。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流48小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-S-S-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-S-S-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24小时。反应结束后将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-S-S-PPT固体。
(4)HA-S-S-PPT前药胶束的制备：取HA-S-S-PPT(1mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-S-S-PPT前药胶束。
实施例6
(1)HA-S-S-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的胱胺二盐酸盐溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-S-S-NH2固体。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流48小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-S-S-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-S-S-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-S-S-PPT固体。
(4)HA-S-S-PPT前药胶束的制备：取HA-S-S-PPT(5mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-S-S-PPT前药胶束。
实施例7
(1)HA-S-S-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的胱胺二盐酸盐溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-S-S-NH2固体。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流72小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-S-S-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-S-S-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应24小时。反应结束后将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-S-S-PPT固体。
(4)HA-S-S-PPT前药胶束的制备：取HA-S-S-PPT(1mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-S-S-PPT前药胶束。
实施例8
(1)HA-S-S-NH2的制备：将分子量为3000-10000Da的透明质酸(HA，400mg，相当于1054μmol的COOH基团)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按摩尔比1：1：1溶解在pH为8.0的PBS溶液(5mL)中，冰浴条件下反应1小时以活化HA的羧基，获得溶液1。然后，将与HA等摩尔量的胱胺二盐酸盐溶在5mL二甲基亚砜(DMSO)中后加入上述溶液1，在25℃下反应24小时。反应结束后，将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。最后，将溶液过滤，冻干以获得HA-S-S-NH2固体。
(2)PPT-COOH的制备：将琥珀酸酐(SA，1.5mmol)、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)按摩尔比15：10：1溶在20mL甲苯中，在110℃条件下回流48小时，旋蒸并用无水甲醇洗涤，真空干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)。
(3)HA-S-S-PPT的制备：将PPT-COOH(200μmol)、EDC和NHS按摩尔比1：1：1溶在5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰浴条件下反应1小时，获得溶液2。然后将与PPT-COOH等摩尔量的HA-S-S-NH2溶在5mL的PBS(pH 8.0)溶液中后加入上述溶液2中，在25℃下反应48小时。反应结束后将所得混合物用去离子水透析(MWCO 2000)72小时，每6小时更换去离子水。过滤、冻干，获得HA-S-S-PPT固体。
(4)HA-S-S-PPT前药胶束的制备：取HA-S-S-PPT(1mg)溶解在超纯水(1mL)中，超声处理10分钟，使其均匀分散，静置3小时，即得HA-S-S-PPT前药胶束。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药的红外表征
将实施例1制得的HA-NH-CO-PPT或实施例5制得的HA-S-S-PPT前药(1-2mg)与溴化钾固体粉末(100-200mg)混合研磨均匀、压片，在4000–500cm-1范围内扫描并进行红外表征。图2是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药的红外谱图，在1710cm-1处出现酯键(-CO-O-)的特征信号峰，1650cm-1及1560cm-1处为酰胺键的特征信号峰(-NH-CO-)，表明合成目标产物。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药的核磁表征
将实施例1中制得的HA-NH-CO-PPT或实施例5制得的HA-S-S-PPT前药(5mg)溶在氘代水(0.5mL)进行核磁氢谱表征。
图3是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药的核磁氢谱，在化学位移2.76处的信号峰(对应于7)属于乙二胺(-CH2-NH-CO-)亚甲基的信号峰，表明乙二胺接枝到HA上。化学位移5.8～6.8(对应于2-6)归属于PPT苯环上的氢信号峰，证明在获得的HA-NH-CO-PPT中存在PPT。同理，对于HA-S-S-PPT，除了出现化学位移5.8～6.8的PPT苯环上的氢的信号峰，在7号位为胱胺(-CH2-S-S-)上CH2的信号峰，在获得的HA-S-S-PPT中成功引入了PPT。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药的形貌表征
将实施例1制得的HA-NH-CO-PPT和实施例5制得的HA-S-S-PPT前药胶束，用透射电镜表征形貌及粒径。
图4是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束的透射电镜图，HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束基本呈球形或者椭球形。
HA-NH-CO-PPT前药胶束的pH敏感
将实施例1中制得的HA-NH-CO-PPT前药胶束(1mg/mL)分别在pH 7.4、pH 5.0PBS中孵育0、4、8和12小时后使用纳米粒度分析仪测量样品的粒径分布。
图5a是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT前药胶束通过响应不同pH的粒径变化，在pH 7.4时没有观察到HA-NH-CO-PPT前药胶束大小的明显变化，而在pH 5.0时，HA-NH-CO-PPT前药胶束的粒径逐渐增加(从148.2nm到506.9nm)。表明HA-NH-CO-PPT前药胶束具有pH敏感性。
HA-S-S-PPT前药胶束的pH、还原双敏感
将实施例5中制得的HA-S-S-PPT前药胶束(1mg/mL)分别在pH 7.4、pH 7.4+谷胱甘肽(GSH，20mM)、pH 5.0和pH 5.0+谷胱甘肽(GSH，20mM)的PBS孵育0、4、8和12小时后测量样品的粒径分布。
图5b是HA-S-S-PPT前药胶束通过响应不同pH和GSH的粒径变化，在pH 7.4时粒径没有明显的变化，而在pH 5.0时粒径逐渐增加(从93.0nm到454.7nm)；尤其在pH 5.0且有20mM GSH存在下粒径显著增大(从96.2nm到837.1nm)，表明HA-S-S-PPT前药胶束具有pH、还原双敏感性。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束的释药行为
使用透析方法研究实施例1制得的HA-NH-CO-PPT和实施例5制得的HA-S-S-PPT前药胶束的释放行为。将2mL HA-NH-CO-PPT前药胶束加入透析袋(截留分子量为2000Da)中，然后将透析袋浸入50mLpH 5.0和pH 7.4的PBS离心管中。类似地，将2mL HA-S-S-PPT前药胶束加入透析袋(截留分子量为2000Da)中，然后将透析袋浸入50mLPBS(pH 5.0、pH 5.0+20mMGSH、pH 7.4及pH 7.4+20mM GSH)离心管中。然后放置于恒温摇床中，振荡速度为200r/min，温度控制在37℃。在1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h和72h时，从释放介质中取出2.0mL液体并用2.0mL相应pH的PBS替换以维持体积不变。用紫外分光光度计测量释放到PBS溶液中的鬼臼毒素的浓度。
图6是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束释药曲线，对于HA-NH-CO-PPT胶束，在pH 7.4下孵育72h后，只有不到25.6％的PPT缓慢释放，而在pH 5.0下孵育72h后累积释放量增加至53.6％。对于HA-S-S-PPT胶束，在pH 7.4下孵育时，仅21.7％的PPT释放，当pH值为5.0时，PPT累积释放量从增加到66.2％，尤其在pH 5.0的PBS中加入20mM GSH时，PPT的累积释放显著增加到86.7％。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束的溶血评估
首先对新鲜的小鼠血浆进行脱纤维处理，取2mL的小鼠血液，用玻璃棒沿顺时针方向轻轻搅拌15min，除去血液中的纤维蛋白。然后加入8mL的PBS溶液，放入离心机中，以2500r/min离心10min,。撇去上清液，重复离心三次至上清液无色，得到血红细胞悬浮液。用PBS稀释该细胞悬浮液，旋涡振荡5min使悬液混合均匀，获得浓度约5％(v/v)的红细胞悬浮液。将红细胞悬浮液分别与5mg/mL的HA-NH-CO-PPT、HA-S-S-PPT前药胶束、吐温80溶液混合，使混合物中两类前药胶束或吐温80的最终浓度范围为0.1至2mg/mL(分别为0.1、0.25、0.5、1、2mg/mL)。同时取1mL的红细胞悬液分别和超纯水、PBS等量混合作为阳性和阴性对照。在37℃恒温摇床上孵育4h和12h后，以2500r/min离心10min。用酶标仪检测上清液在541nm处的吸光度，使用以下等式计算溶血程度：
其中Atest，Aneg，Apos分别是样品，阴性对照(PBS)和阳性对照(水)的吸光度值。
图7是实施例2所制备的HA-NH-CO-PPT、实施例6所制备的HA-S-S-PPT前药胶束和Tween 80的溶血率，当浓度从0.1增加到2.0mg/mL时，吐温80诱导的溶血率从10.48％显著增加到72.33％。然而，HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束在相同浓度下表现出不超过5％的溶血率，其结果明显低于吐温80，这说明所制备的胶束具有好的血液相容性。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束的靶向性评估
将人类乳腺癌细胞(MCF-7)以每孔6×104的细胞密度接种在12孔板上，孵育24h后，观察细胞约占瓶壁80％。加入10mg/mL透明质酸(分子量为3000-10000Da)培养2h，以不加透明质酸处理的作为对照。之后移去培养基(DMEM)，分别加入新鲜含5μg/mL实施例1制得的HA-NH-CO-PPT、实施例5制得的HA-S-S-PPT前药胶束的DMEM，继续培养4h。用1×PBS(pH7.4)洗涤细胞三次，通过胰蛋白酶消化，吹打并收集细胞，过筛。选择流式细胞仪进行检测。
图8是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT、HA-S-S-PPT前药胶束的细胞靶向性研究，细胞摄取率分别从93.7和97.4％降低到32.4％和30.7％，表明HA介导的特异性内吞作用。
HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束的细胞毒性
通过CCK-8法测定实施例1制得的HA-NH-CO-PPT和实施例5制得的HA-S-S-PPT前药胶束对人类乳腺癌细胞(MCF-7)的毒性。在96孔细胞培养板上种植细胞，平行5个孔，每孔种植5×104个细胞，在37℃，5％CO2细胞培养箱中培养至细胞密度达到80％以上。移去DMEM，分别加入新鲜含0.01、0.1、1、2、4、5、10和20μg/mL实施例1制得的HA-NH-CO-PPT和实施例5制得的HA-S-S-PPT前药胶束的DMEM，培养72h。加入10μL的CCK-8试剂，孵育1h，移至酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。计算细胞存活率(实验组的吸光度值占对照组吸光度值的百分比)。
图9是实施例1所制备的HA-NH-CO-PPT和实施例5所制备的HA-S-S-PPT前药胶束对MCF-7细胞的毒性，与游离PPT相比，HA-NH-CO-PPT和HA-S-S-PPT前药胶束显示出对MCF-7细胞更好的抑制效果，尤其HA-S-S-PPT前药胶束的抑制效果最好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.环境响应型透明质酸-鬼臼毒素的前药胶束的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将乙二胺或胱胺二盐酸盐溶在二甲基亚砜中，之后加入溶液1，在25℃下反应24-48小时；反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析，再过滤、冻干，获得HA-NH2或HA-S-S-NH2固体；
所述溶液1的制备方法为：将透明质酸(HA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在PBS溶液中，冰浴条件下反应1-2小时，获得溶液1；
(2)将琥珀酸酐、鬼臼毒素(PPT)和4-二甲氨基吡啶溶在甲苯中，在105-110℃条件下回流48-72小时，去除溶剂，干燥，获得羧基化的PPT固体(PPT-COOH)；
(3)将HA-NH2或HA-S-S-NH2固体溶在PBS溶液中，之后加入溶液2，在25℃下反应24-48小时；反应结束后，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析，再过滤、冻干，获得HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PP固体；
所述溶液2的制备方法为：将PPT-COOH、EDC和NHS溶在N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴条件下反应1-2小时，获得溶液2；
(4)将HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PP固体溶解在超纯水中，超声处理10-20分钟，静置3-6小时，即得HA-NH-CO-PPT或HA-S-S-PPT前药胶束。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的HA分子量为3000-10000Da；步骤(1)和(3)中，所述的PBS溶液的pH为8.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(3)中，将所得混合物放入透析袋中用去离子水透析48-72小时，每3-12小时更换去离子水；所述透析袋的截留分子量为1000-2000Da。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的HA、EDC和NHS的摩尔比为1:0.5:0.5-1:1:1；所述的HA与乙二胺的摩尔比为1:0.5-1:2；所述的HA与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:0.5-1:5。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PPT、SA和DMAP的摩尔比为1:1:1-10:15:1。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的PPT-COOH、EDC和NHS摩尔比为1:0.5:0.5-1:1:1；所述的HA-NH2或HA-S-S-NH2和PPT-COOH摩尔比为1:0.5-1:30。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的HA-NH-CO-PPT前药胶束为pH敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束，所述的HA-S-S-PPT前药胶束为pH、还原双敏感的透明质酸-鬼臼毒素前药胶束。
8.权利要求1-7中任意一项所述的方法制备得到的环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束。
9.权利要求8所述的环境响应型透明质酸-鬼臼毒素前药胶束在制备治疗癌症药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、肺癌或肝癌。
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| GR01 | Patent grant | ||
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